Erzeugung menschlicher Blutgefäß-Organoide aus pluripotenten Stammzellen

Dieses Protokoll beschreibt unsere Erzeugung von Organoiden menschlicher Blutgefäße aus pluripotenten Stammzellen. Diese Technologie kann verwendet werden, um Aspekte der Vaskulogenese, Angiogenese, Gefäßerkrankungen sowie vaskuläre Pathologien zu untersuchen. Die Reproduzierbarkeit und der hohe Durchsatz sowie die Konsistenz über viele verschiedene Stammzelllinien hinweg sind starke Vorteile dieser Technik.

In Bezug auf ihre Anwendung skizzieren einige unserer früheren Forschungsarbeiten die Verwendung von Blutgefäßorganoiden zur Untersuchung der morphologischen Veränderungen für das Gefäßsystem von Diabetikern und erforschen medikamentöse Behandlungsmöglichkeiten für diabetische Vaskulopathie. Die ordnungsgemäße Aufrechterhaltung der ursprünglichen Stammzellpopulation, die Verhinderung der Verklumpung der Aggregate und die Gewährleistung eines nahezu homogenen Aggregatdurchmessers sind wesentliche Faktoren für die Erzeugung guter Blutgefäßorganoide. Beginnen Sie mit der Erzeugung von Aggregaten unter Verwendung kultivierter humaner pluripotenter Stammzellen (hPSCs) mit einer Konfluenz von 70 %.

Mit einer Pipette oder einem Vakuumsystem wird das Nährmedium abgesaugt und durch einen Milliliter Zelldissoziationsreagenz ersetzt, bevor die Zellen fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubiert werden. In der Zwischenzeit wird das erforderliche Volumen des Aggregationsmediums in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen gemäß der im Textmanuskript genannten Formulierung hergestellt. Nach der Inkubation der Zellen wird das Zelldissoziationsreagenz abgesaugt, bevor die Zellen in einem Milliliter Aggregationsmedium suspendiert werden.

Pipettieren Sie den Inhalt vorsichtig auf und ab, um eine einzellige Suspension zu erzeugen. Zählen Sie die Zellen mit einem automatischen Zellzählgerät oder unter einem Mikroskop und berechnen Sie die Gesamtzahl der Zellen, die für die Aggregatbildung erforderlich sind. Die Viabilitätsanzeige der Zellen zeigt eine Einzelzellsuspension mit geringen bis gar keinen Clustern.

Saugen Sie den Überstand aus dem Röhrchen ab und geben Sie das entsprechende Volumen der Zellsuspension in das Aggregationsmedium in dem 15-Milliliter-Kegelröhrchen aus hochklarem Polypropylen und pipettieren Sie die verdünnte Zellsuspension vorsichtig auf und ab, um eine homogene Zellverteilung zu gewährleisten. Pipettieren Sie drei Milliliter der verdünnten Zellsuspension in jede gewünschte Vertiefung der Sechs-Well-Kulturplatte mit extrem niedriger Bindung. Legen Sie die Platte in den Inkubator und minimieren Sie jegliche Störungen, um die Größe und Form der Aggregate zu erhalten.

Bereiten Sie das Mesodermmedium wie im Textmanuskript beschrieben vor. 24 Stunden nach der Aussaat der Zellen die Kulturplatte aus dem Inkubator nehmen. Schwenken Sie die Platte in kreisförmigen Bewegungen, um die Aggregate in der Mitte jedes Brunnens anzusammeln.

Mit einer Ein-Milliliter-Pipette werden die Aggregate mit dem Medium aus jeder Vertiefung vorsichtig in das entsprechende konische Röhrchen überführt. Lassen Sie die Aggregate eine Stunde lang in den konischen Rohren bei Raumtemperatur sedimentieren. Nach dem Sedimentieren wird der Überstand vorsichtig mit einer Pipette oder einer hochempfindlichen Ansaugpumpe angesaugt, ohne die abgesetzten Aggregate zu stören.

Resuspendieren Sie die Aggregate in jedem Röhrchen, indem Sie zwei Milliliter Mesoderm-Induktionsmedium hinzufügen. Als nächstes übertragen Sie die Suspension aus jedem Röhrchen zurück in die entsprechende Vertiefung der Sechs-Well-Kulturplatte mit extrem niedrigem Aufsatz. Stellen Sie den Teller bei 37 Grad Celsius in den Inkubator und lassen Sie ihn bis zum vierten Tag stehen.

Nehmen Sie am vierten Tag die Kulturplatte aus dem Inkubator und schütteln Sie die Platte dann in kreisenden Bewegungen, um die Aggregate in der Mitte jeder Vertiefung zu sammeln. Mit einer Ein-Milliliter-Pipette werden die Aggregate mit dem umgebenden Medium aus jeder Vertiefung vorsichtig in das entsprechende konische Rohr überführt. Stellen Sie einen Timer auf 30 Minuten, damit sich die Zuschlagstoffe in den Rohren absetzen können.

Sobald die Aggregate sedimentiert sind, bereiten Sie die Kulturplatten wie zuvor gezeigt vor und legen Sie sie bis zum sechsten Tag bei 37 Grad Celsius in den Inkubator. Für die Einbettung von Aggregaten und die Induktion von Gefäßsprossen wird das gewünschte Endvolumen der extrazellulären Matrixlösung vorbereitet, während auf Eis gearbeitet wird. Pipettieren Sie 500 Mikroliter des ECM in eine Vertiefung einer 12-Well-Platte, um die erste Schicht des ECM-Sandwiches zu bilden.

Um eine effektive Polymerisation der ersten ECM-Schicht zu gewährleisten, legen Sie die Platte für zwei Stunden in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius. Gegen Ende der zweistündigen Inkubationszeit beginnen Sie mit der Arbeit mit den Aggregaten in der Kulturplatte. Sammeln Sie die Aggregate in der Mitte jeder Vertiefung, bevor Sie die Aggregate und das Medium mit einer Ein-Milliliter-Pipette vorsichtig aus jeder Vertiefung in ein entsprechendes konisches 15-Milliliter-Rohr überführen.

Lassen Sie die Aggregate 10 bis 15 Minuten ruhen, bevor Sie den Überstand ansaugen. Halten Sie anschließend die konischen Röhrchen mit den Aggregaten fünf Minuten lang auf Eis. Arbeiten Sie schnell und vorsichtig und resuspendieren Sie die Aggregate in 500 Mikrolitern ECM ohne Blasenbildung.

Schichten Sie die ECM-Aggregatsuspension mit einer Pipette auf die bereits polymerisierte erste ECM-Schicht innerhalb des Wells in der 12-Well-Platte. Bereiten Sie in der Zwischenzeit das Keimmedium wie im Textmanuskript beschrieben vor. Nach zweistündiger Inkubation bei 37 Grad Celsius wird ein Milliliter auf 37 Grad Celsius vorgewärmtes Keimmedium in die Vertiefung gegeben, um eine Differenzierung der Blutgefäße zu induzieren.

Verwenden Sie unter sterilen Bedingungen das abgerundete Ende eines sterilen Spatels, um die EZM-Sprossungsmatrix zu lösen, die die Gefäßnetzwerke enthält. Anschließend wird die gelöste Gelscheibe mit einer sterilen Pinzette und dem abgerundeten Ende eines sterilen Spatels vorsichtig auf den Deckel einer 10-Zentimeter-Kulturschale übertragen. Legen Sie das Gel unter ein Stereomikroskop, das auf die gewünschte Vergrößerung und den gewünschten Fokus eingestellt ist, auf den Deckel und schneiden Sie mit sterilen Nadeln einzelne Blutgefäßnetzwerke heraus, um die Menge der dabei erhaltenen nicht-vaskularisierten EZM zu begrenzen.

Übertragen Sie die isolierten Organoide vorsichtig zurück in eine Vertiefung einer Sechs-Well-Platte mit extrem niedrigem Aufsatz, die drei Milliliter Keimmedium enthält. Anschließend werden die einzelnen Organoide mit einer Ein-Milliliter-Pipette in die entsprechende Anzahl von Vertiefungen in einer 96-Well-Platte mit extrem niedrigem Aufsatz übertragen. Geben Sie nach dem Transfer 200 Mikroliter vorgewärmtes Keimmedium in jede Vertiefung der 96-Well-Platte.

Stellen Sie vier bis sechs Tage nach der Isolierung in der 96-Well-Platte sicher, dass die Organoide eine runde und gesunde Morphologie besitzen, bevor Sie mit der Fixierung und Färbung fortfahren. Bilder des schrittweisen Fortschreitens der Erzeugung des menschlichen Blutgefäßorganoids (hBVO) aus hPS-Zellen wurden unter Hellfeld aufgenommen. Am Tag Null wurden aus der hPSC-Kultur Aggregate mit einem Durchmesser von 30 bis 100 Mikrometern erzeugt.

Subtile Veränderungen in der Größe und Form der Aggregate wurden bei der Induktion des Mesoderms am ersten Tag beobachtet, die sich am vierten Tag weiter änderten, als die Aggregate einem vaskulären Priming unterzogen wurden. Eine nahezu radialsymmetrische frühe Gefäßkeimung kann am siebten Tag, einen Tag nach der Einbettung der Aggregate in die Keimmatrix, beobachtet werden. Am neunten Tag wurde eine gesunde organoide Morphologie und ein fortgesetztes Gefäßsprießen beobachtet, das sich bis zum 10. Tag zu Gefäßen im Spätstadium entwickelte, als die dichten Zellstrukturen im Organoidzentrum fast verschwanden.

Die für reife menschliche Blutgefäßorganoide typische Morphologie wurde an Tag 15 deutlich beobachtet. Die Whole-Mount-Färbung der reifen hBVOs an Tag 15 zeigte ein ausgedehntes und zusammenhängendes endotheliales Netzwerk, das CD31-positiv war und von PDGFR-beta-positiven Parasiten und SMA-positivem alpha-glattem Muskelaktin umgeben war. Die PDGFR-beta-positiven und SMA-positiven Wandzellen, die die endothelialen Gefäßnetzwerke einkapseln, sind gut beobachtet.

Eine kontinuierliche Kollagen-IV-positive Basalmembran, die die Gefäßnetzwerke umhüllt, wurde ebenfalls beobachtet. Die Gewährleistung einer ordnungsgemäßen Polymerisation der extrazellulären Matrix während des Einbettungsschritts ist entscheidend für eine effektive Sprossung der Blutgefäße. Forscher haben unsere Blutgefäß-Organoid-Technologie genutzt, um frühe vaskuläre Kompartimente in bereits etablierten Organoidmodellen wie Gehirn und Niere zu erzeugen, die zuvor avaskulär waren.