Auf der Suche nach der Dynamik struktureller Varianten in experimentell entwickelten Populationen
3. Februar 2023
Wir haben eine kostengünstige Methode entwickelt, um die Alleldynamik von Nicht-Einzelnukleotid-Polymorphismen zu verfolgen, die leicht an experimentelle Evolutionsarchive angepasst werden kann. Eine Triplett-PCR-Technik wurde mit einer automatisierten parallelen Kapillarelektrophorese gekoppelt, um die relative Häufigkeit eines Insertionsallels im Verlauf der experimentellen Evolution zu quantifizieren.
Strukturelle Varianten wie Insertionen, Deletionen, Duplikationen und Inversionen waren in der Vergangenheit experimentell schwieriger zu verfolgen, und ihre Frequenzen können durch Amplikonsequenzierung nicht genau gemessen werden. Hier stellen wir eine einfache, kostengünstige Technik zur Verfügung, die das dreifache Primerdesign und die parallele Kapillarelektropherese koppelt, um strukturelle variante Allelfrequenzen im Laufe der Zeit zu verfolgen. Diese Methode wurde entwickelt, um die Endpunktsequenzierung in der experimentellen Evolution zu ergänzen und die Häufigkeiten neu auftretender De-novo-Allele zu verfolgen.
Wir hoffen, dass diese Methode auch denjenigen zugute kommt, die mit Intra-Host-Pathogendaten arbeiten. Das Verfahren wird von Jeanne Hamet, einer wissenschaftlichen Mitarbeiterin aus unserem Labor, demonstriert. Die verschiedenen Schritte der Methoden werden in einem Fall gezeigt, in dem das abgeleitete Allel aus einer IS10-Insertion in ein bakterielles Gen namens mutS resultiert.
Entwerfen Sie zunächst ein Paar Primer, um ein kurzes Amplikon auf dem Wildtyp-Allel um die mutierte Insertionsstelle herum zu amplifizieren. Entwerfen Sie einen dritten Primer vorwärts Primer zwei innerhalb der Insertionssequenz, um eine leichte Größenvariable aus dem Wildtyp-Amplikon zu erzeugen. Beginnen Sie mit der Extraktion von DNA aus 24-Stunden-Kulturen von fixierten Wildtyp- und mutierten Allelklonen.
Nach der Quantifizierung der DNA verdünnen Sie jeden DNA-Extrakt mit Wasser auf fünf Nanogramm pro Mikroliter. Fixieren Sie die beiden Proben im Verhältnis 50/50. Richten Sie eine 20-Mikroliter-Reaktion ein, die 10 Nanogramm DNA-Probe, Primer und PCR-Mastermix enthält.
Als nächstes trennen Sie das PCR-Produkt durch Elektrophorese unter Verwendung eines 2%igen Agarosegels. Der Größenunterschied zwischen den Amplikons des Wildtyps und der Mutante muss auf dem Gel nachgewiesen werden. Um eine Kalibrierungskurve zu erhalten, mischen Sie zunächst die Wildtyp-DNA und die mutierte DNA in verschiedenen Verhältnissen.
Verdünnen Sie die PCR-Produkte auf eine Konzentration von 0,1 Nanogramm pro Mikroliter. Um das Trenngel herzustellen, mischen Sie das frische Gel und den Farbstoff. Ersetzen Sie den Einlasspuffer.
Platzieren Sie den Spülpuffer an der richtigen Schubladenposition des Instruments mit paralleler Kapillarelektrophorese. Geben Sie 22 Mikroliter des Verdünnungsmarkers in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte. Geben Sie nun zwei Mikroliter der verdünnten PCR-Produkte in jede Probenvertiefung.
Fügen Sie zu einem Nun, fügen Sie eine DNA-Größenleiter aus einem hochempfindlichen Kit hinzu, das von einem bis 6.000 Basenpaaren groß ist. Platzieren Sie die Mikrotiterplatte im Auswahllauf der Gerätesoftware in das Instrument für die parallele Kapillarelektrophorese. Analysieren Sie die Ergebnisse mit der Datenanalysesoftware.
Identifizieren Sie zunächst die Peaks anhand ihrer bekannten Größe. Quantifizieren Sie jedes Amplikon, um eine Kalibrierungskurve zu erstellen. Überprüfen Sie schließlich, ob die relativen Mengen der beiden Allele korrekt gemessen werden.
Diese Kalibrierkurve wird dann verwendet, um die Anzahl der Strukturvarianten nach PCR-Amplifikation und paralleler Kapillarelektrophorese zu berechnen. Diese repräsentativen Ergebnisse folgen einer störenden Insertion in das mutS-Gen. Knockdowns und MutS führen zu einem Hypermutator-Phänotyp, der es Bakterien ermöglicht, mehr Mutationen zu untersuchen als ihre Basismutationsrate.
Mit der vorgestellten Methode wurde die strukturelle Variantenfrequenz von mutS über 1000 Generationen verfolgt. Es wurde eine nicht-monotone Flugbahn des entstehenden mutierten Allels aufgedeckt. Das mutierte Allel wurde erstmals in Generation 680 nachgewiesen.
Die Häufigkeit des Allels nahm dann rasch zu und erreichte bei Generation 713 67 %. Dieser Anstieg stagnierte dann und stieg in den nächsten 53 Generationen nur um 10 % auf 76 % Unerwarteterweise sank die Häufigkeit des mutierten Allels im Laufe von 13 Generationen von 76 % auf 49 %, woraufhin sie zur Fixierung anstieg. Diese Methode wird denjenigen zugute kommen, die an der experimentellen Evolution arbeiten.
Dieses Protokoll ermöglicht es dem Benutzer, eingefrorene Archive zu entnehmen und evolutionäre Trajektorien zu untersuchen, die sonst mit Endpunktsequenzierungsdaten nicht beobachtbar sind.
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Überblick
Diese Studie präsentiert eine neuartige, kostengünstige Methode zur Verfolgung der Dynamik struktureller Varianten-Allele, insbesondere Insertionen, während der experimentellen Evolution. Durch die Kombination von Triplett-Primer-Design mit paralleler Kapillarelektrophorese kann die Technik Allelfrequenzänderungen im Laufe der Zeit aufzeigen und damit ihren Nutzen für die Untersuchung evolutionärer Trajektorien demonstrieren.
Wichtige Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Genetik
- Experimentelle Evolution
- Strukturelle Varianten
Hintergrund
- Strukturelle Varianten waren mit herkömmlichen Methoden schwierig zu quantifizieren.
- Die Amplifikation und Messung von Insertion-Allelfrequenzen ist entscheidend für das Verständnis ihrer Rollen in der Evolution.
- Die Methode zielt darauf ab, bestehende Sequenzierungstechniken zu ergänzen.
Verwendete Methoden
- Triplett-PCR-Technik gekoppelt mit automatisierter paralleler Kapillarelektrophorese
- Bakterien-Modellsystem (mutS-Gen)
- Quantitative Bewertung von Allelfrequenzen
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Verfolgung einer nicht-monotonen Trajektorie eines mutS-Allels über 1000 Generationen.
- Aufgedeckt komplexe Dynamiken, bei denen die Mutationsfrequenz zunächst anstieg, dann abnahm, bevor sie fixiert wurde.
- Demonstrierte Anwendung bei der Analyse fixierter gefrorener Proben für evolutionäre Studien.
Schlussfolgerungen
- Die Studie stellt eine robuste Methode zur Beobachtung struktureller Variantendynamiken vor, die durch Endpunktsequenzierung sonst übersehen werden.
- Dieser Ansatz bietet bedeutende Implikationen für Forscher, die experimentelle Evolution und Pathogendynamik untersuchen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Quantifying structural variant (SV) allele dynamics is critical for understanding genetic adaptation and phenotypic diversity in microbial and pathogen populations. This method enables precise, cost-effective tracking of SV frequencies, addressing a key gap in discovery-stage genomics and supporting predictive confidence in variant-driven functional studies. Its scalability and compatibility with pooled samples position it as a valuable tool for early discovery and translational research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative tracking of SV allele frequencies to clarify variant-driven phenotypes.
- Supports functional target validation by monitoring de novo allele emergence in evolving populations.
- Facilitates mechanistic de-risking by revealing non-monotonic variant trajectories over time.
Screening & Assay Development
- Prepares validated biological systems for downstream screening by quantifying SVs in pooled samples.
- Standardizes SV detection with reproducible primer design and capillary electrophoresis readouts.
- Enables scalable, parallelized analysis suitable for high-throughput variant screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by enabling SV quantification in intra-host pathogen populations.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by tracking variant dynamics in archived samples.
- Provides predictive value for risk-adjusted advancement decisions in microbial and pathogen research.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling dynamic SV tracking from early hypothesis testing through translational research, especially in microbial and pathogen systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying emerging SVs.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative SV measurements for assay readiness.
- Analytics: Provides calibration-based quantification and comparative analysis of allele frequencies.
- Translational Research: Enables SV tracking in natural and intra-host populations, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly applicable, cost-effective workflow for SV quantification across diverse projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in SV-driven studies.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible SV quantification.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by clarifying variant impact early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of SV-related targets and models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primer design and capillary electrophoresis instrumentation.
- Needs access to parallel capillary electrophoresis and quantitative analysis software.
- Demands cross-team standardization of calibration and normalization protocols.
- Adaptable to various SV types and pooled sample contexts with appropriate primer sets.
- Limited by requirement for detectable amplicon size differences and calibration accuracy.
