Name: Eine präzise und quantifizierbare Methode zur Hämolymphentnahme von kleinen Gliederfüßern (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 39 s
Description: Lernen Sie eine präzise Methode zur Hämolymphentnahme von kleinen Gliederfüßern wie Laodelphax striatellus. Diese kostengünstige Technik ermöglicht quantitative Analysen für Forschung zu Arboviren und Vektor-Virus-Interaktionen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde vom National Key R&D Program of China (Nr. 2022YFD1401700) und von der National Science Foundation of China (Nr. 32090013 und Nr. 32072385) unterstützt.

1. Insektenzucht
<ol><li>Ziehen Sie die SBPHs, die in diesem Experiment verwendet wurden, an Reissämlingen (Oryza sativa cv. Nipponbare) an. Pflanzen Sie 20 Reissetzlinge in einen Inkubator (65 mm x 200 mm) und wachsen Sie bei 25 °C unter einer 16 h hellen/8 h dunklen Photoperiode.</li>
</ol>2. Präparation der SBPHs für die Hämolymphentnahme
<ol><li>Geben Sie die SBPHs in ein Zentrifugenröhrchen und legen Sie sie für 10-30 Minuten in ein Eisbad. Anmerkungen: Legen Sie die SBPHs nicht länger als 10 Minuten in das Eisbad, da die Insekten sonst wiederbelebt werden können.</li>
	<li>Legen Sie einen gefrorenen SBPH mit dem Bauch nach oben auf einen Glasobjektträger (siehe Materialtabelle) unter ein Stereomikroskop (siehe Materialtabelle). Stellen Sie den Fokus auf die sechs Beine des Insekts ein.</li>
	<li>Bereiten Sie zwei hochpräzise Pinzetten (siehe Materialtabelle) mit ultrafeinen Spitzen vor. Drücke mit einer Pinzette auf den Körper des Insekts, um ihn an Ort und Stelle zu halten, und ziehe mit der anderen vorsichtig eines der Beine vom Insekt ab. HINWEIS: Bei Insekten mit harter Schale kann ein Augenskalpell verwendet werden, um eines der Beine abzuschneiden.</li>
	<li>Drücken Sie mit einer Pinzette sanft auf die Brust des Insekts, damit die Hämolymphe durch die Wunde fließt. HINWEIS: Die Hämolymphe präsentiert sich als transparente Tröpfchen ohne sichtbare weiße Flockung. Entsorgen Sie das Lipid, wenn weiße Flocken vorhanden sind, die eine Kontamination des Fettkörpers darstellen.</li>
</ol>3. Hämolymphentnahme mit Mikropipetten
<ol><li>Bereiten Sie eine Mikropipette vor. Ein Kapillarröhrchen (siehe Materialtabelle) mit einem Volumen von 1 μL in den Pipettenkolben (siehe Materialtabelle) einsetzen. Stellen Sie für genaue Messungen sicher, dass die Skalenlinie sichtbar ist. Anmerkungen: Ein kleines Loch auf der Oberseite des Pipettenkolbens ist erforderlich.</li>
	<li>Halten Sie bei der Entnahme der Hämolymphe den Pipettenkolben der Mikropipette fest und platzieren Sie das Kapillarröhrchen in der Nähe der Insektenwunde. Sammeln Sie die aus der Wunde austretende Hämolymphe, indem Sie einfach die Spitze der Kapillare zur Hämolymphe berühren.</li>
	<li>Blockieren Sie das kleine Loch auf der Oberseite des Pipettenkolbens leicht mit dem Finger, um den Absorptionsprozess zu stoppen, wenn die Flüssigkeit im Inneren des Kapillarrohrs die gewünschte Skalenlinie erreicht. Anmerkungen: Sammeln Sie eine Probe von 1 μl Hämolymphe unaufhörlich und schnell, um eine Lipidkontamination und ein Verstopfen der Röhrchen zu vermeiden.</li>
	<li>Drücken Sie auf den Pipettenkolben, um die gesammelte Hämolymphe in 100 μl PBS-Puffer (137 mmol/L NaCI, 2,7 mmol/L KCI, 4,3 mmol/L Na 2 HPO 4, 1,4 mmol/L KH 2 PO 4, pH 7,2-7,4) zu entladen. Anmerkungen: Das Kapillarrohr wird in den PBS-Puffer eingeführt.</li>
	<li>Wechseln Sie zu einem neuen Kapillarröhrchen, wenn Sie eine weitere 1-μl-Hämolymphprobe entnehmen.</li>
</ol>4. Coomassie Blue-Färbung
<ol><li>Sammeln Sie 3 Hämolymphproben mit dem gleichen Volumen (1 μl) von Larven des 3. Stadiums gemäß den in Schritt 3 beschriebenen Protokollen und entleeren Sie die gesammelte Hämolymphe in den PBS-Puffer, um ein Gesamtvolumen von 100 μl zu erhalten.</li>
	<li>In 100 μl der verdünnten Hämolymphproben werden 25 μl 5x Proteinladepuffer (250 mmol/l Tris-HCI [pH 6,8], 10 % W/V SDS, 0,05 % W/V Bromphenolblau, 50 % W/V Glycerin, 5 % W/V β-Mercaptoethanol) gegeben und erhitzt, um die Proteine zu denaturieren.</li>
	<li>Geben Sie 20 μl der gekochten Proben auf ein 10%iges SDS-PAGE-Proteingel (siehe Materialtabelle), um die Proteine zu trennen.</li>
	<li>Färben Sie das Gel 1 Stunde lang bei Raumtemperatur in einer Coomassie Blue-Lösung (mischen Sie 1 g Coomassie Brilliant Blue R-250 mit 250 ml Isopropanol, 100 ml Eisessig und 650 ml ddH2O und filtern Sie alle Partikel mit Filterpapier heraus) und entfärben Sie das Gel dann 1 Stunde lang mit Entfärbungslösung (100 ml Essigsäure, 400 ml Methanol, 500 mlddH2O).</li>
</ol>5. Bestimmung der Proteinkonzentration
<ol><li>10 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA) auf 5 mg/ml, 2,5 mg/ml, 1,25 mg/ml, 0,625 mg/ml und 0,3125 mg/ml mit PBS-Puffer unter Verwendung der zweifachen Verdünnungsmethode verdünnen.</li>
	<li>Aspirieren Sie 5 μl PBS-Puffer und jede Konzentration BSA-Lösungen in Schritt 5.1, fügen Sie 1 ml 1x Bradford-Farbstoffreagenz hinzu (siehe Materialtabelle) und inkubieren Sie sie 5 Minuten lang bei Raumtemperatur. Verwenden Sie PBS-Puffer in Bradford-Farbstoffreagenz als Kontrolle und Null bei OD = 595 nm. Messen Sie die Absorptionswerte jeder der verbleibenden Proteinkonzentrationen und erstellen Sie eine Standardkurve.</li>
	<li>Geben Sie 1 μl Hämolymphe von larven, weiblichen oder männlichen SBPHs in 100 μl PBS-Puffer und zentrifugieren Sie dann die Proben bei 1.000 x g für 10 min bei 4 °C, um die Hämozyten zu entfernen.</li>
	<li>Aspirieren Sie 90 μl Überstand in ein neues Zentrifugenröhrchen und messen Sie die Absorptionswerte des Überstands gemäß den Anweisungen in Schritt 5.2.</li>
	<li>Berechnen Sie die Proteinkonzentrationen der Hämolymphproben gemäß der Regressionsgleichung der Standardkurve. Beziehen Sie drei biologische Replikate mit drei technischen Repliken in die Experimente ein.</li>
</ol>6. Mikroskopische Detektionen
<ol><li>Verwenden Sie Mikropipetten, um die Hämolymphe von 10-15 SBPHs in verschiedenen Entwicklungsstadien zu sammeln. Die gesammelte Hämolymphe wird in ein Röhrchen mit 20 μl 4%iger Paraformaldehydlösung gegeben (siehe Materialtabelle). Inkubieren Sie die Mischung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur, um die Hämolymphe zu fixieren.</li>
	<li>Pipettieren Sie 20 μl fixierte Hämozyten in die Mitte eines mit Silan beschichteten Objektträgers (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Trocknen Sie das Tröpfchen in einem Wäscheständer ab. Anmerkungen: Vermeiden Sie übermäßiges Trocknen.</li>
	<li>Bedecken Sie die Probe mit dem Gold-Lichtschutzreagenz 4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) (siehe Materialtabelle) und untersuchen Sie den Objektträger unter einem inversen Mikroskop (siehe Materialtabelle).</li>
</ol>7. Quantifizierung der Zellen
<ol><li>Sammeln Sie 1 μl Hämolymphe mit einer Mikropipette aus den SBPHs und lösen Sie sie in 20 μl PBS-Puffer auf.</li>
	<li>Verdünnen Sie die Hämolymphproben fünffach mit PBS-Puffer.</li>
	<li>Pipettieren Sie 20 μl Hämolymphlösung in die Mitte der Zellzählkammer (siehe Materialtabelle). Decken Sie das Tröpfchen mit einem Deckglas ab (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Zählen Sie die Zellen in den fünf Quadraten der Zellzählkammer (ergänzende Abbildung 1) unter einem inversen Mikroskop (siehe Materialtabelle). Beziehen Sie drei biologische Replikate mit jeweils drei technischen Repliken in die Experimente ein. Zellen/μL = Gesamtzahl von fünf mittleren Quadraten × 5 × Verdünnungsfaktor × 104</li>
</ol>8. Statistische Auswertungen
<ol><li>Führen Sie statistische Analysen mit der entsprechenden Software durch (siehe Materialtabelle). Erstellen Sie eine neue Datei, wählen Sie die Spalte aus, importieren Sie die Daten, und generieren Sie ein Streudiagramm mit einem Balken.</li>
	<li>Berechnen Sie den Mittelwert und die SD für jede Datengruppe mithilfe von Spaltenstatistiken, und verwenden Sie ein unidirektionales ANOVA-Tool, um die Signifikanz der Unterschiede zwischen den Gruppen auszuwerten. Bestimmen Sie den Mittelwert und die SD aus drei biologischen Wiederholungen mit drei unabhängigen Experimenten.</li>
</ol>

Sammeln von Hämolymphe von kleinen Gliederfüßern

<ol><li>Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+vector+interactions+with+persistently+transmitted+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Insect vector interactions with persistently transmitted viruses.</a> Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).</li>
<li>Ray, S., Casteel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effector-mediated+plant-virus-vector+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Effector-mediated plant-virus-vector interactions.</a> Plant Cell. 34 (5), 1514-1531 (2022).</li>
<li>Islam, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-insect+vector-virus+interactions+under+environmental+change%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Plant-insect vector-virus interactions under environmental change.</a> Science of the Total Environment. 701, 135044(2020).</li>
<li>Cory, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+virus+transmission%3A+Different+routes+to+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Insect virus transmission: Different routes to persistence.</a> Current Opinion in Insect Science. 8, 130-135 (2015).</li>
<li>Wang, X. W., Blanc, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+transmission+of+plant+single-stranded+DNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Insect transmission of plant single-stranded DNA viruses.</a> Annual Review of Entomology. 66, 389-405 (2021).</li>
<li>Yi, H. Y., Chowdhury, M., Huang, Y. D., Yu, X. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+antimicrobial+peptides+and+their+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Insect antimicrobial peptides and their applications.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (13), 5807-5822 (2014).</li>
<li>Liu, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+interaction+between+a+plant+virus+and+its+vector+insect+reveals+new+functions+of+hemipteran+cuticular+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of interaction between a plant virus and its vector insect reveals new functions of hemipteran cuticular protein.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 14 (8), 2229-2242 (2015).</li>
<li>Wang, L., Van Meulebroek, L., Vanhaecke, L., Smagghe, G., Meeus, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bee+hemolymph+metabolome%3A+A+window+into+the+impact+of+viruses+on+bumble+bees%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">The bee hemolymph metabolome: A window into the impact of viruses on bumble bees.</a> Viruses. 13 (4), 600(2021).</li>
<li>Jia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+mediated+transmission+of+persistently+transmitted+plant+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Virology%22%5BJournal%5D)">Vector mediated transmission of persistently transmitted plant viruses.</a> Current Opinion in Virology. 28, 127-132 (2018).</li>
<li>Anderson, J. F., Main, A. J., Ferrandino, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+and+vertical+transmission+of+West+Nile+Virus+by+Aedes+vexans+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Horizontal and vertical transmission of West Nile Virus by Aedes vexans (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 57 (5), 1614-1618 (2020).</li>
<li>Gadhave, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+frequency+of+horizontal+and+vertical+transmission+of+cucurbit+leaf+crumple+virus+in+whitefly+Bemisia+tabaci+Gennadius%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Low frequency of horizontal and vertical transmission of cucurbit leaf crumple virus in whitefly Bemisia tabaci Gennadius.</a> Phytopathology. 110 (6), 1235-1241 (2020).</li>
<li>Logan, R. A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertical+and+horizontal+transmission+of+cell+fusing+agent+virus+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Vertical and horizontal transmission of cell fusing agent virus in Aedes aegypti.</a> Applied and Environmental Microbiology. 88 (18), e0106222(2022).</li>
<li>Huo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transovarial+transmission+of+a+plant+virus+is+mediated+by+vitellogenin+of+its+insect+vector%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Transovarial transmission of a plant virus is mediated by vitellogenin of its insect vector.</a> PLoS Pathogens. 10 (3), e1003949(2014).</li>
<li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+development+and+vitellogenin+determine+the+transovarial+transmission+of+begomoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Vector development and vitellogenin determine the transovarial transmission of begomoviruses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (26), 6746-6751 (2017).</li>
<li>Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptors+and+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptors and innate immunity.</a> Nature Reviews Immunology. 1 (2), 135-145 (2001).</li>
<li>Kingsolver, M. B., Huang, Z., Hardy, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+antiviral+innate+immunity%3A+Pathways%2C+effectors%2C+and+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Insect antiviral innate immunity: Pathways, effectors, and connections.</a> Journal of Molecular Biology. 425 (24), 4921-4936 (2013).</li>
<li>Pei, R. J., Chen, X. W., Lu, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+hepatitis+B+virus+replication+by+interferons+and+Toll-like+receptor+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Control of hepatitis B virus replication by interferons and Toll-like receptor signaling pathways.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (33), 11618-11629 (2014).</li>
<li>Kao, Y. T., Lai, M. M. C., Yu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+dengue+virus+circumvents+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">How dengue virus circumvents innate immunity.</a> Frontiers in Immunology. 9, 2860(2018).</li>
<li>Gilliam, M., Shimanuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coagulation+of+hemolymph+of+the+larval+honey+bee+%28Apis+mellifera+L%29%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">Coagulation of hemolymph of the larval honey bee (Apis mellifera L).</a> Experientia. 26 (8), 908-909 (1970).</li>
<li>Huo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+tissue-specific+vitellogenin+facilitates+transmission+of+plant+virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus.</a> PLoS Pathogens. 14 (2), e1006909(2018).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plant+virus+ensures+viral+stability+in+the+hemolymph+of+vector+insects+through+suppressing+prophenoloxidase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">A plant virus ensures viral stability in the hemolymph of vector insects through suppressing prophenoloxidase activation.</a> mBio. 11 (4), e01453(2020).</li>
<li>Vidano, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phases+of+maize+rough+dwarf+virus+multiplication+in+the+vector+Laodelphax+striatellus+%28Fall%C3%A9n%29%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Phases of maize rough dwarf virus multiplication in the vector Laodelphax striatellus (Fallén).</a> Virology. 41 (2), 218-232 (1970).</li>
<li>Yu, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laodelphax+striatellus+Atg8+facilitates+Rice+stripe+virus+infection+in+an+autophagy-independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Laodelphax striatellus Atg8 facilitates Rice stripe virus infection in an autophagy-independent manner.</a> Journal of Insect Science. 28 (2), 315-329 (2021).</li>
<li>Zhang, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+P450+monooxygenases+CYP6AY3+and+CYP6CW1+regulate+Rice+black-streaked+dwarf+virus+replication+in+Laodelphax+striatellus+%28Fallen%29%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Cytochrome P450 monooxygenases CYP6AY3 and CYP6CW1 regulate Rice black-streaked dwarf virus replication in Laodelphax striatellus (Fallen).</a> Viruses. 13 (8), 1576(2021).</li>
<li>Ribeiro, C., Brehelin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+haemocytes%3A+What+type+of+cell+is+that%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Insect haemocytes: What type of cell is that.</a> Journal of Insect Physiology. 52 (5), 417-429 (2006).</li>
<li>Butolo, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+quality+method+for+hemolymph+collection+from+honeybee+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A high quality method for hemolymph collection from honeybee larvae.</a> PLoS One. 15 (6), e0234637(2020).</li>
<li>Nesa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+potential+of+a+ponericin-like+peptide+isolated+from+Bombyx+mori+L.+hemolymph+in+response+to+Pseudomonas+aeruginosa+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial potential of a ponericin-like peptide isolated from Bombyx mori L. hemolymph in response to Pseudomonas aeruginosa infection.</a> Scientific Reports. 12 (1), 15493(2022).</li>
<li>Mahmoud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin-injected+Musca+domestica+larval+hemolymph%3A+Cecropin+upregulation+and+potential+anticancer+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Curcumin-injected Musca domestica larval hemolymph: Cecropin upregulation and potential anticancer effect.</a> Molecules. 27 (5), 1570(2022).</li>
<li>Patton, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((salivary+gland%2C+and+hemolymph+collection+from+Ixodes+scapularis+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">salivary gland, and hemolymph collection from Ixodes scapularis ticks.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), e3894(2012).</li>
<li>Piyankarage, S. C., Augustin, H., Featherstone, D. E., Shippy, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemolymph+amino+acid+variations+following+behavioral+and+genetic+changes+in+individual+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%22%5BJournal%5D)">Hemolymph amino acid variations following behavioral and genetic changes in individual Drosophila larvae.</a> Amino Acids. 38 (3), 779-788 (2010).</li>
<li>Fiorotti, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disclosing+hemolymph+collection+and+inoculation+of+metarhizium+blastospores+into+Rhipicephalus+microplus+ticks+towards+invertebrate+pathology+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Disclosing hemolymph collection and inoculation of metarhizium blastospores into Rhipicephalus microplus ticks towards invertebrate pathology studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (148), e59899(2019).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Hämolymphe ist das Medium des Kreislaufsystems bei Gliederfüßern, und Arboviren können nur dann in andere Gliederfüßergewebe eindringen, wenn sie in der Lage sind, die feindliche Hämolymphumgebung zu überleben. Die Entnahme einer qualitativ hochwertigen Hämolymphprobe ist der erste Schritt zur Untersuchung der Vektor-Virus-Interaktionen, die in der Hämolymphe auftreten. Es wurde berichtet, dass die Insektenhämolymphe an mehreren Stellen des Körpers des Insekts gewonnen werden kann, einschließlich einer Wunde am Vorderbei...

Sowohl tierische als auch pflanzliche Viren können von Gliederfüßern übertragen werden, und diese Viren stellen eine ernsthafte Bedrohung für die menschliche Gesundheit dar und verursachen enorme wirtschaftliche Verluste in der Landwirtschaft 1,2,3. Wichtig ist, dass die Arthropoden-Hämolymphe, die als Kreislaufsystem und lebenswichtiges Element des Immunsystems bei Arthropoden dient, eine wichtige Rolle bei der Regulierung der arboviralen Übertragung spielt. Viren, die über den Darm der Arthropoden erworben wurden, werden erst dann in andere Gewebe transportiert, wenn sie der ungünstigen Hämolymphumgebung erfolgreich entkommensind 4,5,6,7. Der Lebenszyklus von Viren in der Arthropoden-Hämolymphe umfasst das Überleben des Virus im flüssigen Plasma, das Eindringen in die Hämozyten und den Transport in andere Gewebe, und in der Hämolymphe treten verschiedene Virus-Vektor-Interaktionsmechanismen auf 8,9,10,11,12. So ist beispielsweise die vertikale Übertragung von RSV durch den SBPH von einer molekularen Interaktion zwischen dem SBPH-Vitellogenin-Protein und dem RSV-Kapsidprotein (Reisstreifenvirus) abhängig13,14. Einige Viren können der Immunantwort der Hämolymphe entgehen, indem sie bestimmte Vektorfaktorenbinden 15,16,17,18. Daher ist die Untersuchung von Vektor-Virus-Interaktionen in der Hämolymphe von Arthropoden wichtig, um ein besseres Verständnis der Arbovirus-Übertragung zu entwickeln.
Die Hämolymphe einiger kleiner Insekten wie Zikaden, Zikaden und einiger Mücken ist aufgrund ihrer Größe schwer zu sammeln. Um dieses Problem anzugehen, wurden verschiedene Methoden zur Hämolymphentnahme entwickelt, darunter das Einführen einer Spritzennadel direkt in den Insektenkörper, um ein Mikrovolumen der Hämolymphe zu extrahieren, das Sammeln von Exsudat aus der Wundstelle mit einer Pinzette mit feiner Spitze und die direkte Zentrifugation. Diese Methoden ermöglichten die Messung der relativen Genexpression und der Virustiter innerhalb der Hämolymphe 19,20,21. Eine effektive Methode zur Quantifizierung des Hämolymphvolumens, die für die Hämolymphzählung, Proteinquantifizierung und Enzymaktivitätsanalyse notwendig ist, steht für diese kleinen Insekten derzeit jedoch nicht zur Verfügung.
Die SBPH (kleine braune Zikade) ist eine Art kleiner Insektenvektor mit einer Körperlänge von etwa 2-4 mm. Der SBPH ist in der Lage, eine Vielzahl von Pflanzenviren zu übertragen, darunter RSV, Mais-Rauhzwergvirus und Reis-Schwarzstreifen-Zwergvirus22,23,24. Die Wechselwirkung zwischen SBPH und RSV wurde in den letzten zehn Jahren eingehend untersucht. Um die Arbeit mit SBPHs zu erleichtern, haben wir eine neuartige und einfache Methode zur Hämolymphentnahme entwickelt. Bei dieser Methode, die auf dem Prinzip der Kapillarkräfte basiert, wird eine Kapillare mit einer Schuppenmarkierung verwendet, um die Hämolymphe des Insekts präzise und quantifizierbar zu erfassen. Dies ermöglicht es uns, ein bestimmtes Volumen an Hämolymphe von kleinen Insekten effizient zu sammeln und die Hämolymphumgebung kleiner Vektoren genauer zu untersuchen.

<table><tbody><tr><td>10% SDS-PAGE Proteingel</td><td>Bio-rad</td><td>4561035</td><td>Proteintrennung und -nachweis</td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyd</td><td>Solarbio</td><td>P1110</td><td>Zur Fixierung der Zellen oder Gewebe&nbsp;</td></tr><tr><td>Bradford-Farbstoffreagenz</td><td>Bio-rad</td><td>5000205</td><td>Nachweis der Proteinkonzentration</td></tr><tr><td>Kapillare</td><td>Hirschmann</td><td>9000101</td><td>Zum Sammeln von Hämolymphen</td></tr><tr><td>Zellzählkammer</td><td>ACMEC</td><td>AYA0810</td><td>Zählung von Hämozyten</td></tr><tr><td>Objektträger Glasobjektträger</td><td>Gitoglas</td><td>10127105A</td><td>Zum Halten von Insekten</td></tr><tr><td>Objektträger mit Silan beschichtet</td><td>Sigma</td><td>S4651-72EA</td><td>Zur Aufbewahrung von Mikroskopproben</td></tr><tr><td>Gold-Antifading-Reagenz mit DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36935</td><td>Nukleusfärbung</td></tr><tr><td>Mikroskop-Deckglas</td><td>Gitoglas</td><td>10212424C</td><td>Für mikroskopische Betrachtung</td></tr><tr><td>Pipettenbirne</td><td>Hirschmann</td><td>9000101</td><td>Zum Sammeln von Hämolymphen</td></tr><tr><td>Prism 8.0 Software GraphPad</td><td>Software</td><td>/</td><td>Statistische Analysen</td></tr><tr><td>Stereomikroskop&nbsp;</td><td>Motic</td><td>SMZ-168</td><td>Für die Insektendissektion</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Tianld</td><td>P5622</td><td>Für Insektendissektion</td></tr><tr><td>Zeiss Inverses Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Observer Z1</td><td>Hämozytenbeobachtung</td></tr></tbody></table>

eine präzise und quantifizierbare methode zur hämolymphentnahme von kleinen gliederfüßern

A Precise and Quantifiable Method for Collecting Hemolymph from Small Arthropods

Es ist bekannt, dass Gliederfüßer eine Vielzahl von Viren von medizinischer und landwirtschaftlicher Bedeutung durch ihre Hämolymphe übertragen, die für die Virusübertragung unerlässlich ist. Die Hämolymphsammlung ist die Basistechnologie für die Untersuchung von Virus-Vektor-Interaktionen. In dieser Arbeit beschreiben wir eine neuartige und einfache Methode zur quantitativen Entnahme von Hämolymphen aus kleinen Arthropoden unter Verwendung von Laodelphax striatellus (der kleinen braunen Zikade, SBPH) als Forschungsmodell, da dieser Arthropode der Hauptvektor des Reisstreifenvirus (RSV) ist. Bei diesem Protokoll beginnt der Prozess damit, dass ein Bein des gefrorenen Gliederfüßers mit einer Pinzette mit feiner Spitze sanft abgekniffen und die Hämolymphe aus der Wunde gedrückt wird. Dann wird eine einfache Mikropipette, bestehend aus einer Kapillare und einem Pipettenkolben, verwendet, um die transsudative Hämolymphe nach dem Prinzip der Kapillarkräfte aus der Wunde zu entnehmen. Schließlich kann die gesammelte Hämolymphe zur weiteren Untersuchung in einem spezifischen Puffer aufgelöst werden. Diese neue Methode zur Gewinnung von Hämolymphen aus kleinen Arthropoden ist ein nützliches und effizientes Werkzeug für die weitere Erforschung von Arboviren und Vektor-Virus-Interaktionen.

Mikropipettenmodell und Hämolymphsammlung Wir haben eine einfache Mikropipette entwickelt, deren Wirkung auf den Kapillarkräften des Kapillarrohrs basiert. Die Mikropipette besteht aus einem Kapillarröhrchen und einem Pipettenkolben (Abbildung 1A). Kapillarröhrchen sind in verschiedenen Volumengrößen von 1 μL bis 20 μL erhältlich, wobei die Kapillarröhrchenvolumina je nach Anforderung ausgewählt werden. Kapillarröhrchen mit kleinerem Volumen werden nicht empfohlen, da die...

Wir beschreiben eine Methode, um quantifizierbare Hämolymphe effizient aus kleinen Arthropoden für die anschließende Analyse zu gewinnen.

Eine präzise und quantifizierbare Methode zur Hämolymphentnahme von kleinen Gliederfüßern

Arthropods are known to transmit a variety of viruses of medical and agricultural importance through their hemolymph, which is essential for virus ...

Unsere Forschung konzentriert sich auf Arboviren, Insekten und Pflanzeninteraktionen. Die Gewinnung von Hämolymphproben von kleinen Gliederfüßern stellt eine technische Herausforderung für die Erforschung von durch Insekten übertragenen Krankheiten dar. Dieses Protokoll zeigt eine präzise und quantifizierbare Technik, um diesem Problem entgegenzuwirken.Jüngste Forschungsentwicklungen bei der Übertragung von Arboviren haben ergeben, dass Viren mehrere wichtige Vektorfaktoren manipulieren können, um die Wirtsbarriere zu durchbrechen. Dieses Protokoll ist eine einfache, kostengünstige und wertvolle Technik, die eine präzise Quantifizierung der Hämolymphe ermöglicht. Diese Methode bietet auch wertvolle Technologie, um die Wechselwirkungen zwischen Viren und Vektoren in Gang zu setzen.Unsere bevorstehende Forschung wird sich darauf konzentrieren, die molekularen Mechanismen der Virusübertragung durch Vektorinsekten zu verstehen und gleichzeitig neue operative Techniken zu erforschen und zu verbessern.

a-precise-quantifiable-method-for-collecting-hemolymph-from-small

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Der amerikanische Pfeilschwanzkrebs Limulus Polyphemus, ist wohl die günstigste Quelle für große Mengen von Blut aller Wirbellosen. Das Blut ist einfach in der Komposition, mit nur einem Zelltyp in der allgemeinen Zirkulation, die körnige Amöbocyten, und nur drei vorkommenden Proteine ​​im Plasma, Hämocyanin, das C-reaktive Proteine ​​und α2-Makroglobulin. Das Blut wird vom Herzen gesammelt und die Blutzellen und Plasma durch Zentrifugation abgetrennt.

Blutentnahme aus der amerikanischen Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus

Konservierte Insulin-Signalwege in der Fruchtfliege...

Insulin-Injektion und Hämolymphe Extraction die Insulinsensitivität in Adult Measure Drosophila melanogaster</em

Eine vereinfachte, aber genaue Methode zu sammeln und zu färben Mücke Blutzellen beschrieben. Unsere Methode kombiniert die Einfachheit der Perfusion mit der Genauigkeit der hohe Einspritzdruck Techniken zur sauberen Vorbereitung der Blutzellen in Aedes Moskitos zu isolieren. Diese Methode erleichtert Studien erfordern Kenntnisse über die Arten von Blutzellen und deren Hülle und Fülle.

Ein Protokoll für die Erfassung und Färbung Blutzellen aus dem Gelbfiebermücke Aedes aegypti</em

Insect Blutzellen führen viele wichtige Funktionen, sowohl Immun-und Nicht-immune, in allen Phasen des Insekts Entwicklung. Unsere gegenwärtigen Kenntnisstand hemocyte Typen und Funktion kommt von Studien über Insekten genetischen Modellen. Hier stellen wir ein Verfahren zur Extraktion, Quantifizierung und Visualisierung von Blutzellen von wilden Raupen.

A Simple Protocol für das Extrahieren Hämozyten von Wild Caterpillars

Die Drosophila-Hämolymphe dient sowohl als Blut als auch als interstitielle Flüssigkeit und zirkuliert während des Larven- und Erwachsenenstadiums durch den Körper. Dieses Video beschreibt ein Protokoll zur Entnahme von Hämolymphlarven, um die zirkulierenden Zellen zu quantifizieren.

Störung der Nagelhaut: Eine Methode zum Sammeln von Hämolymphe aus Drosophila-Larven

Dieses Video zeigt den Hämozytenstörungstest, der die erneute Adhäsion von Hämozyten in den hämatopoetischen Taschen von Drosophila-Larven bewertet. Mechanische Störungen setzen residente Hämozyten frei, wodurch die Anzahl der zirkulierenden Hämozyten erhöht wird. Nach der Genesung wird die erneute Adhärenz der residenten Hämozyten bestätigt, was die Reversibilität verdeutlicht.

Ein Hämozytenstörungstest zur Beurteilung der Readhäsion von Hämozyten an hämatopoetische Taschen

Drosophila-Blutzellen oder Hämozyten zirkulieren zwischen den ansässigen Stellen und der Zirkulation.  In der Larve sind residente (sitzende) Hämozyten in induktiven Mikroumgebungen, den hämatopoetischen Taschen, lokalisiert, während sich zirkulierende Hämozyten frei in der Hämolymphe bewegen. Das Ziel dieses Protokolls ist die standardisierte Isolierung und Quantifizierung dieser beiden verhaltensverschiedenen, aber sich gegenseitig verändernden Hämozytenpopulationen.

Untersuchung von Blut Zellpopulationen des<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

Drosophila und Säugetieren hämatopoetischen Systeme haben viele gemeinsame Merkmale, Drosophila ein attraktives genetisches Modell machen Hämatopoese zu studieren. Hier zeigen wir Präparation und Lagerung des großen Larven hämatopoetischen Organ für die Immunhistochemie. Wir beschreiben Methoden auch verschiedene Larven hämatopoetischen Fächer einschließlich zirkulierenden Blutzellen und sessile-Zellen zu untersuchen.

Methoden, um die Lymphdrüsen und Blutzellen zu prüfen, die in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvae

Diese Methode zeigt, wie Erreger Invasion in Insektenzellen mit dreidimensionalen (3D) Modellen zu visualisieren. Hemocytes von Drosophila Larven infiziert wurden mit viralen oder bakteriellen Erregern, Ex Vivo oder in Vivo. Infizierte Hemocytes wurden dann fixiert und für die Bildgebung mit einem confocal Mikroskop und anschließende zelluläre 3D-Rekonstruktion befleckt.

Extraktion von Hemocytes aus Drosophila Melanogaster Larven für mikrobielle Infektionen und Analyse

Die Analyse der Zeckenhemolymphe stellt eine wichtige Quelle für Informationen darüber dar, wie einige Krankheitserreger verursachen und wie Zecken immunologisch auf diese Infektion reagieren. Die vorliegende Studie zeigt, wie man Pilzpropagiolen impfen und die Hämatymphe von Rhipicephalus microplus verzierten Weibchen sammeln kann.

Die Sammlung der Häkolymphe und die Inokulation von Metarhizium-Blastospores in Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Pathology Studies

Dieses Protokoll beschreibt einen In-vivo-Test der Phagozytose zur Beurteilung und Quantifizierung der Fähigkeit junger und alter Drosophila melanogaster Hämozyten an Phagozytosebakterien..

Beurteilung der altersspezifischen phagozytischen Fähigkeit von adulten Drosophila melanogaster Hämozyten mit einem In Vivo Phagozytose-Assay

Lernen Sie eine präzise Methode zur Hämolymphentnahme von kleinen Gliederfüßern wie Laodelphax striatellus. Diese kostengünstige Technik ermöglicht quantitative Analysen für Forschung zu Arboviren und Vektor-Virus-Interaktionen.

Eine präzise und quantifizierbare Methode zur Hämolymphentnahme von kleinen Gliederfüßern

Weitere Videos entdecken