Name: Quantifizierung von Adeno-assoziierten viralen Genomen in gereinigten Vektorproben durch digitale Tröpfchenpolymerase-Kettenreaktion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-11T14:40:00.000+00:00
Duration: 4 min 43 s
Description: Lernen Sie die digitale Tröpfchen-PCR zur präzisen Quantifizierung von Adeno-assoziierten Virusgenomen in gereinigten Vektorproben. Diese standardisierte Methode verbessert die Zuverlässigkeit in der Gentherapie-Forschung.

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<meta charset="utf8"></head><body>Standardisiertes Protokoll für die Quantifizierung des viralen Genoms mittels digitaler Tröpfchen-PCR

<ol><li>Balakrishnan, B., Jayandharan, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+biology+of+adeno-associated+virus+%28AAV%29+vectors+used+in+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Basic biology of adeno-associated virus (AAV) vectors used in gene therapy.</a> Curr Gene Ther. 14 (2), 86-100 (2014).</li>
<li>Srivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+tissue-tropism+of+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Virol%22%5BJournal%5D)">In vivo tissue-tropism of adeno-associated viral vectors.</a> Curr Opin Virol. 21, 75-80 (2016).</li>
<li>Pupo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV+vectors%3A+The+Rubik%27s+cube+of+human+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">AAV vectors: The Rubik's cube of human gene therapy.</a> Mol Ther. 30 (12), 3515-3541 (2022).</li>
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<li>Brimble, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preventing+packaging+of+translatable+P5-associated+DNA+contaminants+in+recombinant+AAV+vector+preps%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Preventing packaging of translatable P5-associated DNA contaminants in recombinant AAV vector preps.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 24, 280-291 (2022).</li>
<li>Wright, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Product-related+impurities+in+clinical-grade+recombinant+AAV+vectors%3A+Characterization+and+risk+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Product-related impurities in clinical-grade recombinant AAV vectors: Characterization and risk assessment.</a> Biomedicines. 2 (1), 80-97 (2014).</li>
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<li>Sidransky, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+ras+oncogene+mutations+in+the+stool+of+patients+with+curable+colorectal+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of ras oncogene mutations in the stool of patients with curable colorectal tumors.</a> Science. 256 (5053), 102-105 (1992).</li>
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<li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Anal Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).</li>
<li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+droplet+digital+polymerase+chain+reaction+format+for+DNA+copy+number+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification.</a> Anal Chem. 84 (2), 1003-1011 (2012).</li>
<li>Sanmiguel, J., Gao, G., Vandenberghe, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+digital+droplet-based+AAV+genome+titration%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative and digital droplet-based AAV genome titration.</a> Methods Mol Biol. 1950, 51-83 (2019).</li>
<li>Bio-Rad Laboratories Inc. Planning droplet digital PCR experiments. , 
 <a target="_blank" href="https://www.bio-rad.com/en-in/life-science/learning-center/introduction-to-digital-pcr/planning-ddpcr-experiments">https://www.bio-rad.com/en-in/life-science/learning-center/introduction-to-digital-pcr/planning-ddpcr-experiments</a> (2024).</li>
<li>Dorange, F., Le Bec, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+approaches+to+characterize+AAV+vector+production+%26+purification%3A+Advances+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Gene+Ther+Insights%22%5BJournal%5D)">Analytical approaches to characterize AAV vector production & purification: Advances and challenges.</a> Cell Gene Ther Insights. 4 (2), 119-129 (2018).</li>
<li>Lock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+determination+of+single-stranded+and+self-complementary+adeno-associated+viral+vector+genome+titers+by+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Methods%22%5BJournal%5D)">Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR.</a> Hum Gene Ther Methods. 25 (2), 115-125 (2014).</li>
<li>Prantner, A., Maar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+concentration%2C+characterization%2C+and+integrity+analysis+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors+using+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genome concentration, characterization, and integrity analysis of recombinant adeno-associated viral vectors using droplet digital PCR.</a> PLoS One. 18 (1), e0280242(2023).</li>
<li>Dobnik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+quantification+and+characterization+of+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors.</a> Front Microbiol. 10, 1570(2019).</li>
<li>Suoranta, T., Laham-Karam, N., Yla-Herttuala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+protocol+for+accurate+titration+of+adeno-associated+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Optimized protocol for accurate titration of adeno-associated virus vectors.</a> Hum Gene Ther. 32 (19-20), 1270-1279 (2021).</li>
<li>Bio-Rad. Droplet digital PCR applications guide. Bulletin 6407. , 
 <a target="_blank" href="https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6407.pdf">https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6407.pdf</a> (2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>8-Kanal-Pipette 10 & Mikro; L</td><td>Eppendorf</td><td>3,12,50,00,010</td><td></td></tr><tr><td>8-Kanal-Pipette 200 & Mikro; L</td><td>Eppendorf</td><td>3,12,50,00,036</td><td></td></tr><tr><td>8-Kanal-Pipette 300 & Mikro; L</td><td>Eppendorf</td><td>3,12,50,00,052</td><td></td></tr><tr><td>8-Well-PCR-Streifen</td><td>Sarstedt</td><td>72.991.002</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch Thermocycler mit 96&ndash; Deep-Well-Reaktionsmodul</td><td>Bio-Rad</td><td>1851197</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Pufferkontrolle für Sonden 9 mL (2 x 4,5 mL)</td><td>Bio-Rad</td><td>1863052</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Supermix für Sonden (kein dUTP) (2 x 1 ml)</td><td>Bio-Rad</td><td>1863023</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR 96-Well-Platten (Packung mit 25 Stück)</td><td>Bio-Rad</td><td>12001925</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Tröpfchen-Reader-Öl (2 x 1 l)</td><td>Bio-Rad</td><td>1863004</td><td></td></tr><tr><td>DG8 Kartuschenhalter</td><td>Bio-Rad</td><td>1863051</td><td></td></tr><tr><td>DG8 Kartuschen für QX200/QX100 (Packung à 24)</td><td>Bio-Rad</td><td>1864008</td><td></td></tr><tr><td>DG8 Dichtungen für QX200/QX100 (Packung à 24)</td><td>Bio-Rad</td><td>1863009</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (10U/&micro; L) + Puffer</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td></td></tr><tr><td>Tröpfchenöl für Sonden (10 x 7 mL)</td><td>Bio-Rad</td><td>1863005</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ep Dualfilter T.I.P.S. Filterspitze, 0,1-10 μm; L, 34 mm, Rack, PCR sauber, STERIL&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>30078500</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ep Dualfilter T.I.P.S. Filterspitze, 20-300 &mu; L, 55 mm, Rack, PCR Clean, STERIL&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>30078560</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ep Dualfilter T.I.P.S. Filterspitze, 2-100 &mu; L, 53 mm, Rack, PCR sauber, STERIL&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>30078543</td><td></td></tr><tr><td>Forward lyophilisierte Primer und entsprechende Master-Materialien bei 100 mM&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td>GFP als Zielsequenz. Primer vorne: 5'-GAACGGCATCAAGGTGAACT-3'</td></tr> <tr><td>Lyopohilisierte Sonde und Mastermaterial bei 100 &; Mikro; M&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td>GFP als Zielsequenz. PrimeTime Eco Probe: /56-FAM/CAAGATCCG/ZEN/CCACAACATCGAGGA/3IABkFQ/</td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid (MgCl2)</td><td>Chemlab Analytical</td><td>CL00.1381</td><td></td></tr><tr><td>Nukleasefreies Wasser</td><td>IDT</td><td>11-04-02-01</td><td></td></tr><tr><td>PCR-Platten-Heißsiegel, Folie, durchstechbar (Packung mit 100)</td><td>Bio-Rad</td><td>1814040</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-68 nichtionisches Tensid (100x)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24040032</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid (KCl)</td><td>Honeywell Forschungschemikalien</td><td>31248</td><td></td></tr><tr><td>QX Manager-Software</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Software zur Analyse von ddPCR-Daten</td></tr><tr><td>QX200 Tröpfchengenerator</td><td>Bio-Rad</td><td>1864002</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Tröpfchenleser</td><td>Bio-Rad</td><td>1864003</td><td></td></tr><tr><td>Reagenzreservoir</td><td>VWR</td><td>613-1181</td><td></td></tr><tr><td>Reverse lyophilisierte Primer und entsprechende Master-Primer bei 100 mM&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td>GFP als Zielsequenz. Reverse Primer: 5'-TGCTCAGGTAGTGGTTGTCG-3'SafeSeal</td></tr> <tr><td>Reaktionsröhrchen, 1,5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.706.200</td><td></td></tr><tr><td>Lachs Spermien DNA, geschert (10 mg/ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9680</td><td></td></tr><tr><td>TE Puffer</td><td>IDT</td><td></td><td>Begleitet von Primern bei Bestellung</td></tr> von <tr><td>Trishydrochlorid (Tris-HCl)</td><td>Roche</td><td>10812846001</td><td></td></tr></tbody></table>

quantifizierung von adeno-assoziierten viralen genomen in gereinigten vektorproben durch digitale tröpfchenpolymerase-kettenreaktion

Quantification of Adeno-Associated Viral Genomes in Purified Vector Samples by Digital Droplet Polymerase Chain Reaction

Die Ergebnisse können mit entsprechender Software visualisiert werden. Für jedes Well zeigt das 1D-Amplitudendiagramm alle Tröpfchen relativ zu ihrer Amplitude an. Es wird eine klare Trennung zwischen positiven und negativen Tröpfchen erwartet. Wenn mehr als 10 % der gesamten Tröpfchen zwischen der positiven und der negativen Tröpfchenwolke gefunden werden (ein Phänomen, das als Tröpfchenregen bezeichnet wird), muss die Probe erneut gemessen werden (siehe Abbildung 1). Weitere Informationen zum Thema Tröpfchenregen finden Sie in der Diskussion.
Es kann eine Datentabelle erstellt werden, in der alle aufgezeichneten Informationen zusammengefasst werden, einschließlich des Probennamens, der Anzahl der akzeptierten Tröpfchen (Ereigniszählungen) und der Konzentration (Kopien/μl). Im Idealfall sollte die Ereignisanzahl zwischen 15.000 und 20.000 akzeptierten Droplets liegen. Wenn die Ereignisanzahl für ein Bohrloch unter 10.000 liegt, sollte der Datenpunkt aus der Analyse ausgeschlossen werden. Ein Beispiel für die Ausgabedaten ist in Tabelle 5 enthalten.
Der vg-Titer kann auf der Grundlage der Konzentration (Kopien/μL) unter Berücksichtigung der Probenverdünnungen berechnet werden. Der Arbeitsbereich von dd_PCR beträgt 10-10.000 Kopien/μl. Werte unter 10 Kopien/μl sollten von der Analyse ausgeschlossen werden. Es sollten der vg-Titer für die Proben sowie die Positiv- und Negativkontrollen berechnet werden. Der gemessene Wert der Positivkontrolle sollte einen Variationskoeffizienten (%CV) von weniger als 20 % bezogen auf den theoretischen Wert haben. Die Negativkontrolle sollte weniger als 5 Kopien/μl betragen. Zusätzlich sollte der %CV zwischen Wiederholungen und verschiedenen Verdünnungen für jede Probe berechnet werden. Wenn der %CV zwischen den verschiedenen Verdünnungen 20 % überschreitet, kann der Wert als ungenau angesehen werden, und die Probe muss möglicherweise erneut gemessen werden.
Eine erfolgreiche Messung zeichnet sich durch eine klare Trennung der positiven und negativen Tröpfchenwolke, mindestens 10.000 akzeptierte Tröpfchen, einen Wert zwischen 10 Kopien/μL und 10.000 Kopien/μL und einen %CV zwischen den Wiederholungen von weniger als 20% aus.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67252/67252fig01.jpg"> Abbildung 1: Visualisierung von dd_PCR Tröpfchen. (A) Das 1D-Amplitudendiagramm zeigt eine klare Trennung von positiven und negativen Tröpfchen, was auf eine erfolgreiche Tröpfchenpartitionierung hinweist. (B) Das Diagramm zeigt eine schlechte Trennung von positiven und negativen Tröpfchen, die als Tröpfchenregen bezeichnet wird, was auf eine suboptimale Aufteilung oder mögliche Probleme mit dem Assay hindeutet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67252/67252fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67252/67252fig02.jpg"> Abbildung 2: Arbeitsablauf zur Quantifizierung viraler Genome mittels digitaler Tröpfchen-PCR. (1) Puffer, Reagenzien und Lösungen werden gemäß den Anweisungen des Herstellers oder Schritt 1 des Protokolls (Herstellung von Stammlösungen) hergestellt. (2) 45 μl der DNase I-Lösung werden in jedes Röhrchen eines 8-Röhrchen-PCR-Streifens aliquotiert. Nach dem Vortexen und kurzen Zentrifugieren der Proben werden 5 μL der Probe in eines der Röhrchen gegeben. Die DNase I und der probenhaltige PCR-Streifen mit acht Röhrchen werden in einem Thermocycler für 1 h bei 37 °C inkubiert, gefolgt von seriellen Verdünnungen der Proben. (3) Der PCR-Mastermix wird wie beschrieben hergestellt und 19,8 μl werden in jedes Röhrchen eines 8-Röhrchen-PCR-Streifens aliquotiert. Proben-Reihenverdünnungen aus Schritt 2 werden dem Mastermix zugesetzt. 20 μL des Mastermix plus Die Probenlösung wird in die mittlere Reihe der Kartusche geladen, und 60 μl Öl zur Tröpfchenerzeugung werden in die unteren Vertiefungen einer tröpfchenerzeugenden Kartusche geleitet. Die Kartusche wird dann in den Tröpfchengenerator eingelegt und läuft unter festgelegten Bedingungen. Nach der Tröpfchenerzeugung werden 42,5 μl aus der oberen Reihe der Kartusche auf eine Multi-Well-PCR-Platte übertragen. (4) Die PCR-Platte wird in einen PCR-Thermocycler eingelegt und gemäß den bereitgestellten Bedingungen betrieben. Die Analyse der Platte erfolgt mit einem dd_PCR Reader. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67252/67252fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Tabelle 1: Genauigkeitsdaten. Diese Tabelle enthält Präzisionsdaten von vier Sätzen von Qualitätskontrollproben (QC) mit jeweils fünf Konzentrationen (QC1-QC5). Jede QC wurde fünfmal gemessen. Dargestellt ist der Variationskoeffizient (%CV) zwischen verschiedenen Durchläufen, der die Wiederholgenauigkeit (A) darstellt, und zwischen verschiedenen Probensätzen, der die Zwischengenauigkeit (B) darstellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67252/67252_Table%201.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Tabelle 2: Verdünnungen der Proben. Die Tabelle zeigt die empfohlenen Probenverdünnungen basierend auf dem erwarteten viralen Genomtiter (vg/mL). Es werden insgesamt drei Verdünnungen empfohlen, um sicherzustellen, dass mindestens zwei Werte innerhalb des Arbeitsbereichs des Assays liegen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67252/67252_Table%202.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Tabelle 3: dd_PCR Mastermix-Komposition. In dieser Tabelle ist die Zusammensetzung des dd_PCR Mastermixes aufgeführt, der einen Vorwärts- und Rückwärtsprimer (909 nM), eine Sonde (227 nM) und dd_PCR Supermix für Sonden (ohne dUTP, 1x) umfasst. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67252/67252_Table%203.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Tabelle 4: Bedingungen für Thermozyklen. In der Tabelle ist das empfohlene PCR-Programm aufgeführt, das Folgendes umfasst: (1) eine 10-minütige Inkubation bei 95 °C zur Kapsidaufschluss und Enzymaktivierung, (2) 40 Zyklen à 30 s bei 94 °C für die DNA-Denaturierung und 1 min bei 60 °C für das Glühen und die Verlängerung, (3) eine 10-minütige Inkubation bei 98 °C zur Deaktivierung des Enzyms, und (4) bei 4 °C halten. Die Glühtemperatur kann je nach verwendetem Primer-/Sondensatz optimiert werden müssen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67252/67252_Table%204.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Tabelle 5: Beispiel für Ausgabedaten aus einem tatsächlichen AAV-Lauf. Die Tabelle enthält ein Beispiel für Ausgabedaten aus einem tatsächlichen AAV-Lauf, bei dem eine Probe in zwei verschiedenen Verdünnungen gemessen wurde, jeweils in doppelter Hinsicht. Der Titer des viralen Genoms (vg) (in vg/ml) wird nach folgender Formel berechnet: 10 (DNase I-Vorbehandlung) x 10 (Verdünnung im Mastermix) x 1.000 (μl zu ml) x Verdünnung in AAV-Verdünnungspuffer. STDEV stellt die Standardabweichung dar, und CV gibt den Variationskoeffizienten an. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67252/67252_Table%205.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>

Quantifizierung von Adeno-assoziierten viralen Genomen in gereinigten Vektorproben durch digitale Tröpfchenpolymerase-Kettenreaktion

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