Name: Fluoreszenzbasierte Quantifizierung des mitochondrialen Membranpotentials und des Superoxidspiegels mittels Live-Bildgebung in HeLa-Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Erfahren Sie die fluoreszenzbasierte Quantifizierung des mitochondrialen Membranpotentials und Superoxidspiegels mittels Live-Bildgebung in HeLa-Zellen. Diese Methode unterstützt die Erforschung neurodegenerativer Erkrankungen.

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Wir danken den Mitgliedern des Evans-Labors für ihr aufmerksames Feedback zu diesem Manuskript. Diese Arbeit wird von Duke Whitehead Scholars, Duke Science and Technology Scholars und dem Hanna Gray Fellowship des Howard Hughes Medical Institute (HHMI) unterstützt. Abbildung 1A wurde mit BioRender.com erstellt.

Quantifizierung des mitochondrialen Membranpotentials und der Superoxidspiegel

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Der hier skizzierte Workflow kann verwendet werden, um das mitochondriale Membranpotenzial und die Superoxidkonzentrationen mit Hilfe der fluoreszenzbasierten Bildgebung robust und reproduzierbar zu quantifizieren30. Es gibt wichtige technische Einschränkungen, die bei der Planung dieser Experimente zu berücksichtigen sind. HeLa-Zellen wurden mit einem leeren YFP-Vektor, YFP-ParkinWT oder YFP-ParkinT240R, transfiziert. Der leere YFP-Vektor wurde als Kontrolle verwendet, um zu...

Das mitochondriale Netzwerk besteht aus einer Reihe miteinander verbundener Organellen, die eine entscheidende Rolle bei der Energieproduktion1, der angeborenen Immunität 2,3 und der zellulären Signalübertragung 4,5 spielen. Mitochondriale Dysregulation wurde mit neurodegenerativen Erkrankungen wie der Parkinson-Krankheit (PD) in Verbindung gebracht6,7. Parkinson ist eine fortschreitende neurodegenerative Erkrankung, die dopaminerge Neuronen der Substantia nigra betrifft und von der weltweit fast 10 Millionen Menschen betroffen sind8. Parkinson wurde genetisch mit der Mitophagie in Verbindung gebracht, einem mitochondrialen Qualitätskontrollweg, der für die Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase notwendig ist und beschädigte Mitochondrien selektiv entfernt 9,10. Studien haben mehrere unabhängige Mitophagie-Signalwege identifiziert, darunter die FUN14-Domäne mit 1 (FUNDC1)-vermittelter Mitophagie, die Bcl-2-interagierende Protein 3 (BNIP3)-geförderte Mitophagie, die NIX-abhängige Mitophagie und die gut charakterisierte PTEN-induzierte Kinase 1 (PINK1)/Parkin-regulierte Mitophagie10,11. PINK1 (eine mutmaßliche Kinase) und Parkin (eine E3-Ubiquitin-Ligase) arbeiten zusammen, um geschädigte Mitochondrien mit Phospho-Ubiquitinat zu versorgen, was die Bildung von Autophagosomen antreibt, die die beschädigte Organelle umhüllen und mit Lysosomen verschmelzen, um den Abbau einzuleiten 12,13,14,15,16. Mutationen bei Parkin wurden mit Parkinson-assoziierten Phänotypen wie Neurodegeneration über den Verlust dopaminerger Neuronen in Verbindung gebracht17,18.
Hier wird ein Protokoll beschrieben, in dem HeLa-Zellen, routinemäßig verwendete immortalisierte Zellen aus Gebärmutterhalskrebs, verwendet werden, um die Rolle von Parkin bei der Aufrechterhaltung der Gesundheit des mitochondrialen Netzwerks zu untersuchen. HeLa-Zellen exprimieren vernachlässigbare Mengen an endogenem Parkin und benötigen daher eine exogene Parkin-Expression19. Um die Rolle von Parkin für die Gesundheit des mitochondrialen Netzwerks zu untersuchen, werden HeLa-Zellen entweder mit Wildtyp-Parkin (ParkinWT), einer Parkin-Mutante (ParkinT240R) oder einem leeren Kontrollvektor transfiziert. ParkinT240R ist eine autosomal-rezessiv vererbte juvenile Parkinsonismus-Mutation, die die Aktivität der Parkin-E3-Ligase beeinträchtigt und die Effizienz des Mitophagie-Signalwegssignifikant verringert 20. HeLa-Zellen unterliegen milden (5 μM) oder schweren (20 μM) Konzentrationen von Carbonylcyanid m-Chlorphenylhydrazon (CCCP), einem mitochondrialen Entkopplungsmittel. Die Behandlung mit schweren Konzentrationen von CCCP wird routinemäßig eingesetzt, um Parkin-vermittelte Mitophagie in verschiedenen Zelllinien, wie z. B. HeLa- und COS-7-Zellen, zu induzieren21,22,23.
Nach der Behandlung verwendet das Protokoll eine Live-Bildgebung des mitochondrialen Netzwerks unter Verwendung von zwei derzeit verfügbaren mitochondrialen Fluoreszenzfarbstoffen. Tetramethylrhodamin, Ethylester, Perchlorat (TMRE) ist ein kationischer Farbstoff, der auf der Grundlage des mitochondrialen Membranpotentials24 fluoresziert, während MitoSOX ein mitochondrialer Superoxidindikator ist, bei dem die Fluoreszenzintensität eine Funktion der Superoxidkonzentrationist 25. Schließlich verwendet das skizzierte Protokoll eine fluoreszenzbasierte Quantifizierung und einen einfachen Arbeitsablauf, um das mitochondriale Membranpotenzial und den Superoxidgehalt mit minimalem Spielraum für Benutzerverzerrungen effektiv zu quantifizieren. Obwohl dieses Protokoll entwickelt wurde, um die mitochondriale Funktion in HeLa-Zellen zu untersuchen, kann es für weitere Zelllinien und primäre Zelltypen angepasst werden, um die Gesundheit des mitochondrialen Netzwerks quantitativ zu charakterisieren.

<table><tbody><tr><td>Chemikalien, Peptide und rekombinante Proteine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCCP (Carbonylcyanid m-Chlorphenylhydrazon)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2759</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1x) mit 4,5 g/L Glukose</td><td>Gibco</td><td>11-965-084</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, wasserfrei</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum-Hyklon</td><td></td><td>SH3007103</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE 6 (Transfektionsreagenz)</td><td>Promega</td><td>E2691</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX 100x (L-Glutaminlösung)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>35-050-061</td><td></td></tr><tr><td>Hoescht 33342</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>MitoSOX&nbsp; Rot&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>M36008</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker Deep</td><td>Red ThermoFisher Scientific</td><td>M7514</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM (Redued Serum media)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylrhodamin, Ethylester, Perchlorat (TMRE)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T669</td><td></td></tr><tr><td>Experimentelle Modelle: Organismen/Stämme</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HeLa-M (Homo sapiens)</td><td>A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinante DNA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EYFP Leerer Vektor N</td><td>/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>YFP-Parkin T240R</td><td>Diese Arbeit</td><td>wurde durch ortsgerichtete Mutagenese aus YFP-Parkin</td><td></td></tr><tr><td>YFP-Parkin WT</td><td>Addgene generiert; PMID:19029340</td><td>RRID:Addgene_23955</td><td></td></tr><tr><td>Software und Algorithmen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adobe Illustrator</td><td>Adobe Inc.</td><td>https://www.adobe.com/products/illustrator</td><td>(Schindelin, 2012)</td></tr><tr><td>Excel (Tabellenkalkulationssoftware)</td><td>Microsoft Office&nbsp;</td><td></td><td></td>https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel</tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td>https://imagej.net/software/fiji/</td><td></td></tr> <tr><td>Leica Application Suite (LAS X)</td><td>Leica</td><td>https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/</td><td></td></tr> <tr><td>Microsoft Excel</td>, <td>Microsoft Office</td><td>https://www.microsoft.com/excel</td><td></td></tr><tr><td>Prism9 (Statistisch) Analysesoftware)</td><td>GraphPad Software</td><td>https://www.graphpad.com</td><td></td></tr><tr><td>Other</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm Schale, Nr. 1,5 Deckglas, 20 mm Glasdurchmesser, unbeschichtet</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td></td></tr><tr><td>Käfig-Inkubator (Klimakammer)</td><td>Okolab</td><td>https://www.oko-lab.com/cage-incubator</td><td></td></tr><tr><td>DMiL Inverses Mikroskop</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>LIGHTNING Dekonvolution Software</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>STELLARIS 8 Konfokalmikroskop</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

fluoreszenzbasierte quantifizierung des mitochondrialen membranpotentials und des superoxidspiegels mittels live-bildgebung in hela-zellen

Fluorescence-Based Quantification of Mitochondrial Membrane Potential and Superoxide Levels Using Live Imaging in HeLa Cells

Mitochondrien sind dynamische Organellen, die für die metabolische Homöostase entscheidend sind, indem sie die Energieproduktion durch ATP-Synthese steuern. Um den Zellstoffwechsel zu unterstützen, arbeiten verschiedene mitochondriale Qualitätskontrollmechanismen zusammen, um ein gesundes mitochondriales Netzwerk aufrechtzuerhalten. Ein solcher Weg ist die Mitophagie, bei der die PTEN-induzierte Kinase 1 (PINK1) und die Parkin-Phospho-Ubiquitinierung geschädigter Mitochondrien die Sequestrierung von Autophagosomen und die anschließende Entfernung aus der Zelle durch Lysosomenfusion erleichtern. Mitophagie ist wichtig für die zelluläre Homöostase, und Mutationen in Parkin werden mit der Parkinson-Krankheit (PD) in Verbindung gebracht. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde ein erheblicher Schwerpunkt auf die Untersuchung der mitochondrialen Schädigung und des Umsatzes gelegt, um die molekularen Mechanismen und die Dynamik der mitochondrialen Qualitätskontrolle zu verstehen. In dieser Arbeit wurde die Bildgebung lebender Zellen verwendet, um das mitochondriale Netzwerk von HeLa-Zellen sichtbar zu machen, um das mitochondriale Membranpotenzial und die Superoxidspiegel nach der Behandlung mit Carbonylcyanid m-chlorphenylhydrazon (CCCP), einem mitochondrialen Entkopplungsmittel, zu quantifizieren. Darüber hinaus wurde eine PD-chromosomale Mutation von Parkin (ParkinT240R) exprimiert, die die Parkin-abhängige Mitophagie hemmt, um zu bestimmen, wie sich die mutierte Expression auf das mitochondriale Netzwerk im Vergleich zu Zellen auswirkt, die Wildtyp-Parkin exprimieren. Das hier beschriebene Protokoll beschreibt einen einfachen Arbeitsablauf mit fluoreszenzbasierten Ansätzen zur effektiven Quantifizierung des mitochondrialen Membranpotentials und des Superoxidspiegels.

In diesem Protokoll wurde die fluoreszenzbasierte Quantifizierung verwendet, um das Membranpotenzial und den Superoxidspiegel des mitochondrialen Netzwerks nach der CCCP-Behandlung zu messen (Abbildung 1). In diesem Workflow wurden HeLa-Zellen verwendet, eine immortalisierte Zelllinie, die aus Gebärmutterhalskrebs gewonnen wurde. HeLa-Zellen werden routinemäßig zur Untersuchung der mitochondrialen Biologie verwendet und sind relativ flach, was es einfach macht, das mitochondriale Netzwerk mi...

Diese Technik beschreibt einen effektiven Arbeitsablauf zur Visualisierung und quantitativen Messung des mitochondrialen Membranpotentials und des Superoxidspiegels in HeLa-Zellen mittels fluoreszenzbasierter Live-Bildgebung.

Fluoreszenzbasierte Quantifizierung des mitochondrialen Membranpotentials und des Superoxidspiegels mittels Live-Bildgebung in HeLa-Zellen

Mitochondria are dynamic organelles critical for metabolic homeostasis by controlling energy production via ATP synthesis. To support cellular metabolism, ...

Diese Forschung konzentriert sich auf die Dysregulation von Mitochondrien bei neurodegenerativen Erkrankungen. Wir glauben, dass diese Forschung genutzt werden kann, um mögliche Ursachen für den Ausbruch von Krankheiten zu verstehen, die zu Therapeutika zur Bekämpfung neurodegenerativer Erkrankungen wie Parkinson und ALS führen könnten. Techniken wie die hochauflösende Mikroskopie wie STED und SIM oder die Expansionsmikroskopie haben die Fähigkeit verbessert, die Proteinverteilung innerhalb einzelner Organellen und die Verteilung der Mitochondrien in der gesamten Zelle genau zu verstehen.Die Ergebnisse dieser Technik können als Ausgangspunkt verwendet werden, um die Auswirkungen von Mutationen im Zusammenhang mit der Parkinson-Krankheit auf den mitochondrialen Umsatz zu untersuchen und zu verstehen, wie wichtig es ist, den Gehalt an reaktiven Sauerstoffspezies und das Potenzial der mitochondrialen Membran für die Aufrechterhaltung der neuronalen Gesundheit zu regulieren. Unser Labor zielt darauf ab, einzelne mitochondriale Qualitätskontrollwege mechanistisch zu charakterisieren, um das Zusammenspiel dieser Signalwege zu verstehen. Durch Einblicke in die Dynamik der Signalwege kann man verstehen, wie Mitochondrien erhalten werden und wie die mitochondriale Dysregulation zum Ausbruch neurodegenerativer Erkrankungen beiträgt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Überwachung dynamischen Veränderungen in der mitochondrialen Kalzium während der Apoptose mit einem genetisch kodierten Kalzium-Sensor

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Die konfokale Bildgebung von Einzel Mitochondrial Super Blinkt Intact Herz oder In Vivo

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Grundzustand Erschöpfung Super-Resolution Imaging in Säugerzellen

Erfahren Sie die fluoreszenzbasierte Quantifizierung des mitochondrialen Membranpotentials und Superoxidspiegels mittels Live-Bildgebung in HeLa-Zellen. Diese Methode unterstützt die Erforschung neurodegenerativer Erkrankungen.

Fluoreszenzbasierte Quantifizierung des mitochondrialen Membranpotentials und des Superoxidspiegels mittels Live-Bildgebung in HeLa-Zellen (Video) | JoVE Journal

Fluoreszenzbasierte Quantifizierung des mitochondrialen Membranpotentials und des Superoxidspiegels mittels Live-Bildgebung in HeLa-Zellen

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