Montage von molekularen Shuttles Powered by reversibel befestigt Kinesine
26. Januar 2019
Wir präsentieren ein Protokoll zur molekularen Shuttles zu bauen wo treiben Motorproteine Kinesin Oberfläche eingehalten Farbstoff-markierten Mikrotubuli. Schwachen Wechselwirkungen die Kinesine mit der Oberfläche ermöglicht ihre reversible Bindung. Dadurch entsteht ein Nano-System das dynamische Montage und Demontage der Komponenten unter Beibehaltung seiner Funktionalität aufweist.
Dieses Protokoll ist von Bedeutung, weil es die Tür für weitere Untersuchungen bei der Entwicklung nanoskaliger biologischer Systeme öffnet, die sich im dynamischen Gleichgewicht befinden. Diese Technik füllt einen Teil der Lücke zwischen technischen und natürlichen Strukturen, weil sie das Studium dessen ermöglicht, was wir selbstheilend nennen könnten, oder den dynamischen Ersatz molekularer Komponenten. Der wichtigste Rat, diese Technik zum ersten Mal auszuprobieren, ist sicherzustellen, dass der Experimentator alle Sicherheitsprotokolle befolgt.
Bereiten Sie zunächst die Bestandslösungen wie im Textprotokoll beschrieben vor. Pipette 21,8 Mikroliter BRB80 Puffer in ein kleines Mikrozentrifugenrohr. Fügen Sie 1 Mikroliter der Magnesiumchlorid-Stammlösung, 1 Mikroliter der GTP-Lagerlösung und 1,2 Mikroliter der DMSO-Lagerlösung hinzu, um die Vorbereitung des Mikrotubuli-Wachstumspuffers abzuschließen.
Um mit der Mikrotubuli-Polymerisation zu beginnen, fügen Sie 6,25 Mikroliter Mikrotubuli-Wachstumspuffer direkt in ein 20-Mikrogramm-Aliquot aus lyophilisiertem Tubulin ein; mit 647 Nanometern angeregt. Vortex bei 40 RPS für 5 Sekunden. Kühlen Sie das Aliquot auf Eis für 5 Minuten.
Dann bei 37 Grad Celsius für 45 Minuten inkubieren. Um mit der Mikrotubuli-Stabilisierung zu beginnen, fügen Sie 5 Mikroliter der aliquotedn Paclitaxel-Lösung zu 490 Mikroliter BRB80 Puffer hinzu. Wirbeln Sie die Lösung bei 30 RPS für 10 Sekunden.
Sobald die 45 Minuten inkubationsweise für die Mikrotubuli nach oben sind, fügen Sie 5 Mikroliter dieser Lösung in das BRB80 und das Paclitaxel-Gemisch ein, um die MT100-Lösung zu erstellen. Fügen Sie zunächst 9,0 Mikroliter der aliquotedn Casein-Lösung zu 291 Mikroliter BRB80-Puffer hinzu. Pipette 83 Mikroliter der BRB80-Casein-Lösung in ein neues 6-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr.
Fügen Sie 1 Mikroliter D-Glucose, Glukoseoxidase, Kataalase, DTT, Kreatinphosphat und Phosphokinase hinzu. Fügen Sie dann 1 Mikroliter der ATP-Lösung in die Motilitätslösung ein. Flick, oder wirbeln die Aliquot, um homogen die Chemikalien zu verteilen.
Als nächstes fügen Sie 1 Mikroliter vorbereitete Kinesinlösung in die Motilitätslösung, so dass die endige Konzentration 20 Nanomolar beträgt. Fügen Sie 10 Mikroliter der MT100-Lösung in die Motilitätslösung ein. Verwenden Sie für Durchflusszellen sowohl einen großen Undrutsch als auch einen kleinen Deckschzettel.
Spülen Sie alle Abdeckungen zweimal mit Ethanol und zweimal mit Reinstwasser. Beschallen Sie die gewaschenen Deckelinlips in Reinstwasser für 5 Minuten. Dann trocknen Sie die Deckel in einem Ofen bei einer Temperatur zwischen 50 und 75 Grad Celsius.
Verwenden Sie einen UV-Ozonreiniger, um eine Seite jedes Deckels für 15 Minuten bei Raumtemperatur und unter normalen atmosphärischen Bedingungen zu behandeln. Mit einer Pinzette kippen Sie jeden Deckelund und verwenden UV-Ozon, um auch die unbehandelte Seite zu behandeln. Die behandelten Abdeckungen in Reinstwasser 5 Minuten lang beschallen.
Dann trocknen Sie sie im Ofen bei einer Temperatur zwischen 50 und 75 Grad Celsius. Als nächstes, don Schutzausrüstung, wie im Textprotokoll beschrieben. Tauchen Sie jeden Coverslip für 15 Sekunden in die Saline-Lösung ein.
Waschen Sie die Deckel zweimal in Toluin und dreimal in Methanol. Verwenden Sie druckbedruckten Stickstoff, um die Abdeckungen zu trocknen. Sobald die Abdeckungen trocken sind, schneiden Sie ein Stück doppelseitiges Klebeband, das 2 Zentimeter mal 2,5 Zentimeter groß ist.
Schneiden Sie dieses Stück in zwei 1 Zentimeter mal 2,5 Zentimeter Streifen halbieren. Legen Sie den großen Deckelrutsch auf einen filigranen Aufgabenwischer und kleben Sie die Bandstreifen darauf, längenweise entlang der Ränder, um eine Fläche von 1 Zentimeter mal 2,5 Zentimeter zwischen den Klebestücken zu schaffen. Kleben Sie den kleinen Deckelschlupf auf die Bandstreifen, um die Durchflusszellenbaugruppe zu beenden.
Zuerst fließen ca. 20 Mikroliter der PEG-PPG-PEG-Lösung in die montierte Durchflusszelle. Lassen Sie die Lösung auf der Oberfläche für 5 Minuten absorbieren, dann tauschen Sie diese Lösung mit 20 Mikroliter BRB80 Puffer dreimal durch Einfließen des Puffers in. Fließen Sie 20 Mikroliter der Motilitätslösung in die Durchflusszelle.
Danach die Ränder der Durchflusszelle mit Fett versiegeln, um verdunsten zu verhindern, wenn das geplante Experiment länger als eine Stunde dauert. Führen Sie die Bildgebung mit einer objektiven internen Blütenfloreszenzmikroskopie durch. Legen Sie einen Tropfen Tauchöl auf das Ziel.
Legen Sie als Nächstes die Durchflusszelle auf die Mikroskopplattform. Und bringen Sie das Ziel bis es Kontakt zwischen dem Öl auf dem Ziel und der Durchflusszelle. Verwenden Sie das Verriegelungsabdeckungssystem des Mikroskops, um das Entweichen des gesamten Laserlichts zu verhindern.
Schalten Sie dann den Laser ein und fokussieren Sie sich auf die untere Oberfläche der Durchflusszelle mit einem 642 Nanometer-Laser, um die Mikrotubuli abzubilden, und einem 488-Nanometer-Laser, um die GFP-Kinesinmotoren abzubilden. Nehmen Sie die Bilder oder Videos von Interesse auf. Bilder können aufgezeichnet werden, solange es Beweglichkeit in der Durchflusszelle gibt.
In dieser Studie wird ein aktives nanoskaliges System vorgestellt, das schwach bindende Bausteine selbst zusammensetzt, um eine eigene Spur zu konstruieren. Mittels Tirf-Mikroskopie werden gligende Mikrotubuli getrennt von den Kinesinmotoren abgebildet. Mikrotubuli sind bei Anregung mit einem 647 Nanometer Laser sichtbar.
Und die GFP-Kinesin sind sichtbar, wenn sie mit einem 488 Nanometer Laser angeregt wird. Die Zeit zwischen Erregung und rot-grünem Licht betrug weniger als eine Sekunde. Wie man sieht, akkumulieren gleitende Mikrotubuli Kinesinmotoren aus lösungsweise und legen sie auf der Oberfläche ab.
Die Kinesinmotoren bleiben für kurze Zeit im Gefolge der Mikrotubuli, bevor sie zur Lösung zurückkehren. Es ist sehr wichtig, die richtige Konzentration von Reagenzien in der Antifade der Motilitätslösung zu haben, da sonst photobleichen das Experiment zum Scheitern bringen würde. Diese Technik ebnet den Weg für einen effizienteren Einsatz von Proteinmotoren in nanoskaligen Ingenieursystemen.
So ermöglicht die Entwicklung und Untersuchung komplexerer Nanostrukturen.
Übersicht
Diese Studie stellt ein Protokoll zur Herstellung molekularer Transporteinheiten unter Verwendung von Kinesin-Motorproteinen vor, die mit Farbstoff markierte Mikrotubuli antreiben. Das System ermöglicht eine dynamische Assemblierung und Disassemblierung, während die Funktionalität erhalten bleibt.
Wesentliche Studienbestandteile
Bereich der Wissenschaft
- Biophysik
- Nanotechnologie
- Zellbiologie
Hintergrund
- Molekulare Transporter sind entscheidend für das Verständnis von biologischen Systemen im Nanomaßstab.
- Kinesin-Motoren ermöglichen die Bewegung von Mikrotubuli in zellulären Prozessen.
- Ein dynamisches Gleichgewicht in nanoskaligen Systemen kann zu selbstheilenden Eigenschaften führen.
- Sicherheitsprotokolle sind entscheidend für die Durchführung von Experimenten mit diesen Komponenten.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer Methode zur Untersuchung nanoskaliger Systeme im dynamischen Gleichgewicht.
- Überbrückung der Kluft zwischen technisch hergestellten und natürlichen biologischen Strukturen.
- Untersuchung der Selbstorganisation und Beweglichkeit von Mikrotubuli, die von Kinesin-Motoren angetrieben werden.
Verwendete Methoden
- Herstellung von Mikrotubuli-Wachstums-Puffer und Stabilisierungslösungen.
- Montage von Durchflusskammern unter Verwendung behandelte Deckgläser.
- Bildgebung mittels totaler interner Fluoreszenzmikroskopie.
- Aufzeichnung der Beweglichkeit von Mikrotubuli und Kinesin-Motoren.
Hauptergebnisse
- Die Mikrotubuli wurden erfolgreich abgebildet und zeigten eine Ansammlung von Kinesin-Motoren.
- Das System zeigte eine dynamische Assemblierung und Disassemblierung der Komponenten.
- Korrekte Reagenzkonzentrationen waren entscheidend, um eine Photo-Bleaching zu verhindern.
- Die Technik ermöglicht die Entwicklung komplexerer Nanostrukturen.
Schlussfolgerungen
- Dieses Protokoll erleichtert die Untersuchung nanoskaliger Systeme mit dynamischen Eigenschaften.
- Es vertieft das Verständnis molekularer Wechselwirkungen in technisch gestalteten Systemen.
- Die Ergebnisse bereiten den Weg für zukünftige Forschungen in Nanotechnologie und Biophysik.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Dieses Protokoll ermöglicht die Untersuchung dynamischer nanoskaliger Systeme, bei denen sich molekulare Komponenten im Gleichgewicht selbständig zusammenfügen und wieder trennen, und bietet ein Modell für die mechanistische Risikominderung bei der frühen Zielvalidierung. Durch die Nachahmung biologischen Transports mit reversibel angebundenen Motorproteinen unterstützt es eine vorhersagbare Zuverlässigkeit in Screening-Assays, die eine anhaltende, reproduzierbare Beweglichkeit erfordern. Das System stellt eine krankheitsrelevante Plattform zur Bewertung der Wirkung von Verbindungen auf die Dynamik des Cytoskeletts bereit, ohne dass eine dauerhafte Immobilisierung erforderlich ist.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung der Funktion von Motorproteinen und der Dynamik ihrer Wechselwirkung mit Mikrotubuli unter nahezu physiologischen Bedingungen.
- Operativer Wert: Unterstützt die umkehrbare, erneuerbare Assemblierung aktiver Komplexe für wiederholte Testzyklen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht eine quantitative Auswertung des Mikrotubuli-Gleitens und der Motorrekruitment mittels TIRF-Mikroskopie.
- Operativer Wert: Erlaubt die Echtzeit-Detektion von sowohl Fracht- als auch Motorproteinen mit Markierung im selben Assay.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Modelliert zytoskelettale Transportmechanismen, die für neurodegenerative und proliferative Krankheitswege relevant sind.
- Operativer Wert: Ermöglicht die Beurteilung von durch Verbindungen hervorgerufenen Veränderungen in der Motilität und in der Kinetik der Motordetachierung.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode passt in frühe Entdeckungsworkflows, bei denen die Zielinteraktion und funktionelle Nachweismethoden vor der Optimierung der Leitsubstanz priorisiert werden.
- Entdeckungsbiochemie: Ermöglicht die Hypothesenprüfung von Motor-Fracht-Interaktionen und der Modulation von Signalwegen.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Beweglichkeitsmessungen, die für die Validierung von Treffern unerlässlich sind.
- Analytik: Ermöglicht die Korrelation der Verweildauer des Motors auf der Oberfläche mit der Mikrotubulus-Geschwindigkeit und der Wegstrecke.
- Translationale Forschung: Schafft einen Bezug zu präklinischen Modellen von axonalen Transportstörungen über funktionelle Messgrößen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine modulare Plattform zum Testen unterschiedlicher Motorproteine oder mikrotubulusassozierter Verbindungen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten, indem die Bindung des Motors von der permanenten Oberflächenanbindung entkoppelt wird.
- Operativer Wert: Gewährleistet die Stabilität des Assays durch kontinuierliche Nachlieferung aktiver Motoren aus der Lösung.
- Strategischer Wert: Verbessert Go/No-Go-Entscheidungen, indem dynamische, auf dem Gleichgewicht basierende Funktionsdaten bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen, die an intrazellulären Transportwegen beteiligt sind.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Proteinaufreinigung, im Umgang mit Mikrotubuli und in der TIRF-Mikroskopie.
- Setzt Zugang zu Fluoreszenzmikroskopen mit Doppellaseranregung und Umweltkontrolle voraus.
- Erfordert standardisierte Oberflächenpassivierung und Flusszellenmontage, um unspezifische Bindungen zu minimieren.
- Beinhaltet die Optimierung der Konzentrationen von Motorproteinen und Mikrotubuli, um ein dynamisches Gleichgewicht aufrechtzuerhalten.
- Ist durch Photobleichungsrisiken begrenzt, falls Antifade-Reagenzien nicht exakt formuliert sind.
