Entwicklung und Charakterisierung von dendritischen Zellen murinen Tolerogene

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist die Entwicklung und Charakterisierung tolerogener dendritischer Zellen von Mäusen für die Bewertung ihres immuntherapeutischen Nutzens bei der Behandlung von Autoimmunerkrankungen wie Multipler Sklerose. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der tolerogenen dendritischen Zelltherapie zu beantworten, indem sie eine standardisierte Methode für die Entwicklung und funktionelle Charakterisierung tolerogener dendritischer Zellen bereitstellt. Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass sie für die erfolgreiche Entwicklung tolerogener dendritischer Zellen und für funktionelle tolerogene Wirksamkeitstests von dendritischen Zellen verwendet werden kann.

Die Auswirkungen dieser Technik sind erheblich. Sie erstrecken sich auf die Entwicklung einer zellulären Immuntherapie für Autoimmunerkrankungen, da tolerogene dendritische Zellen eine abnormale Immunantwort zurücksetzen können, während sie intrinsischen Immunregulationsmechanismen unterliegen. Nach der Entnahme der Hinterbeinknochen von acht bis 10 Wochen alten C57BL/6-Mäusen gemäß den Standardprotokollen verwenden Sie chirurgische Klingen und Pinzetten, um so viel Gewebe wie möglich zu präparieren, und legen Sie die sauberen Tibias und Femure in eine sechs Zentimeter große Kulturschale mit 70 % Ethanol.

Schneiden Sie beide Enden der Knochen mit einer chirurgischen Klinge ab und spülen Sie mit einer Drei-Milliliter-Spritze, die mit einer 23-Gauge-Nadel ausgestattet ist, das Knochenmark vom ersten Knochen mit drei Millilitern PBS in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Wenn das gesamte Knochenmark gesammelt wurde, zentrifugieren Sie die Zellsuspension und suspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter Lysionspuffer für rote Blutkörperchen. Stoppen Sie nach fünf Minuten die Lyse mit neun Millilitern PBS und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation.

Resuspendieren Sie das weiße Knochenmarkzellpellet in 10 Millilitern Kulturmedium und filtrieren Sie die Zellen durch ein 40-Mikrometer-Zellsieb in ein neues Röhrchen. Stellen Sie die Zellen auf eine Konzentration von eins mal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter in Kulturmedium ein, das mit GM-CSF und IL-4 ergänzt ist. Und geben Sie drei Milliliter Zellen in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte für eine dreitägige Inkubation bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Waschen Sie die Zellen in jeder Vertiefung am dritten Tag mit zwei Millilitern PBS und schwenken Sie sie leicht, um die nicht anhaftenden Zellen zu entfernen. Füttern Sie dann die Zellen mit drei Millilitern frischem Kulturmedium, das mit GM-CSF und IL-4 ergänzt ist, und geben Sie die Zellen wieder in den Zellkultur-Inkubator, indem Sie nach zwei Tagen drei weitere Milliliter frisches Kulturmedium, ergänzt mit Zytokinen, in jede Vertiefung geben. Legen Sie am siebten Tag der Kultur den Teller auf Eis.

Nach 10 Minuten pipettieren Sie das Kulturmedium vorsichtig in jede Vertiefung, um die lose haftenden, unreifen dendritischen Zellen aus dem Knochenmark in Suspension zu entfernen. Anschließend werden die Zellen für die Entnahme durch Zentrifugation gepoolt und das Pellet für die anschließende nachgelagerte Analyse in das entsprechende Volumen an frischem Kulturmedium resuspendiert. Um die syngene T-Zellproliferation zu messen, verwenden Sie zunächst das hintere Ende eines Drei-Milliliter-Spritzenkolbens, um eine Milz von einer acht bis 10 Wochen alten OT2 C57BL/6-Maus durch ein 40-Mikrometer-Zellsieb zu zerdrücken und das Sieb mit PBS zu spülen.

Pelletieren Sie die gepoolte Zellsuspension durch Zentrifugation und resuspendieren Sie das Pellet in 400 Mikrolitern magnetischem Zellsortierpuffer und 100 Mikrolitern CD4-positivem T-Zell-Biotin-Antikörper-Cocktail bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Am Ende der Inkubation geben Sie 300 Mikroliter Sortierpuffer und 200 Mikroliter Anti-Biotin-Kügelchen für eine 10-minütige Inkubation bei vier Grad Celsius in die Zellen und setzen Sie eine magnetische Bead-Säule und einen Vorabscheidungsfilter in einen Zelltrennmagneten geeigneter Größe ein. Spülen Sie die Säule mit drei Millilitern Sortierpuffer und geben Sie neun Milliliter Sortierpuffer in die Zellen.

Nach der Zentrifugation resuspendieren Sie die Zelle und das Bead-Pellet in drei Millilitern Sortierpuffer und geben Sie die Zellsuspension in die Säule, um das CD4-positive T-Zell-Eluat in einem geeigneten Behälter zu sammeln. Waschen Sie dann die Säule mit weiteren drei Millilitern Sortierpuffer, fangen Sie den Durchfluss auf und legen Sie die T-Zellen auf Eis. Für die Isolierung von syngenen Milzpan-dendritischen Zellen legen Sie die Milz einer acht bis zehn Wochen alten C57BL/6-Maus in eine sechs Zentimeter lange Kulturschale und injizieren Sie mit einer Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer 25-Gauge-Nadel ausgestattet ist, zweimal einen Milliliter Kollagenase D-Lösung in die Milz.

Schneiden Sie anschließend die Milz mit einer Schere in kleine Stücke und inkubieren Sie die Stücke unter Schütteln bei Raumtemperatur 25 Minuten lang. Am Ende der Inkubation geben Sie 500 Mikroliter 0,5 molare EDTA in die Gewebeaufschlämmung für eine letzte fünfminütige Inkubation bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation wird die Milzaufschlämmung mit dem hinteren Ende eines Drei-Milliliter-Spritzenkolbens durch ein 40-Mikrometer-Zellensieb zerdrückt und die Zellen durch Zentrifugation gesammelt.

Resuspendieren Sie das Pellet in 350 Mikrolitern magnetischem Zellsortierpuffer, 50 Mikrolitern Fc-Rezeptor-Blockierungsreagenz und 100 Mikrolitern pan dendritischen Zell-Biotin-Antikörper-Cocktail für eine 10-minütige Inkubation bei vier Grad Celsius. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Zellen in neun Millilitern Sortierpuffer und resuspendieren Sie das Pellet in 800 Mikrolitern frischem Sortierpuffer mit 200 Mikrolitern Anti-Biotin-Kügelchen bei vier Grad Celsius für 10 Minuten, um die dendritische Zellpopulation der Milzpfanne durch magnetische Kügelchensortierung zu isolieren, wie gerade gezeigt. Resuspendieren Sie die Zellen in einer Konzentration von zweimal 10 bis zum fünften dendritischen Zellen pro Milliliter und behandeln Sie sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius mit der entsprechenden experimentellen Konzentration des interessierenden Triterpenoids.

Während des letzten Drittels der Inkubation resuspendieren Sie die T-Zellen in einer Konzentration von eins mal 10 bis zum siebten Zellen pro Milliliter in einer mikromolaren CFSE für 15 Minuten bei 37 Grad Celsius. Waschen Sie dann die Zellen mit PBS und stellen Sie das Volumen auf eine Endkonzentration von zwei mal 10 bis zum sechsten T-Zellen pro Milliliter ein. 100 Mikroliter der behandelten dendritischen Zellen werden mit 100 Mikrolitern der CFSE-markierten CD4-positiven T-Zellen in jeder Vertiefung einer 96-Well-Platte co-kultiviert und 100 Nanogramm pro Milliliter OVA-Peptid 323-329 zu den Zellen hinzugefügt, wobei die CFSE-Intensität der T-Zellen durch Durchflusszytometrie nach zwei bis drei Tagen Inkubation gemessen wird.

Knochenmarkvorläuferzellen, die in Vollmedium in Gegenwart von GM-CSF und IL-4 kultiviert wurden, weisen nach sechs Tagen in Kultur eine unreife dendritische Zellmorphologie auf. Die Analyse von unreifen dendritischen Zellen aus dem Knochenmark am siebten Tag zeigt die robuste Expression von CD11c, einem spezifischen dendritischen Zellmarker der Maus, durch die Mehrheit der kultivierten Zellen. Trotz des fehlenden Einflusses auf die Expression von LPS-induzierten Reifungsmarkern zeigen dendritische Zellen aus dem Knochenmark als Reaktion auf die CDDO-DFPA-Behandlung ein tolerogenes dendritisches Zellprofil, was sich in einer signifikanten Verringerung der proinflammatorischen Genexpression und einer erhöhten antiinflammatorischen Zytokin-Genexpression zeigt, selbst nach LPS-Stimulation.

Darüber hinaus wird eine signifikante Verringerung der syngenen OVA-spezifischen T-Zellproliferation in in In-vitro-Cokulturen beobachtet, in denen OVAs von CDDO-DFPA-behandelten dendritischen Zellen präsentiert werden, und in vivo, was sich in einer verzögerten Progression zu einer experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis nach der Injektion von MOG-gepulsten CDDO-DFPA-behandelten dendritischen Zellen zeigt, was den tolerogenen Phänotyp dieser Zellen weiter bestätigt. Sobald diese Technik beherrscht ist, können tolerogene dendritische Zellen innerhalb von acht Tagen entwickelt werden, wenn die Experimente ordnungsgemäß durchgeführt werden. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass tolerogene dendritische Zellen nicht homogen sind.

Ihr zellulärer Phänotyp hängt von der Art der Wirkstoffe ab, die zur Induktion ihrer Toleranz verwendet werden. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden, wie z.B. eine detaillierte durchflusszytometrische Analyse, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur tolerogenen dendritischen Zell-induzierten antigenspezifischen T-Zell-Energie oder Apoptose oder zur Fähigkeit der T-Zell-Differenzierung zu beantworten. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man mit bekannten Wirkstoffen funktionell aktive tolerogene dendritische Zellen entwickelt oder wie man die Fähigkeit neuer Substanzen testet, diese Zellen zu induzieren.