Glycopeptid-Capture für Zelloberflächen Proteomics

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Anreicherung von Proteinen der Zelloberflächenmembran mit geringer Abundanz. Dies wird erreicht, indem zunächst Membranproteine denaturiert und verdaut werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Glykane zu oxidieren und die glykosylierten Peptide auf einer Harzoberfläche einzufangen.

Die Nicht-Glykopeptide werden dann vom Harz abgewaschen. Der letzte Schritt ist die Freisetzung der N-verknüpften Glykopeptide aus dem Harz für die lc-MS-Analyse. Letztendlich kann die identifizierte Peptidsequenz zu Identifizierungs- und Quantifizierungszwecken auf Proteine zurückgeführt werden.

Heute zeige ich Ihnen, wie die Geico-Peptid-Capture-Methode funktioniert. Der Hauptvorteil dieser Überdosierung von Überdosierungen, wie z. B. der Glykoproteineinfang, besteht darin, dass das Membranprotein zuerst verdaut wird und die Einfangung des Glykopeptids in einem Gefäß durchgeführt werden kann. Die Anwendung dieser Technik kann sich auf die Entdeckung des Krankheitsbiomarkers erstrecken.

Da das Alligatorprotein im Blut und in anderen Körperflüssigkeiten ausgeschieden werden kann, können die zirkulierenden Glykoproteine im Blut, die spezifisch für den pathologischen Prozess sind, als Biomarker für Prognose und Diagnose verwendet werden. Bereiten Sie zunächst vier Milliliter hypotonen Puffer mit einem bis 100 Proteasehemmer-Cocktail vor. Geben Sie einen Milliliter hypotonen Puffer auf ein Zellpellet, das etwa 10 bis acht Zellen enthält, und inkubieren Sie die Mischung 15 bis 30 Minuten lang. Übertragen Sie die Zellen auf Eis in ein Zwei-Milliliter-Fläschchen und verlosen Sie die Zellen, indem Sie die Probe fünf- bis zehnmal durch eine Spritzennadel führen.

Verwenden Sie dann ein Hämozytometer und eine Trianblau-Färbung. Um die Effizienz der Lyse zu überprüfen, kombinieren Sie das eine Milliliter Lysat mit drei Millilitern übrig gebliebenem hypotonischem Puffer. Drehen Sie die Röhre bei 3000 mal G bei vier Grad Celsius für 15 Minuten.

Füllen Sie den Überstand in ein Ultrazentrifugenröhrchen um und lagern Sie das Pellet in einem Gefrierschrank mit minus 80 Grad Celsius. Drehen Sie das Ultrazentrifugenröhrchen zwei Stunden lang bei 100.000 Mal G bei vier Grad Celsius. Als nächstes lösen Sie die mikrosomale Fraktion in 200 Mikrolitern Denaturierungspuffer auf und kochen Sie die Lösung dann 10 Minuten lang bei 100 Grad Celsius.

Nachdem Sie die erhitzte Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt haben, fügen Sie ultrahochreines Harnstoffpulver hinzu, um eine Endkonzentration von acht molaren zu erhalten, und inkubieren Sie die Probe 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation 500 Millimolar hinzufügen. I oto Acetamid-Stammlösung in die Probe, um eine Endkonzentration von 15 mmmolar zu erhalten.

Dann inkubieren Sie die Lösung 30 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur, um die freien Thiole in der Probe zu alkylieren. Anschließend wird der Probe eine molare DTT-Stammlösung zugegeben, um eine Endkonzentration von 10 Millimolar zu erhalten, und die Lösung weitere 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Um das überschüssige I oto Acetamid abzuschrecken, verdünnen Sie die erhaltene Lösung 10-mal mit 40 Millimolar Tris-Puffer bei PH acht und fügen Sie anschließend Trypsin der Probe in einem Verhältnis von eins zu 20 von Trypsin zur Gesamtproteinmenge hinzu.

Ermitteln Sie die Menge des Gesamtproteins mit dem Bradford-Assay. Halten Sie die Aufschlussreaktion über Nacht in einem 37 Grad Celsius heißen Ofen aufrecht, um sicherzustellen, dass die Reaktion abgeschlossen ist. Wenn Sie fertig sind, beenden Sie den Aufschluss, indem Sie die Probenlösung mit 10 Millimolarsäure auf pH eins ansäuern, ein Zustand, der sich auch am schnellsten abbaut.

Am schnellsten zersetzt sich das Waschmittel dann bei 37 Grad Celsius für eine Stunde in einem Inkubator. Nach der Inkubation wird die entstandene Ausfällung durch Zentrifugation nach der Zentrifugation entfernt. Reinigen Sie das SUP-Natin, das die Probenpeptide enthält, mit einer C 18-Festphasenextraktionskartusche und trocknen Sie die erhaltene Probe mit Speed Vac.

Führen Sie eine SDS-Seitenanalyse der Proben vor und nach den Trips und dem Aufschluss durch, um die Aufschlusseffizienz zu bestätigen. Lösen Sie zu diesem Zeitpunkt die gereinigten Peptide in 200 Mikrolitern Kupplungspuffer auf. Nach Zugabe von Natriumpuriat zur Peptidlösung eine Endkonzentration von 10 Millimolar erhalten.

Inkubieren Sie die Probe 30 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur. Wenn die Inkubation abgeschlossen ist, schrecken Sie das überschüssige Prat mit Natriumsulfit ab, um eine Endkonzentration von 20 Millimolar und einen pH-Wert von fünf zu erhalten. Nach einer Inkubation von 10 Minuten bei Raumtemperatur werden 200 Mikroliter Hydrozytderivat-Harzlösung, pree-equilibriert und Puffer in die Peptidlösung gegeben. Inkubieren Sie die Reaktion ein bis zwei Tage lang bei 37 Grad Celsius mit End-to-End-Rotation, um eine vollständige Kopplung zu gewährleisten. Wenn Sie fertig sind, entfernen Sie die ungebundenen Peptide, indem Sie das Harz zweimal mit einem Milliliter deionisiertem Wasser, einem Milliliter 1,5 molar Natriumchlorid, einem Milliliter Methanol und einem Milliliter 80% Acetonitril waschen.

Als nächstes sammeln Sie den Überstand und die Waschungen für die Analyse der ungebundenen Peptide. Lagern Sie die Proben bis zur Analyse in einem Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius. Waschen Sie dann das Harz dreimal mit einem Milliliter 100 Millimolar Ammoniumbicarbonat bei pH acht.

Zum Schluss geben Sie 300 Mikroliter Ammoniumbicarbonat in das Probenfläschchen. Um die N-Glykopeptide aus dem Harz freizusetzen. Fügen Sie PNG ACE F hinzu und inkubieren Sie die Probe bei 37 Grad Celsius mit einer End-to-End-Rotation.

Sammeln Sie anschließend die freigesetzten Peptide durch Zentrifugation und waschen Sie das Harz mit einem Milliliter 80%igem Acetylnitril. Kombinieren Sie die Wäsche mit der zuvor gesammelten Wäsche. Abschließend wird die erhaltene Lösung in der Drehzahl VAC für die lc MS-Analyse getrocknet.

Das atypische Glykopeptidspektrum, das nach dem Anreicherungsverfahren entnommen wurde, ist hier in dem erhaltenen Glykopeptid dargestellt. Das n-Glykan wurde entfernt und das an Glykan angehängte Verunglimpfung wurde durch P-N-G-A-F in eine Spartinsäure umgewandelt. Daher kann das Spektrum von jeder proteomischen Suchmaschine leicht mit gängigen Proteinsequenzdatenbanken abgeglichen werden.

Atypische lc MS. Das Ergebnis der eingefangenen n Glykopeptide ist hier dargestellt, in dem mehr als 100 Glykoproteine aus einem einzigen lc MS-Lauf einer mikrosomalen Zellfraktion identifiziert werden können. Die Anreicherungsselektivität sowohl für Glykoproteine als auch für Glykopeptide beträgt im Allgemeinen mehr als 90 %Eine erfolgreiche Analyse kann eine Anreicherungsselektivität von 95 % aufweisen, wobei eine SCX-Säule und ein Stufengradient zur weiteren Fraktionierung verwendet werden. Die Proben vor der LCMS-Analyse verdoppeln in der Regel die Anzahl der Glykoprotein-Identifikationen.

Manchmal, wenn die Menge der erhaltenen Glykopeptide gering ist, kann die aus den Fläschchen angesammelte Verunreinigung in der Endprobe beobachtet werden. Diese Verunreinigungen können durch eine MCX-Säule entfernt werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, hoffe ich, dass Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie unsere Glykopeptid-Capture-Methoden zur Untersuchung von Selbstbedienungsmembranproteinen verwenden können.

Während Sie dieses Protokoll ausprobieren, ist es auch wichtig, für jeden Schritt Stichproben für die Problembehandlung bereitzustellen. Das Volumen des Reagenzes kann auch für Ihre spezifische Studie optimiert werden.