Kartierung der absoluten DNA-Dichte in Zellkernen mit Hilfe der Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie

Die vorliegende Methode ermöglicht absolute DNA-Dichtemessungen in Zellkernen, um die räumlichen Einschränkungen in Chromatinstrukturen zu untersuchen, die sonst nur durch Histonmodifikationen nach der Translation gekennzeichnet sind. Die Voronoi-Tessellation in Kombination mit SMLM ermöglicht absolute Dichteschätzungen der DNA in Bezug auf das Basenpaar pro Quadratmikrometer. Das einzige Apriori-Wissen, das benötigt wird, ist der Gesamt-DNA-Gehalt des gemessenen Zellkerns.

In zukünftigen Experimenten wäre es interessant zu untersuchen, ob absolute Dichteunterschiede mit biologischen Informationen aus anderen Methoden, wie der Immunfluoreszenz epigenetischer Modifikationen oder Hi-C-Daten, korrelieren. Beginnen Sie mit der Rekonstruktion des gescannten Bereichs, indem Sie die zuvor aufgezeichneten Einzelbilder miteinander kacheln. Öffnen Sie CellProfiler, und laden Sie dann die Pipeline cellcycleanalysis.cpproj.

Sobald das Histogramm der Kerne im zu analysierenden Bild angezeigt wird, bestimmen Sie die Intensitätsintervalle für die Phasen G1, S und G2 und stellen Sie sicher, dass diese in den nachfolgenden Filterobjektschritten der Rohrleitung eingetragen sind und dass diese Schritte aktiv sind. Klicken Sie dann erneut auf die Schaltfläche Ausführen, um mit der zweiten Hälfte der Pipeline fortzufahren. Schauen Sie sich die drei Bilder mit den Überlagerungen an, die die verschiedenen Zellzyklusstadien G1, S oder G2 darstellen, und wählen Sie die Zellkerne in G1 oder G2 für die weitere Bildgebung aus, so dass die Menge an DNA in Basenpaaren der Bildkerne bekannt ist.

Platzieren Sie die Zellen auf dem Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskop und stellen Sie sicher, dass der FPALM-Prozess ordnungsgemäß blinkt. Nehmen Sie zunächst einen 3D-Stack des ausgewählten Nukleus mit nur 500 Frames pro Slice auf. Auf diese Weise kann die relative Menge an DNA im Mittelteil bestimmt werden, die später mit viel mehr Bildern abgebildet wird, um ihre Ultrastruktur zu enthüllen.

Beginnen Sie die Aufnahme der Bildserie mit einer Belichtungszeit von 50 Millisekunden, was zu einer Bildrate von ca. 20 Bildern pro Sekunde führt. Führen Sie einen Z-Stack mit 200-Nanometer-Schritten und nur 500 Bildern pro Lichtoptikabschnitt durch den Zellkern. Nachdem der Stapel erfasst wurde, kehren Sie zur ursprünglichen Z-Position zurück und erfassen Sie den Hauptdatensatz von 50.000 Bildern mit der gleichen Belichtungszeit von 50 Millisekunden.

Öffnen Sie den FPALM-Datensatz in ImageJ. Um die Einstellungen für die Erkennung von Blinksignalen zu optimieren, klicken Sie auf ThunderSTORM und dann auf Analyse ausführen. Wählen Sie nun Kamera-Setup.

Geben Sie die korrekte Pixelgröße der Bilddaten, die A/D-Anzahl, die Quanteneffizienz der verwendeten Kamera, den Basispegel und die EM-Verstärkung ein und klicken Sie dann auf OK. Wählen Sie den Algorithmus aus, um die Lokalisierungskoordinaten zu bestimmen, indem Sie die Blinksignale anpassen. Verwenden Sie im Abschnitt Bildfilterung den Wavelet-Filter B-Spline mit einer B-Spline-Ordnung 3 und einer B-Spline-Skala 2. Legen Sie dann die Methode zur ungefähren Lokalisierung von Molekülen auf Lokales Maximum, den Schwellenwert für die Spitzenintensität und die Konnektivität auf 8-Nachbarschaft fest.

Wählen Sie im Abschnitt Subpixel-Lokalisierung von Molekülen als Methode die Option PSF-integrierten Gaußschen Winkel aus, setzen Sie Anpassungsradius px auf 3, wählen Sie Anpassungsmethode als Maximale Wahrscheinlichkeit aus, und legen Sie Anfangssigma auf 1,6 fest. Klicken Sie dann auf OK, um die Erkennung der Signale und die Rekonstruktion des Bildes zu starten. Wenn die Erfassung in verschiedene Bildstapel partitioniert ist, verketten Sie die Lokalisierungstabellen in ThunderSTORM.

Klicken Sie dazu im Popup-Fenster auf Importieren. Stellen Sie sicher, dass die Option An aktuelle Tabelle anhängen aktiviert ist und dass die korrekte Startnummer verwendet wird, um zu vermeiden, dass Lokalisierungen in der Tabelle überschrieben werden. Wählen Sie dann den Dateipfad aus und klicken Sie auf OK, um eine Datei nach der anderen zu importieren.

Um eine Überzählung der Signale über aufeinanderfolgende Frames zu verhindern, führen Sie die Lokalisierungsdaten mit dem maximalen Abstand von 20 Nanometern, 1 maximalen Off-Frames und 0 maximalen Frames pro Molekül zusammen und klicken Sie dann auf "Merge". Um die Abweichung durch Kreuzkorrelation von Datenunterabschnitten zu messen und zu korrigieren, öffnen Sie das Menü Abweichungskorrektur, und klicken Sie auf die Pfeile. Fügen Sie 3 Bins hinzu und stellen Sie die Vergrößerung auf 5 ein.

Klicken Sie dann auf Übernehmen, und das Fenster mit der x- und y-Abweichung wird angezeigt. Um die Signalmenge zu bestimmen, die proportional zum DNA-Gehalt in jedem Slice des aufgezeichneten 3D-Stacks mit 500 Frames für jeden Slice ist, wählen Sie Plugins, dann ThunderSTORM, gefolgt von Import/Export und importieren Sie die Ergebnistabelle für den ersten Slice des Stacks. Um eine Überzählung von Signalen aus anderen Bildebenen des 3D-Stacks zu vermeiden, müssen Signale von außerhalb des 200-Nanometer-Schrittintervalls in z zwischen den Schichten entfernt werden.

Drücken Sie auf Histogramm plotten, wählen Sie im geöffneten Dialogfeld Verteilung z und drücken Sie OK. Bestimmen Sie die Position des Peaks und wählen Sie über das Filterfeld die Signale mit der optischen Schrittweite von 200 Nanometern aus. Klicken Sie auf Visualisierung, wählen Sie die Option Histogramme und klicken Sie dann auf OK. Speichern Sie das resultierende Bild in einem Ordner im TIFF-Format. Öffnen Sie alle Slices, und kombinieren Sie sie mit Bild, gefolgt von Stapeln und dann Bildern zum Stapeln.

Nachdem Sie den gesamten Bildbereich ausgewählt haben, gehen Sie zu Analysieren, klicken Sie auf Tools und wählen Sie den ROI-Manager aus. Klicken Sie auf Hinzufügen, dann auf Analysieren, gefolgt von Messungen festlegen und wählen Sie Integrierte Dichte. Wählen Sie nun die Option Mehr, wählen Sie Multi Measure, aktivieren Sie Alle Stacks messen sowie Eine Zeile pro Slice.

Klicken Sie auf OK, und die Ergebnisse werden angezeigt. Die Summe der Intensitäten aller Schichten ist proportional zum DNA-Gehalt des gesamten Zellkerns, so wie die Intensitäten der einzelnen Schichten proportional zu ihrem Anteil am gesamten Genom sind. Nachdem Sie die Ergebnistabelle der Mittelebene geöffnet haben, die die Signale von 50.000 Frames enthält, filtern Sie sie auf eine Dicke von 100 Nanometern.

Erstellen Sie das Histogramm der resultierenden Signale, wie zuvor gezeigt, und messen Sie die integrierte Dichte des Mittelteils. Konvertieren Sie die große ThunderSTORM-Lokalisierungstabelle, die die ultrastrukturellen Informationen aus dem mittleren Bereich enthält, aus dem csv-Format in das ORTE-Format, indem Sie das MATLAB-Skript TS2orte ausführen. m, das die Lokalisierungstabelle in eine MATLAB-Matrix umwandelt und im MAT-Format speichert.

Wechseln Sie in den Ordner LAND-voronoi und öffnen Sie im Unterordner coreAlgorithm die Datei voronoicluster. m und passen Sie den DNA-Gehalt, den Anteil des beobachteten Mittelabschnitts der gesamten Kernfraktions-DNA und die Lokalisationen sowie den Umrechnungsfaktor entsprechend dem verwendeten Zelltyp und der Zellzyklusstufe für die absoluten Dichteberechnungen an. Bearbeiten Sie das Skript, das die Analyse startet voronoi.m.

Passen Sie den Dateipfad an die Orte-Lokalisierungsdaten und den Ausgabeordner für die Ergebnisdateien an. Geben Sie die Koordinaten an, die den Bereich definieren, in dem die Tessellation durchgeführt werden soll. Definieren Sie mehrere Bereiche, die innerhalb desselben Eingabedatasets berechnet werden sollen.

Suchen Sie nach dem Ausführen des Skripts nach dem Bild, das die absoluten DNA-Dichten zeigt, zusammen mit anderen Dateien, die Diagramme enthalten, die das Histogramm der Flächenverteilung und eine Dichte zeigen. m-Datei, die die Dichten jeder einzelnen berechneten Voronoi-Zelle im Ausgabeordner enthält. Die FPALM-Messung, bestehend aus 50.000 Frames, ergab 2,68 mal 10 hoch 6 detektierte Lokalisationen innerhalb eines 100 Nanometer dicken Mittelteils.

Die Lokalisierungsgenauigkeit des rekonstruierten Bildes betrug 10 Nanometer. Die große Anzahl von Lokalisationen ermöglichte die Kombination von hochauflösender Bildgebung mit der Darstellung absoluter DNA-Dichten. Es zeigte sich, dass die gemessenen DNA-Dichten nicht gleichmäßig über den Zellkern verteilt waren und einen großen Dynamikbereich abdeckten.

Höhere Vergrößerungen von Bereichen innerhalb des Zellkerns, die größere Voronoi-Zellen zeigten, deuteten auf eine niedrige DNA-Dichte hin, während kleinere Zellen auf eine hohe DNA-Dichte hindeuteten. DNA-Dichten, die in einem G1C3H10T halben Zellkern gemessen wurden, zeigten die absolute DNA-Dichteverteilung innerhalb des Zellkerns eines anderen Typs und einer anderen Spezies. Obwohl die grundlegende Organisation wie der frühe G1-HeLa-Kern aussah, besaß er zusätzlich konstitutive Cluster von parazentrischem Heterochromatin.

In einem G2-Kern wurden trotz einer leicht erhöhten Kerngröße keine dramatischen architektonischen Veränderungen beobachtet. Der mit TSA behandelte HeLa-Zellkern zeigte bemerkenswerte Unterschiede in Bezug auf die Kerntopographie und die DNA-Dichte. Mit Ausnahme des peripheren Heterochromatins, das Inseln mit höherer DNA-Dichte aufwies, sah der Rest des Chromatins viel homogener und dekondensierter aus.