Anwendung von Langzeit kultiviert Interferon-γ Enzyme-linked Immunospot Assay zur Beurteilung Effektor und Gedächtnis-T-Zell-Antworten in Cattle

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, sowohl Effektor- als auch Gedächtnis-T-Zell-Antworten mit kurz- bzw. langfristig kultivierten Interferon-Gamma-L-Spot-Assays zu bewerten. Die Beurteilung der zentralen Gedächtnisreaktion erfolgt durch die Kultivierung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes von Rindern unter antigener Stimulation für 13 Tage. Die Langzeitkultur ermöglicht es, dass Effektor-T-Zell-Antworten auftreten und abnehmen.

Interleukin zwei wird den Kulturen zur Erhaltung der Gedächtnis-T-Zellen zugesetzt. Am Tag 13 werden die Langzeitzellen auf L-Spot-Platten übertragen, die mit IFN-Gamma-Capture-Antikörpern beschichtet sind. Die Reaktion von Langzeitzellen auf einzelne mykobakterielle Antigene wird entweder in Gegenwart oder Abwesenheit von autologen Antigen-präsentierenden Zellen untersucht.

APCs APCs werden durch Adhärenz an Tag 13 von frischen p BMCs isoliert. Zusätzlich wird die Reaktion von frisch isoliertem pbmc unter ex vivo Bedingungen als Korrelat der Effektorreaktionen untersucht. In mehreren Studien wurde gezeigt, dass die langfristige kultivierte Sbot-Reaktion von Rindern auf mykobakterielle Antigene nach der Impfung positiv mit der Wirksamkeit des Impfstoffs korreliert.

Außerdem enthalten Langzeit-T-Zellkulturen hauptsächlich zentrale Gedächtnis-T-Zellen sowohl bei Menschen als auch bei Rindern, um den Langzeit-kultivierten L-Spot-Assay durchzuführen. 60 ml Blut werden von m bovis infizierten oder geimpften Tieren durch Halsschlagader-, Venenpunktions- und P-BMCs durch Dichte isoliert. Gradienten-Zentrifugation.

Die Zellkonzentration sollte auf 4 Millionen Zellen pro ml eingestellt werden. In vollem Umfang beginnt RPMI Media mit der Beschichtung von 500 Mikrolitern mikrobakterieller Antigene, in diesem Fall TB 10.4 und Antigen 85 A sowie dem gereinigten Proteinderivat der Embovis-Kultur, genannt PPDB. Fügen Sie dann 500 Mikroliter pbmc hinzu, die von jedem Tier isoliert wurden, mit vier Replikaten pro Tier.

Beachten Sie, dass alle Vertiefungen stimuliert werden müssen. Kontrollen wie keine Stimulation oder Mitogene sind nicht erforderlich In diesem Schritt inkubieren Sie die Platte 13 Tage lang bei 39 Grad Celsius der normalen Temperatur von Rindern. Entsorgen Sie an den Tagen drei und sieben 500 Mikroliter aus jeder Vertiefung und pipettieren Sie vorsichtig, um die Zellschicht am Boden der Vertiefungen nicht zu stören.

Füllen Sie das Volumen mit vollständigem PMI auf, der IL Two enthält. Legen Sie die Platte in den Inkubator An Tag 10 verwerfen Sie 750 Mikroliter des Überstands aus jeder Vertiefung und füllen Sie sie mit vollständigem RPMI ohne IL zwei auf. An Tag 12 pipettieren und verwerfen Sie einen ml Überstand aus jeder Vertiefung, die mit vollständigem RPMI ohne IL zwei aufgefüllt wurde. Bereiten Sie auch die L-Spot-Platte für die Beschichtung mit IFM Gamma-Capture-Antikörper vor: Pipettieren Sie zuerst 15 Mikroliter 35 % Alkohol mit einer Mehrkanalpipette in jede Vertiefung: Dieser Schritt erhöht die Spot-Definition.

Sechsmal gut waschen mit 300 Mikrolitern PBS. Fügen Sie 100 Mikroliter Capture-Antikörper zu acht Mikrogramm pro ml in PBS hinzu. Das Pipettieren sollte bei allen Eingriffen sorgfältig durchgeführt werden, wobei die Pipettenspitzen die Membran am Boden der Vertiefung nicht berühren oder beschädigen dürfen, die Platte in eine Plastiktüte legen und über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren dürfen.

Entnehmen Sie am 13. Tag 60 ml Blut durch Punktion der Jugularvene von denselben Tieren, die am ersten Tag entnommen wurden. Isolieren Sie das pbmc und stellen Sie die Konzentration auf 2 Millionen Zellen pro ml ein. Beschriften Sie die L-Spotplatte für jeden Probensatz ordnungsgemäß.

Langzeitzellen plus APCs, Langzeitzellen ohne APCs und ex vivo Zellen. Entsorgen Sie den Capture-Antikörper aus den Ellis-Spotplatten-Waschvertiefungen mit 300 Mikrolitern PBS-haltigem Tween. Sechsmal wiederholen, wegwerfen, Flüssigkeit waschen und pipettieren.

50 Mikroliter frisch isolierte p BMCs werden in die Vertiefungen gegeben, die für Langzeitzellen vorgesehen sind. Plus APCs. Blockieren Sie andere Vertiefungen der L-Spot-Platte mit 200 Mikrolitern pro Vertiefung vollständiger RPMI-Platte, um den Phänotyp von Zellen durch Durchflusszytometrie parallel zur L-Spot-Assay-Platte zu bewerten.

50 Mikroliter frisch isolierter Zellen in einer ordnungsgemäß beschrifteten 96-Well-Platte mit rundem Boden. Hierbei handelt es sich um einen Zusatz-Assay, der in Verbindung mit dem Yellow-Spot-Assay durchgeführt wird, um den Phänotyp der reagierenden Zellen zu bestimmen. Inkubieren Sie die Platten 90 Minuten lang bei 39 Grad Celsius in einem 5%CO2-Inkubator, damit die Antigen-präsentierenden Zellen haften können.

Inkubieren Sie außerdem 200 mls vollständiges RPMI, um es während dieses 90-minütigen Inkubationsschritts aufzuwärmen. Ernten Sie die langfristig kultivierten Zellen aus der 24-Well-Platte. Kombinieren Sie die vierfachen Duplikate von jedem Tier in einem einzigen 15 mil konischen Röhrchen.

Zentrifugieren Sie die Röhrchen fünf Minuten lang bei 400 Gs. Entsorgen Sie den Überstand durch Röhrcheninversion, lösen Sie das Küvettenpellet und fügen Sie fünf ml PBS hinzu. Waschen Sie die Zellen zweimal und stellen Sie dann die Zellkonzentration auf 200.000 Zellen pro ml ein. Nach der 90-minütigen Inkubation nehmen Sie die LPO-Platte und das komplette RPMI aus dem Inkubator.

Legen Sie die LPO-Platte für 30 Sekunden auf einen Plattenschüttler. Entfernen Sie dann nicht adhärente Zellen durch Platteninversionspipette von 150 Mikrolitern pro Vertiefung mit warmem vollständigem RPMI. Schütteln Sie den Teller und entsorgen Sie die Waschflüssigkeit.

Wiederholen Sie dies dreimal, verwerfen Sie so viel Flüssigkeit wie möglich und geben Sie hundert Mikroliter pro Vertiefung jedes Antigens in die entsprechenden Vertiefungen mit anhaftenden APCs. Pipettieren Sie dann 100 Mikroliter Langzeit-Kulturzellsuspension pro Well. 200.000 Zellen pro ML in die Vertiefungen, die als Langzeitzellen plus APCs gekennzeichnet sind.

Stellen Sie sicher, dass die Langzeitzellen, die in diesem Schritt hinzugefügt wurden, von demselben Tier stammen wie die APCs, die sich bereits in der Vertiefung befinden. Mischen Sie keine APCs und langfristig kultivierte Zellen von verschiedenen Tieren. Pipettieren Sie außerdem 100 Mikroliter pro Vertiefung einer langfristig kultivierten Zellsuspension in einer Konzentration von 200.000 Zellen pro ml in Vertiefungen ohne APCs, um das Langzeitansprechen zu beurteilen.

In Ermangelung einer Antigenpräsentation fügen Sie 100 Mikroliter pro Vertiefung Kurzzeitzellen hinzu, plus frisch isolierte und auf 2 Millionen Zellen pro ml angepasste Zellen für die Ex-vivo-Beurteilung des Ansprechens. Wenn Sie eine Durchflusszytometrie-Analyse durchführen, waschen Sie den runden Boden 96, die Well-Platte und geben Sie die langfristig frisch isolierten Zellen und Antigene in die Wells nach dem gleichen Verfahren. Eingesetzt für IFN Gamma LPO-Platten Inkubieren Sie Platten über Nacht bei 39 Grad Celsius in einem 5%CO2-Inkubator.

Achten Sie darauf, dass die Teller flach liegen und die Teller an Tag 14 nicht stapeln. Entsorgen Sie Flüssigkeiten aus Vertiefungen und Waschplatten sechsmal mit 300 Mikrolitern PBS-haltigem Tween, die jedes Mal 10 Sekunden lang vor und zwischen den Wäschen auf den Plattenschüttler gelegt werden. Dann einmal mit der gleichen Menge destilliertem Wasser waschen und weitere sechsmal mit PBS-haltigem Tween.

Waschen Sie die Zellen schließlich zweimal mit 300 Mikrolitern PBS pro Well. Entfernen Sie die Waschflüssigkeit, indem Sie mit der Platte auf Papiertücher oder saugfähige Pads klopfen. 100 Mikroliter Nachweisantikörper mit fünf Mikrogramm pro ml, verdünnt in PBS mit 1 % Rinderserumalbumin, werden pro Hülse zugegeben.

Inkubieren Sie die Platten 120 Minuten lang bei 39 Grad Celsius. Bereiten Sie während dieses Inkubationsschritts die alkalische Phosphataselösung aus dem VTA-Farbstoff A BC AP-Kit Standard gemäß den Anweisungen des Herstellers 30 Minuten vor der Verwendung oder 90 Minuten nach der Zugabe des Nachweisantikörpers zu den Vertiefungen vor. Verdünnen Sie das Reagenz in PBS-haltigem Tween nach 120-minütiger Inkubation, verwerfen Sie den Nachweisantikörper durch Platteninversion, waschen Sie die Platten sechsmal mit 300 Mikrolitern PBS-haltigem Tween pro Well.

Entfernen Sie die Waschflüssigkeit, indem Sie mit der Platte auf Küchenpapier klopfen. Fügen Sie dann 100 Mikroliter pro Vertiefung alkalische Phosphataselösung hinzu. Inkubieren Sie die Platten 45 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Entsorgen Sie die Flüssigkeit und waschen Sie jede Platte sechsmal mit PBS Containing Tween. Bereiten Sie die Substratlösung aus dem vector blue AP Substrate Three Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers vor. Die Reagenzien werden in 0,1 molaren Tris HCL-Puffer bei pH 8,2 verdünnt.

Pipettieren Sie 50 Mikroliter Substrat D. Inkubieren Sie jeweils bei Raumtemperatur, bis sich die blaue Farbe zu entwickeln beginnt, etwa 30 Minuten. Entsorgen Sie die Flüssigkeit und waschen Sie die Platten mit reichlich destilliertem Wasser. Entfernen Sie die Bodenplatte, um die Membranspülung der Vertiefungen freizulegen, und lassen Sie die Platte an der Luft trocknen.

Messen Sie die Reaktion mit einem Immunospot-Bildanalysator oder bewahren Sie die Platten im Dunkeln bei Raumtemperatur auf, bis die Reaktion gemessen wird. Aufgrund der hohen Stabilität der Reaktion bleibt die Qualität des Substrats über mehrere Jahre erhalten. Bei der Bewertung des Phänotyps und der Zytokinreaktion durch Durchflusszytometrie werden Standardfärbeverfahren der Zellen durchgeführt, die auf dem runden Boden plattiert sind 96, Wellplatten-repräsentative TCM in Gegenwart oder Abwesenheit von APCs, bemannte ex vivo IFN gamma L Spot-Antworten von infizierten Tieren und nicht infizierten Tieren werden gezeigt.

Spezifische Reaktionen auf m bovis werden durch PBDB oder ESAT 6, CFP 10 antigene Stimulation bewertet. Die Flecken auf der Unterseite der Platten sind das farbige Produkt des gelben Flecken-Assays. Jeder Spot repräsentiert in der Regel eine einzelne Zytokin-produzierende Zelle, die ein quantitatives Maß für die T-Zell-produzierende IFN-gamma mit Zellen infizierter Tiere liefert.

Langfristige IFN-Gamma-L-Spot-Antworten, die als spotbildende Zellen oder SFCs dargestellt werden, sind deutlich sichtbar: wenig bis gar keine IFN-Gamma-Produktion als Reaktion auf Antigenstimulation wird bei Zellen von nicht infizierten Rindern und bei nicht stimulierten Zellen von infizierten oder nicht infizierten Rindern beobachtet. Eine robuste T-Zell-Antwort sollte als Reaktion auf Poke-Weed-Mitogen auftreten, wie TCM und ex vivo-Reaktionen auf PPDB und ESAT sechs gezeigt wurden. CCFP 10 wurde bei allen mit 3M bovis infizierten Tieren nachgewiesen, und bei den Kontrolltieren wurden minimale bis keine TCM- und ex vivo-Reaktionen festgestellt.

Das Vorhandensein von APCs war für eine optimale TCM-Reaktion infizierter Tiere erforderlich, wie die stark reduzierten Reaktionen der Langzeitzellkulturen zeigten. In Ermangelung autologer APCs wurden fleckbildende Zellen von em-, bovis-infizierten und nicht infizierten Tieren präsentiert. Die Anzahl der SFCs von jedem Tier wurde durch eine durchschnittliche Anzahl von SFCs bei 10 bis sechs Zellen in doppelten Proben als Reaktion auf PPDB abzüglich der jeweiligen Reaktion auf Medien allein berechnet. Die Reaktionen unterschieden sich je nach Infektionsstatus, Vorhandensein oder Fehlen von APCs und Kulturlänge, d.h. die Langzeitkultur im Vergleich zur ex vivo-Kultur.