Simultane Bildgebung und Durchflusszytometrie-basierte Detektion mehrerer fluoreszierender Seneszenzmarker in therapieinduzierten seneszenten Krebszellen

Hier stellen wir eine auf Durchflusszytometrie basierende Methode zur Visualisierung und Quantifizierung mehrerer seneszenzassoziierter Marker in einzelnen Zellen vor.

Diese Methode kann schnell hochauflösende Bilder erzeugen, die eine Analyse der räumlichen Verteilung und Quantifizierung von Fluoreszenzsignalen innerhalb von Zellen ermöglichen und gleichzeitig eine schnelle Analyse mehrerer Proben ermöglichen. Die Zellen werden mit dem fortschrittlichen bildgebenden Durchflusszytometriesystem gemessen, das Geschwindigkeit, Empfindlichkeit und detaillierte Einzelzellbilder mit räumlichen Informationen kombiniert, die einzigartige Daten liefern, die durch Durchflussoptometrie oder Mikroskopie nicht bereitgestellt werden können. Ein wichtiger Rat ist, genügend Zellen zur Verfügung zu stellen, um die Geräteeinstellungen festzulegen, und wir suspendieren die Zellen bei der hohen Dichte für die Messungen.

Abgesehen davon ist die Datenerfassung unkompliziert und ähnelt der herkömmlichen Durchflusszytometrie. Generieren Sie zunächst die DLBCL-Zelllinien wie im Manuskript beschrieben. Dann 10 Millimolar EdU-Lösung im Verhältnis eins zu 1000 in die DLBCL-Zellkultur geben und die Platte in einem 5%igen Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius für drei Stunden inkubieren, nachdem die Platte durch leichtes Schaukeln gemischt wurde.

Nehmen Sie die Platte nach der Inkubation heraus und fügen Sie 100 Millimolar Chloroquinlösung zu einer Endkonzentration von 75 Mikromolaren hinzu. Durch Schaukeln vorsichtig mischen und 30 Minuten inkubieren. Dann fügen Sie 20 Millimolar C12 FDG-Lösungen zu einer Endkonzentration von 20 Mikromolaren hinzu.

Nach dem vorsichtigen Mischen die Platte wie zuvor demonstriert eine Stunde lang inkubieren. Als nächstes fügen Sie 100 Millimolar 2-Phenylethyl-beta-d-thiogalactosid-Lösung bei eins zu 50 hinzu, um die FSA-Beta-Gal-Färbung zu stoppen. Und drehen Sie die Platte vorsichtig, um zu mischen.

Die Zellen werden in 15 Milliliter sterile Zentrifugenröhrchen überführt und bei 100 mal G fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius gedreht. Sobald der Überstand verworfen ist, waschen Sie die Zellen mit vier Milliliter PBS und zentrifugieren Sie bei 100 mal G fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius. Dann suspendieren Sie die Zellpellets in 500 Mikrolitern bei 4% Paraformaldehyd-Fixierungslösung.

Nach 10-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur bei 250 mal G für fünf Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen zweimal mit vier Milliliter PBS und zentrifugieren Sie bei 100 mal G für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Nach dem Waschen den Überstand verwerfen und das Zellpellet in 200 Mikrolitern Saponin-Permeabilisierungspuffer erneut suspendieren.

Nun die Suspension in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen geben und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Pelletieren Sie die Zellen bei 250 mal G für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Dann suspendieren Sie die Zellen in 200 Mikrolitern primärer Antikörperlösung und inkubieren Sie bei vier Grad Celsius über Nacht im Dunkeln.

Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 250 mal G fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie ihn mit 100 Mikrolitern Saponin-Waschlösung. Nach zweimaligem Waschen der Zellen den Überstand verwerfen und die Zellpellets in 500 Mikrolitern EdU-Detektionscocktail erneut suspendieren.

Bei Raumtemperatur 30 Minuten im Dunkeln inkubieren und bei 250 mal G fünf Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. Den Überstand entsorgen und mit einem Milliliter Saponin-Waschlösung waschen. Wiederholen Sie das Waschen zweimal, entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellpellets in 20 bis 50 Mikrolitern PBS.

Bevor Sie das Gerät einschalten, leeren Sie die Abfallflüssigkeitsflasche und überprüfen Sie den Füllstand von SpeedBeads, Sterilisator, Reiniger, Entstapler und Hülle ausreichend Flüssigkeiten. Nachdem Sie das Instrument und die Bildgebungssoftware eingeschaltet haben, klicken Sie auf die Startschaltfläche, um die Fluidik und die Systemkalibrierung zu initialisieren. Stellen Sie die Vergrößerung auf das 40-fache und die Fluidgeschwindigkeit auf niedrig ein.

Schalten Sie nach dem Einschalten der Laser einen 405-Nanometer-Laser ein, um EdU Pacific Blue zu messen, 488 Nanometer zur Messung von C12-FDG und 642 Nanometer zur Messung von Alexa-Fluor-647-gamma-H2AX. Stellen Sie Kanal sechs für den Streukanal, Kanal eins und Kanal neun für das Hellfeld ein. Beginnen Sie dann mit der Probe, von der erwartet wird, dass sie die höchste Fluoreszenz aufweist, um die Intensität der Laser einzustellen, und drehen Sie das Probenröhrchen vorsichtig um, um es zu mischen.

Nach dem Öffnen des Röhrchendeckels setzen Sie das Probenröhrchen in das Dock ein. Klicken Sie auf Laden, um ein Punktdiagramm zu starten und zu öffnen. Wählen Sie als Nächstes den Bereich Features, unterstreichen Sie MO1 und unterstreichen Sie das Seitenverhältnis MO1 für die X- bzw. Y-Achse.

Legen Sie ein Gate über dem Seitenverhältnis von 0,5 fest, um Dubletten und Zellaggregate unterhalb und auf der rechten Seite und die SpeedBead-Population auf der linken Seite auszuschließen. Öffnen Sie nun Histogrammdiagramm und wählen Sie das Merkmalsverlaufs-Wurzelmittelquadrat von Maske eins und Kanal eins für die X-Achse aus. Wählen Sie die Singulettpopulation aus und legen Sie das Tor so fest, dass es für fokussierte Zellen ausgewählt wird.

Öffnen Sie ein Histogrammdiagramm und wählen Sie rohe maximale Pixelintensitäten für die X-Achsenkanäle zwei, sieben und 11 aus. Stellen Sie dann die Laserleistungen von 488 Nanometern, 405 Nanometern und 642 Nanometern für Kanal zwei, sieben und 11 so ein, dass jedes Fluorochrom einen rohen maximalen Pixelwert zwischen 100 und 4.000 hat, um eine Übersättigung zu vermeiden. Wählen Sie die fokussierte Population aus, die aufgezeichnet werden soll, und klicken Sie auf Erfassen, um die DLBCL-Stichproben mit konsistenten Einstellungen zu messen.

Wenn Sie die Proben für die Messung wechseln, klicken Sie auf Zurück, um das Probenröhrchen wiederherzustellen. Drücken Sie Load, um die Probe zu verwerfen. Nachdem alle Proben gemessen wurden, schalten Sie den Hellfeld- und Streulaser aus.

Messen Sie einzelne Farbkontrollmuster, um eine Kompensationsmatrix zu erstellen. Klicken Sie auf Herunterfahren, um das Imaging-System zu schließen. Analysieren Sie die Daten in der Bildanalysesoftware.

Verwenden Sie den Spot Wizard der Bildanalysesoftware, um nukleare Gamma-H2AX-Foci- und Lebendzellenbilder automatisch zu zählen und zu quantifizieren. Wählen Sie zwei Zellpopulationen aus, eine mit hoher und eine mit niedriger Punktzahl, um den Spot-Assistenten für die weitere automatische Spot-Count-Analyse zu trainieren. Die Durchflusszytometrie-Methode in Einzelzellbildern zeigte erhöhte C12-FDG-positive, EdU-negative, gamma-H2AX-positive, seneszierte Population und KARPAS422.

WSU-DLCL2- und OCI-LY1-Zellen, jedoch nicht in SU-DHL6-Zellen. Die bildgebende Analyse zeigte signifikant höhere Zahlen von gamma-H2AX-Herden und KARPAS422, WSU-DLCL2 und OCI-LY1, jedoch nicht in SU-DHL6-Zellen. Ähnliche Ergebnisse wurden durch Häufigkeits- und Quantifizierungsdaten dargestellt.

Die Zugabe von Saponin zur Zellsuspension ist entscheidend, da die Antikörper sonst die zellinternen Antigene nicht erreichen können und aggressive Reinigungsmittel zum Verlust des C12-FTG-Signals führen Die bildgebende Zytometrie ist optimal für die Analyse von Veränderungen der Markerlokalisation wie der Translokation eines Transkriptionsfaktors in den Zellkern als Reaktion auf bestimmte Reize. Eine solche Analyse kann auch mit unserem Protokoll erreicht werden. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung mehrerer fluoreszierender Marker auf Einzelzellebene, wodurch das Vorhandensein, die Intensität und die Lokalisierung der einzelnen Signale erkannt werden können.