Name: Simultane Bildgebung und Durchflusszytometrie-basierte Detektion mehrerer fluoreszierender Seneszenzmarker in therapieinduzierten seneszenten Krebszellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Erfahren Sie die bildbasierte Durchflusszytometrie zur Analyse mehrerer Seneszenzmarker in einzelnen Krebszellen. Diese Methode ermöglicht hochaufgelöste Bildgebung und räumliche Quantifizierung fluorescenter Signale.

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Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium an Yong Yu von der Johannes Kepler Universität Linz (BERM16108001) unterstützt.

1. DLBCL-Zelllinien mit Mafosfamid oder Daunrubicin Behandlung zur Induktion der zellulären Seneszenz
HINWEIS: Das Protokoll funktioniert auch für adhärente Krebszellen. Je nach Zellgröße 1-2 × 10 5 Zellen in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte einspeisen und die Platte in einem5 % CO2, 37 °C Inkubator über Nacht vor der Behandlung inkubieren. Die Protokollschritte sind die gleichen wie für Suspensionszellen, jedoch mit zwei Ausnahmen. Zuerst müssen Zellen nach Schritt 3.4 von der Platte trypsinisiert werden. Zweitens werden Waschschritte ohne Zentrifugation vor der Trypsinisierung durchgeführt.
<ol><li>Zählen Sie DLBCL-Zellen und Samen Sie 1 × 10 6 Zellen / ml in 4 ml Medium pro Vertiefung in eine 6-Well-Kulturplatte. Kultivieren Sie DLBCL-Zellen in RPMI-1640-Medium, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 100 U / ml Penicillin / Streptomycin.</li>
	<li>Geben Sie MAF (5 μg / ml) oder DN (20 ng / ml) in die Zellkultur und schaukeln Sie die Platte vorsichtig zum Mischen. HINWEIS: MAF und DN sind nicht stabil. Nach dem Auflösen in DMSO sollte die Stammlösung aliquotiert und bei -20 °C gelagert werden. Frost-/Tauzyklen sollten vermieden werden.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platte in einem 5% CO2, 37 °C Inkubator für 3 Tage.</li>
	<li>Nach einer 3-tägigen Inkubation sammeln Sie die DLBCL-Zellen in 15 ml sterilen Zentrifugenröhrchen und drehen Sie sie bei 100 × g, 4 °C für 5 min.</li>
	<li>Verwerfen Sie den Überstand, suspendieren Sie die Zellpellets mit 4 ml frischem Medium und fügen Sie die Suspensionen wieder in die 6-Well-Platte hinzu.</li>
	<li>Kultivieren Sie die Zellplatte in einem 5% CO 2, 37 °C Inkubator für weitere2 Tage, bevor Sie zur Analyse ernten.</li>
</ol>2. Vorbereiten von Lösungen für die Färbung (Tabelle 1)
3. Färben Sie DLBCL-Zellen mit verschiedenen Seneszenzmarkern
HINWEIS: Zellproben, die mit einzelnen Markern (z. B. Pacific Blue-EdU, C12FDG oder Alexa Fluor 647-γH2AX) angefärbt sind, werden vorbereitet, um eine Kompensationsmatrix zu erzeugen, um den Fluoreszenz-Spillover während der Messung zu korrigieren. Obwohl dieser Schritt sehr nahegelegt wird, könnte er ausgesetzt werden, wenn es eine weglassende Überlappung (Kompensationskoeffizientenwert ≤ 0,1) der Emissionsspektren zwischen verschiedenen Fluorophoren gibt. Anwender müssen jedoch standardisierte Kompensationsschritte festlegen, wenn sie verschiedene Instrumente und Fluoreszenzpaneele verwenden.
<ol><li>Geben Sie 10 mM EdU-Lösung in einem Verhältnis von 1:1.000 in die DLBCL-Zellkultur, die aus Schritt 1.6 erzeugt wird (die endgültige EdU-Konzentration beträgt 10 μM). Schaukeln Sie die Platte vorsichtig zum Mischen und Inkubieren in einem Inkubator mit 5% CO2, 37 °C für 3 h.</li>
	<li>Nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und fügen Sie 100 mM Chloroquinlösung zu einer Endkonzentration von 75 μM hinzu (siehe Diskussion). Die Platte vorsichtig schaukeln, um sie zu mischen und in einem 5% CO2, 37 °C Inkubator für 30 min zu inkubieren.</li>
	<li>Nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und fügen Sie 20 mM C 12 FDG-Lösung bei 1: 1.000 zu einer endgültigen C12FDG-Konzentration von 20 μM hinzu. Schaukeln Sie die Platte vorsichtig zum Mischen und Inkubieren in einem 5% CO2, 37 °C Inkubator für 1 h.</li>
	<li>Nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und fügen Sie 100 mM 2-Phenylethyl-β-D-thiogalactoside (PETG) -Lösung bei 1:50 hinzu, um die fSA-β-gal-Färbung (endgültige PETG-Konzentration von 2 mM) zu stoppen. Drehen Sie die Platte vorsichtig zum Mischen.</li>
	<li>Übertragen Sie die Zellen auf 15 ml sterile Zentrifugenröhrchen und drehen Sie sie bei 100 × g, 4 °C für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen mit 4 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).</li>
	<li>Wiederholen Sie den PBS-Waschschritt. Verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellpellets in 500 μL 4% paraformaldehydiger Fixierungslösung.</li>
	<li>Nach 10 min Inkubation bei Raumtemperatur, Zentrifuge bei 250 × g, Raumtemperatur 5 min. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen mit 4 ml PBS.</li>
	<li>Wiederholen Sie den PBS-Waschschritt. Verwerfen Sie den Überstand, suspendieren Sie das Zellpellet in 200 μL Saponinpermeabilisierungspuffer und übertragen Sie die Suspension in ein neues 1,5-ml-Röhrchen. Nach 10 min Inkubation bei Raumtemperatur zentrifugieren bei 250 × g, Raumtemperatur 5 min.</li>
	<li>Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellpellets in 200 μL primärer Antikörperlösung (1:500 γH2AX-Antikörper in Antikörper-Inkubationslösung). Bei 4 °C über Nacht im Dunkeln inkubieren.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 250 × g, 4 °C für 5 min. Verwerfen Sie den Überstand und waschen Sie ihn mit 100 μL Saponin-Waschlösung.</li>
	<li>Wiederholen Sie den Waschschritt zwei weitere Male. Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellpellets in einem 500 μL EdU-Detektionscocktail.</li>
	<li>Bei Raumtemperatur 30 min im Dunkeln inkubieren. Zentrifuge bei 250 × g, Raumtemperatur für 5 min. Verwerfen Sie den Überstand und waschen Sie ihn mit 1 ml Saponin-Waschlösung.</li>
	<li>Wiederholen Sie den Waschschritt zweimal. Verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellpellets in 20-50 μL PBS. Fahren Sie mit Abschnitt 4 für die Probenmessung fort.</li>
</ol>4. Bildgebende Seneszenzmarker mit dem bildgebenden Durchflusszytometersystem
<ol><li>Leeren Sie die Abfallflasche. Überprüfen Sie die Füllstände von Geschwindigkeitsperlen, Sterilisator, Reiniger, Debubbler, Mantel und Spülreagenzien (deionisiertes Wasser), um ausreichend Flüssigkeit zu gewährleisten, bevor Sie das Instrument einschalten (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Schalten Sie das Instrument und die Bildgebungssoftware ein (siehe Softwareschnittstelle in Abbildung 1A).</li>
	<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche Start, um die Fluidik und die Systemkalibrierung zu initialisieren. HINWEIS: Dieser Vorgang dauert ca. 45 Minuten.</li>
	<li>Stellen Sie die Vergrößerung auf 40x ein, stellen Sie die Fluidikgeschwindigkeit auf niedrig ein und schalten Sie die im Experiment benötigten Laser ein. Schalten Sie 405-nm-, 488-nm- und 642-nm-Laser ein, um EdU-pacific blue, C12FDG bzw. Alexa Fluor 647-γH2AX (oder Alexa Fluor 647-Ki67) zu messen. Stellen Sie Ch6 für den Streukanal und Ch1 und Ch9 für das Hellfeld ein.</li>
	<li>Beginnen Sie mit der Probe, von der erwartet wird, dass sie die höchste Fluoreszenz aufweist, um die Intensität der Laser einzustellen. Drehen Sie das Probenröhrchen vorsichtig um, um es zu mischen. Öffnen Sie den Röhrchendeckel und führen Sie das Probenröhrchen in das Dock ein. Klicken Sie auf Laden , um zu beginnen.</li>
	<li>Öffnen Sie ein Streudiagramm und wählen Sie die Features Area_M01 und Aspect Ratio_M01 für die X- bzw. Y-Achse aus. Legen Sie ein Gate oberhalb des Seitenverhältnisses von 0,5 fest, um Dubletten und Zellaggregate unterhalb und auf der rechten Seite sowie die Geschwindigkeitsperlenpopulation auf der linken Seite auszuschließen (Abbildung 1B).</li>
	<li>Öffnen Sie ein Histogrammdiagramm und wählen Sie das Feature-Verlaufs RMS_M01_Ch01 für die X-Achse aus. Wählen Sie die Singulett-Population aus, und legen Sie das Gate so fest, dass es für fokussierte Zellen ausgewählt wird (Abbildung 1C). HINWEIS: Das Bildgebungssystem verwendet automatisch Geschwindigkeitsperlen, um den Fokus für die Bildgebung anzupassen. Es wird jedoch empfohlen, die richtige Hälfte des Histogramm-Peaks für die am besten fokussierte Population auszuwählen.</li>
	<li>Öffnen Sie ein Histogrammdiagramm, und wählen Sie für jeden Farbkanal (Ch2, 7 und 11) die Option "Unformatierte maximale Pixelintensitäten" für die X-Achse aus. Stellen Sie die Laserleistungen ein (d. h. 488 nm, 405 nm und 642 nm Laser für Ch2, 7 bzw. 11), so dass jedes Fluorochrom einen Raw Max Pixel-Wert zwischen 100 und 4.000 hat , um eine Übersättigung zu vermeiden. HINWEIS: Für dieses Experiment beträgt die Einstellung der Laserleistung 50 mW, 200 mW und 50 mW für Laser 488 nm, 405 nm bzw. 642 nm.</li>
	<li>Wählen Sie die fokussierte Grundgesamtheit aus, die aufgezeichnet werden soll, und klicken Sie auf Erwerben , um die DLBCL-Stichproben mit konsistenten Einstellungen zu messen. Wenn Sie Proben für die Messung wechseln, klicken Sie auf Zurück, um das Probenröhrchen wiederherzustellen. Drücken Sie auf Laden , um das Beispiel zu verwerfen .</li>
	<li>Nachdem alle Proben gemessen wurden, schalten Sie den Hellfeld- und Streulaser aus. Messen Sie einfarbige Kontrollproben, um eine Kompensationsmatrix zu erstellen.</li>
	<li>Klicken Sie auf Herunterfahren, um das Imaging-System zu schließen.</li>
	<li>Analysieren Sie die Daten in der Bildanalysesoftware.<ol><li>Verwenden Sie das Spot-Wizard-Tool der Bildanalyse-Software, um Kern-γH2AX-Herde in Lebendzellbildern automatisch zu zählen und zu quantifizieren. Wählen Sie zwei Zellpopulationen aus (eine mit hoher und eine mit niedriger Punktzahl), um den Spot-Assistenten für eine weitere automatische Spot-Count-Analyse zu trainieren.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essence+of+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">The essence of senescence.</a> Genes and Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).</li>
<li>Di Micco, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogene-induced+senescence+is+a+DNA+damage+response+triggered+by+DNA+hyper-replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oncogene-induced senescence is a DNA damage response triggered by DNA hyper-replication.</a> Nature. 444 (7119), 638-642 (2006).</li>
<li>Milanovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+reprogramming+promotes+cancer+stemness%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated reprogramming promotes cancer stemness.</a> Nature. 553 (7686), 96-100 (2018).</li>
<li>Passos, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback+between+p21+and+reactive+oxygen+production+is+necessary+for+cell+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Feedback between p21 and reactive oxygen production is necessary for cell senescence.</a> Molecular Systems Biology. 6 (1), 347(2010).</li>
<li>Lee, S., Schmitt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+nature+of+senescence+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The dynamic nature of senescence in cancer.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 94-101 (2019).</li>
<li>Toussaint, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress-induced+premature+senescence+or+stress-induced+senescence-like+phenotype%3A+one+in+vivo+reality%2C+two+possible+definitions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Scientific+World+Journal%22%5BJournal%5D)">Stress-induced premature senescence or stress-induced senescence-like phenotype: one in vivo reality, two possible definitions.</a> The Scientific World Journal. 2, 230-247 (2002).</li>
<li>Collado, M., Blasco, M. A., Serrano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence+in+cancer+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence in cancer and aging.</a> Cell. 130 (2), 223-233 (2007).</li>
<li>Munoz-Espin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+cell+senescence+during+mammalian+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Programmed cell senescence during mammalian embryonic development.</a> Cell. 155 (5), 1104-1118 (2013).</li>
<li>Faget, D. V., Ren, Q., Stewart, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unmasking+senescence%3A+context-dependent+effects+of+SASP+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Unmasking senescence: context-dependent effects of SASP in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 19 (8), 439-453 (2019).</li>
<li>Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence+in+aging+and+age-related+disease%3A+from+mechanisms+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy.</a> Nature Medicine. 21 (12), 1424-1435 (2015).</li>
<li>Chandra, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+reorganization+of+the+nuclear+landscape+in+senescent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Global reorganization of the nuclear landscape in senescent cells.</a> Cell Rep. 10 (4), 471-483 (2015).</li>
<li>Rodier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+DNA+damage+signalling+triggers+senescence-associated+inflammatory+cytokine+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Persistent DNA damage signalling triggers senescence-associated inflammatory cytokine secretion.</a> Nature Cell Biology. 11 (8), 973-979 (2009).</li>
<li>Schleich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H3K9me3-mediated+epigenetic+regulation+of+senescence+in+mice+predicts+outcome+of+lymphoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">H3K9me3-mediated epigenetic regulation of senescence in mice predicts outcome of lymphoma patients.</a> Nature Communications. 11 (1), 3651(2020).</li>
<li>Di Micco, R., Krizhanovsky, V., Baker, D., d'Adda di Fagagna, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence+in+ageing%3A+from+mechanisms+to+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence in ageing: from mechanisms to therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (2), 75-95 (2021).</li>
<li>Fan, D. N., Schmitt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+markers+of+therapy-induced+senescence+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detecting markers of therapy-induced senescence in cancer cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1534, 41-52 (2017).</li>
<li>Schmitt, C. A., Lowe, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+and+chemoresistance+in+transgenic+cancer+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Apoptosis and chemoresistance in transgenic cancer models.</a> Journal of Molecular Medicine. 80 (3), 137-146 (2002).</li>
<li>Dorr, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+lethal+metabolic+targeting+of+cellular+senescence+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synthetic lethal metabolic targeting of cellular senescence in cancer therapy.</a> Nature. 501 (7467), 421-425 (2013).</li>
<li>Fan, D. N. Y., Schmitt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotoxic+stress-induced+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genotoxic stress-induced senescence.</a> Methods in Molecular Biology. 1896, 93-105 (2019).</li>
<li>Noppe, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+flow+cytometric+method+for+measuring+senescence+associated+beta-galactosidase+activity+in+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts.</a> Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).</li>
<li>Biran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+identification+of+senescent+cells+in+aging+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Quantitative identification of senescent cells in aging and disease.</a> Aging Cell. 16 (4), 661-671 (2017).</li>
<li>Rossi, M., Abdelmohsen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emergence+of+senescent+surface+biomarkers+as+senotherapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The emergence of senescent surface biomarkers as senotherapeutic targets.</a> Cells. 10 (7), 1740(2021).</li>
<li>Gonzalez-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Munoz-Espin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+assessing+cellular+senescence+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo.</a> The FEBS Journal. 288 (1), 56-80 (2021).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Diese Methode untersuchte die Seneszenzeintrittsfähigkeit von vier verschiedenen DLBCL-Zelllinien unter Chemotherapie mit Hellfeldbildgebung und Durchflusszytometrie-basierter Quantifizierung. Auf Einzelzellebene konnten wir erfolgreich wichtige C 12 FDG+EdU-Ki67+ seneszente Populationen in behandelten KARPAS422- und WSU-DLCL2-Zellen und in geringerem Maße in OCI-LY1-Zellen nachweisen, während die SU-DHL6-Zelllinie resistent gegen die Behandlung war. Der Unterschied in der Sene...

Eine Vielzahl von Reizen kann zelluläre Seneszenz auslösen, wodurch Zellen in einen Zustand stabilen Zellzyklusstillstands eintreten. Zu diesen Reizen gehören intrinsische Signalveränderungen oder extrinsische Spannungen. Intrinsische Signale umfassen progressive Telomerverkürzung, Veränderungen der Telomerstruktur, epigenetische Modifikation, Proteostasestörungen, mitochondriale Dysfunktion und Aktivierung von Onkogenen. Extrinsische Belastungen umfassen entzündliche und/oder Gewebeschädigungssignale, Bestrahlung oder chemische Behandlung und Nahrungsentzug 1,2,3,4. Unter den verschiedenen Arten der Seneszenz sind die am häufigsten beobachteten und gut untersuchten replizierte Seneszenzenz, Onkogen-induzierte Seneszenz (OIS), strahleninduzierte Seneszenz und therapieinduzierte Seneszenz (TIS). OIS ist eine akute zelluläre Reaktion auf genotoxische Schäden, die durch replizierenden Stress verursacht werden, der durch aberrante Onkogenaktivierung erzeugt wird, und kann bis zu einem gewissen Grad das pathologische Fortschreiten von einer präneoplastischen Läsion zu einem ausgewachsenen Tumor verhindern. TIS tritt auf, wenn Tumorzellen durch Chemotherapeutika oder ionisierende Strahlung gestresstwerden 5,6.
Seneszenz gilt aufgrund ihrer hochdynamischen Natur als zweischneidiges Schwert in der Pathologie. Es wurde ursprünglich als ein nützlicher tumorunterdrückender Mechanismus beschrieben, um beschädigte Zellen aus dem zirkulierenden Pool von sich teilenden Zellen zu entfernen, die normale Funktion der Organe zu sichern und das Tumorwachstum zu hemmen 7,8,9. Neue Beweise deuten jedoch auf eine dunkle Seite der Seneszenz hin. Seneszente Zellen sezernieren proinflammatorische Zytokine, bekannt als Seneszenz-assoziierter sekretorischer Phänotyp (SASP), was zu Fibrose und fehlfunktionellen Organen führt und die Tumorentstehung und -progressionfördert 10. Darüber hinaus durchlaufen seneszente Krebszellen eine epigenetische und Genexpressions-Reprogrammierung parallel zur Chromatin-Remodellierung und Aktivierung einer anhaltenden DNA-Schadensantwort (DDR)11,12 und erwerben neue Krebs-Stammzell-Eigenschaften3. Obwohl seneszenzfähige Tumore im Vergleich zu seneszenzunfähigen Tumoren besser auf therapeutische Interventionen ansprechen13, kann die Persistenz seneszenter Zellen zu einer schlechten Langzeitprognose führen, wenn sie nicht effektiv identifiziert und durch senolytische Medikamente eliminiertwerden 5. In jedem Fall ist eine zuverlässige Methode zur Beurteilung der Seneszenz von erheblichem klinischem Interesse, nicht nur für die Prognose der Therapiebehandlung, sondern auch für die Entwicklung neuartiger Strategien für seneszente Zellen.
Unabhängig von verschiedenen Auslösern weisen seneszente Zellen einige gemeinsame Merkmale auf, darunter vergrößerte, abgeflachte, mehrkernige Morphologie mit großen Vakuolen, signifikant expandierte Kerne, Bildung von H3K9me3-reichem Seneszenz-assoziiertem Heterochromatin (SAHF) im Zellkern, persistierende Ansammlung von DNA-Schadensmarker-γH2AX-Herden, aktiviertes p53-p21CIP1 und Rb-p16INK4a Zellzyklus-Regulationsmechanismen, stabiler G1-Zellzyklus-Stillstand, massive Induktion von SASP und erhöhte Seneszenz-assoziierte β-Galactosidase-Aktivität (SA-β-gal) 14. Da kein einzelner Marker ausreicht, um die Seneszenz zu definieren, wird die enzymatische Färbung für die SA-β-gal-Aktivität, die als Goldstandard für den Seneszenznachweis gilt, normalerweise mit einer immunhistochemischen Färbung für H3K9me3 und Ki67 kombiniert, um TIS15 nachzuweisen. Chemisch-chromogenes SA-β-gal ist jedoch schwer zu quantifizieren. Hier kombinierten wir 5-Dodecanoylaminofluorescein-di-β-D-Galactopyranosid (C 12 FDG) fluoreszenzbasierten SA-β-gal (fSA-β-gal)-Nachweis mit Immunfluoreszenzfärbung für γH2AX und EdU-inkorporierte DNA, um C12FDG+EdU-γH2AX+ seneszente Zellen mit dem fortschrittlichen bildgebenden Durchflusszytometersystem zu identifizieren, das die Geschwindigkeit, Empfindlichkeit und detaillierte Einzelzellbilder mit räumlichen Informationen kombiniert, die durch Durchflusszytometrie und Mikroskopie nicht bereitgestellt werden können. Diese Methode ermöglicht die schnelle Generierung von hochauflösenden Bildern, die die Positionierung und Quantifizierung von Fluoreszenzsignalen innerhalb von Zellen ermöglichen, während die schnelle Analyse mehrerer Proben durch den Bau von Standardpipelines lizenziert wird.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 647 Anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antikörper</td><td>Biolegend</td><td>613407</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ki-67 Maus Monoklonaler Antikörper (Alexa Fluor 647)</td><td>Biolegend</td><td>350509</td><td></td></tr><tr><td>C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-&beta;-D-Galactopyranosid)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11590276</td><td></td></tr><tr><td>Chloroquin-Diphosphat</td><td>Sigma aldrich</td><td>C6628</td><td></td></tr><tr><td>Reiniger (Coulter Clenz)</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546929</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Pacific Blue Durchflusszytometrie-Assay-Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>C10418</td><td></td></tr><tr><td>Daunorubicin</td><td>Medchemexpress</td><td>HY-13062A</td><td></td></tr><tr><td>Debubbler (70 % Isopropanol)</td><td>Millipore</td><td>1.3704</td><td></td></tr><tr><td>Bildanalyse-Software (Amnis&nbsp; IDEEN&nbsp; 6.3)</td><td>Luminex</td><td>CN-SW69-12</td><td></td></tr><tr><td>Instrumenten- und Bildgebungssoftware (Amnis&nbsp; ImageStreamX&nbsp; Mk II Imaging Flow Cytometer System und INSPIRE-Software)</td><td>Luminex</td><td>100220</td><td></td></tr><tr><td>KARPAS</td><td>DSMZ</td><td>ACC 31</td><td></td></tr><tr><td>Mafosfamid Cyclohexylamin</td><td>Niomech</td><td>D-17272</td><td></td></tr><tr><td>OCI-LY1</td><td>DSMZ</td><td>ACC 722</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Fisher Scientific</td><td>11473704</td><td></td></tr><tr><td>PETG (2-Phenylethyl-&beta;-D-Thiogalactosid)&nbsp;</td><td>Sigma aldrich</td><td>P4902</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Hülle</td><td>Millipore</td><td>BSS-1006-B</td><td></td></tr><tr><td>SpeedBead Kit für ImageStream</td><td>Luminex</td><td>400041</td><td></td></tr><tr><td>Sterilisator (0,4-0,7% Hypochlorit)</td><td>VWR</td><td>JT9416-1</td><td></td></tr><tr><td>SU-DHL6</td><td>DSMZ</td><td>ACC 572</td><td></td></tr><tr><td>WSU-DLCL2</td><td>DSMZ</td><td>ACC 575</td><td></td></tr></tbody></table>

simultane bildgebung und durchflusszytometrie-basierte detektion mehrerer fluoreszierender seneszenzmarker in therapieinduzierten seneszenten krebszellen

Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells

Chemotherapeutika können irreparable DNA-Schäden in Krebszellen induzieren, was zu Apoptose oder vorzeitiger Seneszenz führt. Im Gegensatz zum apoptotischen Zelltod ist die Seneszenz eine grundlegend andere Maschinerie, die die Ausbreitung von Krebszellen hemmt. Jahrzehntelange wissenschaftliche Studien haben die komplexen pathologischen Wirkungen von seneszenten Krebszellen in Tumoren und Mikroumgebungen aufgedeckt, die Krebszellen und Stromazellen modulieren. Neue Erkenntnisse deuten darauf hin, dass Seneszenz ein starker prognostischer Faktor während der Krebsbehandlung ist, und daher ist ein schneller und genauer Nachweis seneszenter Zellen in Krebsproben unerlässlich. Dieses Papier stellt eine Methode zur Visualisierung und zum Nachweis von therapieinduzierter Seneszenz (TIS) in Krebszellen vor. Diffuse großzellige B-Zell-Lymphom (DLBCL)-Zelllinien wurden mit Mafosfamid (MAF) oder Daunrubicin (DN) behandelt und auf den Seneszenzmarker, Seneszenz-assoziierte β-Galactosidase (SA-β-gal), den DNA-Synthesemarker 5-Ethynyl-2′-Desoxyuridin (EdU) und den DNA-Schadensmarker gamma-H2AX (γH2AX) untersucht. Die Bildgebung von Durchflusszytometern kann dazu beitragen, in kurzer Zeit hochauflösende Einzelzellbilder zu erzeugen, um die drei Marker in Krebszellen gleichzeitig zu visualisieren und zu quantifizieren.

Eine Kompensationsmatrix wurde mit Hilfe von Bildanalysesoftware generiert, indem aufgezeichnete Daten von einfarbigen Kontrollproben geladen wurden. Wie in Ergänzender Abbildung S1 gezeigt, wurde ein nicht zu vernachlässigender Lichtüberlauf (Koeffizientenwert ≥ 0,1) von EdU auf C12FDG mit einem Übersprechkoeffizientenwert von 0,248 festgestellt, während das Übersprechen unter anderen Kanälen nicht signifikant war. Vier verschiedene DLBCL-Zelllinien wurden mit 5 μg/ml MAF oder 20 ng/mL DN beh...

Hier stellen wir eine auf Durchflusszytometrie basierende Methode zur Visualisierung und Quantifizierung mehrerer seneszenzassoziierter Marker in einzelnen Zellen vor.

Simultane Bildgebung und Durchflusszytometrie-basierte Detektion mehrerer fluoreszierender Seneszenzmarker in therapieinduzierten seneszenten Krebszellen

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, ...

Diese Methode kann schnell hochauflösende Bilder erzeugen, die eine Analyse der räumlichen Verteilung und Quantifizierung von Fluoreszenzsignalen innerhalb von Zellen ermöglichen und gleichzeitig eine schnelle Analyse mehrerer Proben ermöglichen. Die Zellen werden mit dem fortschrittlichen bildgebenden Durchflusszytometriesystem gemessen, das Geschwindigkeit, Empfindlichkeit und detaillierte Einzelzellbilder mit räumlichen Informationen kombiniert, die einzigartige Daten liefern, die durch Durchflussoptometrie oder Mikroskopie nicht bereitgestellt werden können. Ein wichtiger Rat ist, genügend Zellen zur Verfügung zu stellen, um die Geräteeinstellungen festzulegen, und wir suspendieren die Zellen bei der hohen Dichte für die Messungen.Abgesehen davon ist die Datenerfassung unkompliziert und ähnelt der herkömmlichen Durchflusszytometrie. Generieren Sie zunächst die DLBCL-Zelllinien wie im Manuskript beschrieben. Dann 10 Millimolar EdU-Lösung im Verhältnis eins zu 1000 in die DLBCL-Zellkultur geben und die Platte in einem 5%igen Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius für drei Stunden inkubieren, nachdem die Platte durch leichtes Schaukeln gemischt wurde.Nehmen Sie die Platte nach der Inkubation heraus und fügen Sie 100 Millimolar Chloroquinlösung zu einer Endkonzentration von 75 Mikromolaren hinzu. Durch Schaukeln vorsichtig mischen und 30 Minuten inkubieren. Dann fügen Sie 20 Millimolar C12 FDG-Lösungen zu einer Endkonzentration von 20 Mikromolaren hinzu.Nach dem vorsichtigen Mischen die Platte wie zuvor demonstriert eine Stunde lang inkubieren. Als nächstes fügen Sie 100 Millimolar 2-Phenylethyl-beta-d-thiogalactosid-Lösung bei eins zu 50 hinzu, um die FSA-Beta-Gal-Färbung zu stoppen. Und drehen Sie die Platte vorsichtig, um zu mischen.Die Zellen werden in 15 Milliliter sterile Zentrifugenröhrchen überführt und bei 100 mal G fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius gedreht. Sobald der Überstand verworfen ist, waschen Sie die Zellen mit vier Milliliter PBS und zentrifugieren Sie bei 100 mal G fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius. Dann suspendieren Sie die Zellpellets in 500 Mikrolitern bei 4% Paraformaldehyd-Fixierungslösung.Nach 10-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur bei 250 mal G für fünf Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen zweimal mit vier Milliliter PBS und zentrifugieren Sie bei 100 mal G für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Nach dem Waschen den Überstand verwerfen und das Zellpellet in 200 Mikrolitern Saponin-Permeabilisierungspuffer erneut suspendieren.Nun die Suspension in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen geben und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Pelletieren Sie die Zellen bei 250 mal G für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Dann suspendieren Sie die Zellen in 200 Mikrolitern primärer Antikörperlösung und inkubieren Sie bei vier Grad Celsius über Nacht im Dunkeln.Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 250 mal G fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie ihn mit 100 Mikrolitern Saponin-Waschlösung. Nach zweimaligem Waschen der Zellen den Überstand verwerfen und die Zellpellets in 500 Mikrolitern EdU-Detektionscocktail erneut suspendieren.Bei Raumtemperatur 30 Minuten im Dunkeln inkubieren und bei 250 mal G fünf Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. Den Überstand entsorgen und mit einem Milliliter Saponin-Waschlösung waschen. Wiederholen Sie das Waschen zweimal, entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellpellets in 20 bis 50 Mikrolitern PBS.Bevor Sie das Gerät einschalten, leeren Sie die Abfallflüssigkeitsflasche und überprüfen Sie den Füllstand von SpeedBeads, Sterilisator, Reiniger, Entstapler und Hülle ausreichend Flüssigkeiten. Nachdem Sie das Instrument und die Bildgebungssoftware eingeschaltet haben, klicken Sie auf die Startschaltfläche, um die Fluidik und die Systemkalibrierung zu initialisieren. Stellen Sie die Vergrößerung auf das 40-fache und die Fluidgeschwindigkeit auf niedrig ein.Schalten Sie nach dem Einschalten der Laser einen 405-Nanometer-Laser ein, um EdU Pacific Blue zu messen, 488 Nanometer zur Messung von C12-FDG und 642 Nanometer zur Messung von Alexa-Fluor-647-gamma-H2AX. Stellen Sie Kanal sechs für den Streukanal, Kanal eins und Kanal neun für das Hellfeld ein. Beginnen Sie dann mit der Probe, von der erwartet wird, dass sie die höchste Fluoreszenz aufweist, um die Intensität der Laser einzustellen, und drehen Sie das Probenröhrchen vorsichtig um, um es zu mischen.Nach dem Öffnen des Röhrchendeckels setzen Sie das Probenröhrchen in das Dock ein. Klicken Sie auf Laden, um ein Punktdiagramm zu starten und zu öffnen. Wählen Sie als Nächstes den Bereich Features, unterstreichen Sie MO1 und unterstreichen Sie das Seitenverhältnis MO1 für die X- bzw. Y-Achse.Legen Sie ein Gate über dem Seitenverhältnis von 0,5 fest, um Dubletten und Zellaggregate unterhalb und auf der rechten Seite und die SpeedBead-Population auf der linken Seite auszuschließen. Öffnen Sie nun Histogrammdiagramm und wählen Sie das Merkmalsverlaufs-Wurzelmittelquadrat von Maske eins und Kanal eins für die X-Achse aus. Wählen Sie die Singulettpopulation aus und legen Sie das Tor so fest, dass es für fokussierte Zellen ausgewählt wird.Öffnen Sie ein Histogrammdiagramm und wählen Sie rohe maximale Pixelintensitäten für die X-Achsenkanäle zwei, sieben und 11 aus. Stellen Sie dann die Laserleistungen von 488 Nanometern, 405 Nanometern und 642 Nanometern für Kanal zwei, sieben und 11 so ein, dass jedes Fluorochrom einen rohen maximalen Pixelwert zwischen 100 und 4.000 hat, um eine Übersättigung zu vermeiden. Wählen Sie die fokussierte Population aus, die aufgezeichnet werden soll, und klicken Sie auf Erfassen, um die DLBCL-Stichproben mit konsistenten Einstellungen zu messen.Wenn Sie die Proben für die Messung wechseln, klicken Sie auf Zurück, um das Probenröhrchen wiederherzustellen. Drücken Sie Load, um die Probe zu verwerfen. Nachdem alle Proben gemessen wurden, schalten Sie den Hellfeld- und Streulaser aus.Messen Sie einzelne Farbkontrollmuster, um eine Kompensationsmatrix zu erstellen. Klicken Sie auf Herunterfahren, um das Imaging-System zu schließen. Analysieren Sie die Daten in der Bildanalysesoftware.Verwenden Sie den Spot Wizard der Bildanalysesoftware, um nukleare Gamma-H2AX-Foci- und Lebendzellenbilder automatisch zu zählen und zu quantifizieren. Wählen Sie zwei Zellpopulationen aus, eine mit hoher und eine mit niedriger Punktzahl, um den Spot-Assistenten für die weitere automatische Spot-Count-Analyse zu trainieren. Die Durchflusszytometrie-Methode in Einzelzellbildern zeigte erhöhte C12-FDG-positive, EdU-negative, gamma-H2AX-positive, seneszierte Population und KARPAS422.WSU-DLCL2- und OCI-LY1-Zellen, jedoch nicht in SU-DHL6-Zellen. Die bildgebende Analyse zeigte signifikant höhere Zahlen von gamma-H2AX-Herden und KARPAS422, WSU-DLCL2 und OCI-LY1, jedoch nicht in SU-DHL6-Zellen. Ähnliche Ergebnisse wurden durch Häufigkeits- und Quantifizierungsdaten dargestellt.Die Zugabe von Saponin zur Zellsuspension ist entscheidend, da die Antikörper sonst die zellinternen Antigene nicht erreichen können und aggressive Reinigungsmittel zum Verlust des C12-FTG-Signals führen Die bildgebende Zytometrie ist optimal für die Analyse von Veränderungen der Markerlokalisation wie der Translokation eines Transkriptionsfaktors in den Zellkern als Reaktion auf bestimmte Reize. Eine solche Analyse kann auch mit unserem Protokoll erreicht werden. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung mehrerer fluoreszierender Marker auf Einzelzellebene, wodurch das Vorhandensein, die Intensität und die Lokalisierung der einzelnen Signale erkannt werden können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Dieses Video zeigt einen auf Durchflusszytometrie basierenden Assay zur Quantifizierung von therapieinduzierten seneszenten Krebszellen mit dualen Seneszenzmarkern. Der Nachweis und die Quantifizierung seneszenter Zellen erfolgt unter Verwendung eines β-Galactosidase-Substrats. Das Substrat wird durch aktive lysosomale β-Galactosidase innerhalb der seneszenten Zellen gespalten, wodurch ein fluoreszierendes Produkt entsteht, das in Verbindung mit autofluoreszierenden Lipofuszin-Granulaten die...

Durchflusszytometrie-basierte Quantifizierung von therapieinduzierten seneszenten Krebszellen

Dieses Video demonstriert eine in-situ Fluoreszenz-Multispektral-Bildgebungstechnik zur Analyse verschiedener Subpopulationen von infiltrierenden T-Zellen im Tumorgewebe. Eine Kryosektion des Nierenzellkarzinoms wird mit Antikörpern behandelt, um CD8+ T-Zellen zu markieren, die spezifische inhibitorische Rezeptoren exprimieren und einen immuntherapieresistenten Phänotyp aufweisen. Der markierte Schnitt wird mit einem Multispektralmikroskop visualisiert, um die unterschiedlichen CD8+...

Multiplex-Immunfluoreszenz-Bildgebung zur Analyse immuntherapieresistenter T-Zell-Subpopulationen

Ob Seneszenz verhindert oder fördert Tumorentstehung bleibt umstritten. Da Chemotherapeutika Krebszellen veranlassen können, altern, Studium Seneszenz ist für Vorschläge für neue Therapien unerlässlich. Allerdings stellt die Standard-und im Großen und Ganzen verwendet β-Galactosidase Assay große Nachteile. Wir schlagen hier eine schnelle und empfindliche Durchflusszytometrie-basierte Assays zur Quantifizierung Seneszenz.

Eine empfindliche Methode zur Quantifizierung Seneszente Cancer Cells

Dual-Kamera-Emissionsspaltanlagen für zwei-Farben-Fluoreszenz-Mikroskopie erzeugen Echtzeit-Bildsequenzen mit außergewöhnlichen optischen und zeitlichen Auflösung, einem Bedarf von lebenden Zellassays einschließlich Parallelplattenlaufkammer Adhäsions-Assays. Als Software wird verwendet, um Bilder von gleichzeitig erworben Emissionskanäle verschmelzen, pseudocolored Bildsequenzen produziert.

Gleichzeitig Capturing in Echtzeit Bilder in zwei Emissions Kanäle unter Verwendung eines Dual-Kamera-Emissions-Splitting-System: Anwendungen in der Zelladhäsion

Zelluläre Seneszenz ist der Schlüsselfaktor bei der Entwicklung chronischer altersbedingter Pathologien. Die Identifizierung von Therapeutika, die auf seneszente Zellen abzielen, verspricht, eine gesunde Alterung zu verlängern. Hier präsentieren wir einen neuartigen Test zur Identifizierung von Senotherapeutika auf der Grundlage der Messung der seneszenzassoziierten Galactosidase-Aktivität in Einzelzellen.

SA--Galactosidase-basierter Screening-Test zur Identifizierung von Senotherapeutischen Arzneimitteln

Wir präsentieren eine Durchflusszytometrie-Methode, um gleichzeitig verschiedene Zelltypen zu identifizieren, die aus dem Gehirn oder Rückenmark der Maus abgerufen wurden. Diese Methode könnte genutzt werden, um reine Zellpopulationen bei neurodegenerativen Erkrankungen zu isolieren oder zu charakterisieren oder das Ausmaß der Zellausrichtung bei der In-vivo-Verabreichung von viralen Vektoren oder Nanopartikeln zu quantifizieren.

Gleichzeitige zytometrische Charakterisierung mehrerer Zelltypen, die durch verschiedene Homogenisierungsmethoden aus dem Maushirn/Spinalcord abgerufen wurden

Wir beschreiben eine schnelle Färbemethode zur multispektralen Bildgebung an gefrorenen Geweben.

Eine schnelle Methode zur multispektralen Fluoreszenz-Bildgebung von tiefgefrorenen Gewebeabschnitten

Ein Protokoll zur fluoreszierenden, durchflusszytometrischen Quantifizierung von seneszenten Krebszellen, die durch Chemotherapeutika in Zellkultur oder in murinen Tumormodellen induziert werden, wird vorgestellt. Optionale Verfahren umfassen die Co-Immunfärbung, die Probenfixierung zur Erleichterung der Analyse großer Chargen oder Zeitpunkte sowie die Anreicherung lebensfähiger seneszenter Zellen durch durchflusszytometrische Sortierung.

Far-Red Fluoreszenz-Seneszenz-assoziierte β-Galactosidase-Sonde zur Identifizierung und Anreicherung von seneszenten Tumorzellen mittels Durchflusszytometrie

Multiplexierte Immunfluoreszenz ermöglicht die sequentielle Markierung mehrerer Antikörpermarker innerhalb eines einzelnen Gewebeschnitts, um die räumliche Analyse der Gewebearchitektur und Zellpopulationen zu unterstützen. Hier wird ein Arbeitsablauf zur Multiplexerkennung von seneszenzassoziierten, strukturellen und immunen Markern präsentiert, einschließlich manueller und automatisierter Objektträgervorbereitung, iterativer Bildgebung und Einzelzellanalyse mit digitaler Pathologiesoftware.

Multiplexierter Immunfluoreszenz-Assay zur räumlichen Bewertung von Altersmarkern in vivo

Eine effizientes Screening-Protokoll wird für die Identifikation von kleinen Molekülen präsentiert, die Astroglial Differenzierung in Glioblastom Stammzellen (vorliegenden Allgemeinen Geschäftsbedingungen) zu fördern. Der Test basiert auf Stammzell-Differenzierung Reporter, wobei der Ausdruck der verbesserte GFP (eGFP) durch den menschlichen GFAP Projektträger angetrieben wird.

Flow Cytometry-based Drug Screening-System für die Identifizierung von kleinen Molekülen, die zelluläre Differenzierung von Stammzellen Glioblastom zu fördern

Erfahren Sie die bildbasierte Durchflusszytometrie zur Analyse mehrerer Seneszenzmarker in einzelnen Krebszellen. Diese Methode ermöglicht hochaufgelöste Bildgebung und räumliche Quantifizierung fluorescenter Signale.

Simultane Bildgebung und Durchflusszytometrie-basierte Detektion mehrerer fluoreszierender Seneszenzmarker in therapieinduzierten seneszenten Krebszellen (Video) | JoVE Journal

Simultane Bildgebung und Durchflusszytometrie-basierte Detektion mehrerer fluoreszierender Seneszenzmarker in therapieinduzierten seneszenten Krebszellen

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