Name: Mikroinjektion von rekombinantem RCAS(A)-Retrovirus in embryonale Hühnerlinse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-01T14:05:00.000+00:00
Duration: 4 min 58 s
Description: Lernen Sie die Mikroinjektion von RCAS(A)-Retrovirus in embryonale Hühnerlinsen zur Untersuchung der Proteinfunktion während der Linsenentwicklung. Diese Methode ermöglicht gezielte Gentransfer-Studien in vivo.

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Diese Arbeit wurde durch die National Institutes of Health (NIH) Grants: RO1 EY012085 (an J.X.J) und F32DK134051 (an F.M.A.) und die Welch Foundation Grants: AQ-1507 (an J.X.J.) unterstützt. Der Inhalt liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health dar. Die Figuren wurden teilweise mit Biorender.com erstellt.

Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit dem Tierschutzgesetz und der Durchführungsverordnung zum Tierschutz nach den Grundsätzen des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren durchgeführt. Alle Tierbehandlungen wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee am Health Science Center der University of Texas in San Antonio genehmigt. Eine Übersicht über das Protokoll finden Sie in Abbildung 1. Einzelheiten zu allen Materialien, Reagenzien und Instrumenten, die in diesem Protokoll verwendet werden, finden Sie in der Materialtabelle .
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65727/65727fig01.jpg"> Abbildung 1: Experimentelle Gliederung. 1 . Der erste Schritt des Protokolls ist die Bestimmung eines bestimmten Zielproteins/der spezifischen Zielproteine, die Identifizierung der zugehörigen Gensequenz(en) und die Generierung von DNA-Fragmenten. 2 . Klonierung der Gensequenz(en) in einen retroviralen Vektor durch initiale Klonierung in einen Adaptervektor, 3. gefolgt von einem viralen Vektor . 4 . Herstellung von hochtiterhaltigen Viruspartikeln unter Verwendung von Verpackungszellen zur Ernte und Konzentrierung. 5 . Der letzte Schritt und der Schwerpunkt dieses Protokolls ist die Mikroinjektion der RCAS(A)-Viruspartikel in das Linsenlumen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65727/65727fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
1. Herstellung von rekombinanten Retroviren mit hohem Titer
<ol><li>Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zur Herstellung von DNA-Fragmenten des Zielproteins HINWEIS: Dieser Abschnitt zielt darauf ab, die DNA-Sequenz zu amplifizieren, die dem Ziellinsenprotein entspricht. Weitere Informationen finden Sie unter 7,8.<ol><li>Entwerfen von Primern für die PCR, die dem interessierenden Protein entsprechen, um DNA-Fragmente mit ihren Carboxyltermini im Rahmen mit oder ohne eine FLAG-Epitopsequenz (5'-GACTACAAGGACGACGACGATGACAAG-3'), ein Stoppcodon und eine Restriktionsenzymstelle (d. h. EcoRI) innerhalb der Polylinkerregion von CLa12NCO) gemäß den in zuvor veröffentlichten Protokollen angegebenen Spezifikationen mit Sequenzen für adäquate Restriktionsenzyme1 herzustellen, 7,8,10,11.</li>
		<li>Führen Sie die PCR-Reaktion10 durch. Kombinieren Sie 100 pmol Sense und Antisense der entworfenen Primer mit 0,5 μg Connexin-cDNA (z. B. Cx50, Cx43 oder chimäre Cx50*43L-Kombinationen) zum PCR-Reaktionspuffer Ihrer Wahl. Führen Sie 30 Zyklen durch, die jeweils aus 94 °C für 1 Minute, 58 °C für 1 Minute und 72 °C für 1 Minute bestehen, gefolgt von einer letzten Verlängerung für 10 Minuten bei 72 °C.</li>
		<li>Isolieren und reinigen Sie PCR-Produkte mit einem Gel-Aufreinigungskit.</li>
		<li>Verdauen Sie die gereinigten PCR-Produkte mit Restriktionsenzymen Ihrer Wahl gemäß den Anweisungen des Herstellers.</li>
	</ol></li>
	<li>Klonierung von DNA-Inserten in Adapterplasmid ANMERKUNG: Durch das Einfügen von DNA-Fragmenten in einen Adaptervektor werden keine Helferzellen/Viren benötigt, um die Stabilität des RCAS(A)-Vektors zu erhöhen14. Weitere Informationen finden Sie unter 7,8.<ol><li>Subklonieren von DNA-Fragmenten in ein Adapterplasmid, Cla12NCO, unter Verwendung einer Klebrigkeits-End-Ligationsreaktion. Mischen Sie die PCR-Fragmente mit Restriktionsenzymen und Cla12NCO in einem Verhältnis von 2-5:1. Führen Sie Ligation und DNA-Transformation mit kompetenten Zellen durch.</li>
		<li>Isolieren Sie DNA mit einem DNA-Isolierungskit.</li>
		<li>Sequenzieren Sie die DNA, um die Genauigkeit zu gewährleisten.</li>
	</ol></li>
	<li>Klonierung in den viralen RCAS(A)-Vektor ANMERKUNG: DNA-Fragmente werden in ein Vehikel (RCAS(A)-Retrovirus) eingefügt, um die stabile Transduktion eines Gens in Zellen des sich entwickelnden Kükenembryos zu ermöglichen14,15. Weitere Informationen finden Sie unter 7,8,15.<ol><li>Das Cla12NCO-DNA-Fragment des interessierenden Vektors wird mit ClaI (1 Einheit pro 1 μg DNA) verdaut und die Fragmente werden gelisoliert.</li>
		<li>Subklonieren Sie die DNA-Fragmente in ein ClaI-linearisiertes RCAS(A)-Plasmid. Verwenden Sie das Restriktionsenzym SalI, um die ClaI-Stelle auf dem RCAS(A)-Plasmid zu unterscheiden.</li>
		<li>Bestätigen Sie die korrekte Ausrichtung der eingefügten Fragmente auf den Konstrukten durch Verdauung mit ClaI- und SalI-Restriktionsenzymen.</li>
		<li>Isolieren Sie DNA mit einem DNA-Isolierungskit.</li>
		<li>Bestimmen Sie die DNA-Konzentration.</li>
	</ol></li>
	<li>Transfektion von embryonalen Fibroblastenzellen (CEF) von Küken und RCAS(A)-Ernte HINWEIS: Virusverpackungszellen, CEFs, werden verwendet, um Zellkulturmedien zu gewinnen/zu ernten, die Viruspartikelenthalten 15,16. Weitere Informationen finden Sie unter 7,8,15.<ol><li>Transfizieren Sie CEF-Zellen mit rekombinanten retroviralen DNA-Konstrukten unter Verwendung des Transfektionsmittels gemäß den Anweisungen des Herstellers.</li>
		<li>Führen Sie ein Western Blot der transfizierten Zellen durch, um ihre Expression des interessierenden Proteins zu untersuchen.</li>
		<li>Wenn die transfizierten Zellen die Konfluenz erreicht haben, beginnen Sie mit dem Sammeln des überstehenden Mediums, verarbeiten/filtern Sie es entsprechend (um Zelltrümmer mit einem 0,22-μm-Filter zu entfernen) und lagern Sie es bei -80 °C, bis es zur Konzentration bereit ist.</li>
	</ol></li>
	<li>Konzentration und Titrierung von Virusbeständen HINWEIS: Das Pellet und große Medienmengen, die von den Zellen stammen, die die Viruspartikel enthalten, müssen gefiltert werden. Zusätzlich muss ein Virustiter-Assay durchgeführt werden, um die Stärke des Virus gegen die Wirtszellen zu ermitteln. Weitere Informationen finden Sie unter 6,7,8,15.<ol><li>Tauen Sie die Nährmedien mit den Virionen auf.</li>
		<li>Drehen Sie das Nährmedium bei 72.000 × g für 2 h bei 4 °C.</li>
		<li>Dekantieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das virale Pellet mit dem Restmedium (~50 μl) und lagern Sie es bis zur Verwendung bei -80 °C in ~10 μl viralen Vorräten.</li>
		<li>Für die Titerisierung werden die Zellen entweder mit QT-6- oder CEF-Zellen mit einer seriellen Verdünnung der Virusbestände transfektiert.</li>
		<li>Nach der Konfluenz fixieren Sie die Zellen mit 4% Formaldehyd.</li>
		<li>Immunfärbung für virale Gag-Proteine oder Prozess für alkalische Phosphatase histochemisch, um den Titer zu erhalten, definiert als (koloniebildende Einheiten) KBE pro Milliliter (KBE/ml).</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65727/65727fig02.jpg"> Abbildung 2: Instrumente und Aufbau für die Mikroinjektion von Kükenlinsen . (A) P-30 manueller vertikaler Mikroelektroden-Mikropipettenzieher. (1) Einschub, der zeigt, wie eine Glasmikropipette gezogen wird. (B) (2) Eier-Inkubator. Hühnerei ~65-68 h in einem 37 °C warmen Inkubator inkubieren, um Stadium 18 (mit einem versiegelten, leeren zentralen Lumen) für die Injektion des Retrovirus zu erreichen. (C) Aufbau der Mikroinjektion. (3) Beleuchtungsgeräte, (4) Pico-Injektor, (5) Präpariermikroskop, (6) Drummond-Mikromanipulator, (7) Computer/Kamera zur Visualisierung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65727/65727fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
2. Mikroinjektion der Kükenlinse
<ol><li>Vorbereitung von Vorräten<ol><li>Vorbereitung von Glasmikropipetten für die Mikroinjektion17 HINWEIS: Glaskapillaren werden zur Herstellung von Glasmikropipetten mit einer Spitzenspitze und einem Außendurchmesser (OD) von ~11 μm für die Mikroinjektion verwendet. Der Aufbau ist in Abbildung 2A dargestellt.<ol><li>Befestigen Sie die Borosilikatglaskapillare an den gummigepolsterten Clips des manuellen vertikalen Mikropipettenziehers.</li>
			<li>Heiztemperatur (HEAT 1) auf 950 °C einstellen und Vorziehen durchführen, um eine dünnere und weichere Glaskapillare zu erhalten.</li>
			<li>Stellen Sie die Heiztemperatur (HEAT 2) auf 790 °C ein und führen Sie einen sekundären Zug durch, um die endgültigen Mikropipetten herzustellen.</li>
			<li>Mit einem Mikropipettenschleifer schärfen Sie die Spitzenöffnung auf einen Außendurchmesser von ~11 μm.</li>
			<li>Für zukünftige Experimente bewahren Sie die Glasmikropipetten in einem Schwammklemmkissen in einem Glasgefäß auf.</li>
		</ol></li>
		<li>Bebrütung befruchteter Eier bis zum Entwicklungsstadium 18 HINWEIS: Während der Linsenentwicklung, bei ~65-68 h der Embryonalentwicklung, trennt sich die Linse vom Ektoderm und bildet ein versiegeltes Vesikel mit einem zentralen Lumen; Injektion in dieses leere Linsenlumen, um die Expression auf proliferative Linsenzellen zu beschränken 7,8,18.<ol><li>Befruchtete Hühnereier werden ~65-68 h in einem 37 °C befeuchteten Schaukelinkubator bebrütet (Abbildung 2B).</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Öffnen des Hühnereis HINWEIS: Dieser Schritt beschreibt die Identifizierung und Exposition des Embryos für die Mikroinjektion. Weitere Informationen finden Sie unter 7,8.<ol><li>Wischen Sie den Arbeitsbereich gründlich mit 70%igem Ethanol ab.</li>
		<li>Nehmen Sie die Eier aus dem Inkubator, besprühen Sie sie stark mit 70%igem Ethanol und lassen Sie sie an der Luft trocknen.</li>
		<li>Legen Sie das Ei mit dem größeren Ende des Eies nach oben auf einen Eierhalter.</li>
		<li>Führe mit einer Pinzette mit scharfen Zähnen ein Loch von ~2 cm Durchmesser am größeren Ende des Eies ein, indem du vorsichtig auf die Eierschale klopfst und Fragmente der Eierschale entfernst (Abbildung 3A).</li>
		<li>Lokalisieren Sie den Embryo mit einem Präpariermikroskop.</li>
		<li>Sobald der Embryo und die Kükenlinse lokalisiert sind, schneiden Sie mit dem Präpariermikroskop und einer feinen Präparierzange und Schere die Amnionmembran ab, die die Oberseite des Embryos unmittelbar bedeckt (Abbildung 3B). HINWEIS: Schneiden Sie nicht zu weit (nur genug, um den Embryo ~0,5 cm x 0,5 cm freizulegen), da die Embryonen sonst in die Dottermasse sinken könnten; Vermeiden Sie nach Möglichkeit auch das Berühren von Blutgefäßen.</li>
		<li>Decken Sie die Öffnung des Eies mit einer 60 mm Petrischale ab, um die nächsten Schritte vorzubereiten.</li>
	</ol></li>
	<li>Mikroinjektion von konzentriertem Virusmaterial HINWEIS: Viruspartikel, die DNA-Fragmente des Zielproteins für die Transduktion enthalten, werden in Zellen innerhalb des Linsenlumens eingefügt. Der Aufbau ist in Abbildung 2C dargestellt. Weitere Informationen finden Sie unter 6,7,8.<ol><li>Tauen Sie die viralen Vorräte auf Eis auf.</li>
		<li>Zur Visualisierung des Virusbestands während der Injektion verdünnen Sie 1 μl 10x Fast green in eine Durchstechflasche mit Virusvorrat mit 10 μl.</li>
		<li>Um sicherzustellen, dass keine großen Brocken ungelösten Materials vorhanden sind, die die Glasmikropipette verstopfen könnten, zentrifugieren Sie die Lösungen 10 s lang bei 10.000 × g bei 4 °C, um "große Brocken" zu pelletieren und die Überstände in neue Röhrchen zu überführen, während die Lösungen auf Eis bleiben.</li>
		<li>Legen Sie auf eine 35 mm x 10 mm große Kulturschale einen gestreckten Labor-Parafilm und geben Sie 1 μl sterile Kochsalzlösung (PBS) auf den Film (nicht sterilisiert, wobei die abgedeckte Seite als "sauber" gilt).</li>
		<li>Schließen Sie eine präparierte Glasmikropipette an einen automatischen Pico-Injektor an.</li>
		<li>Drücken Sie den Füllmodus , um die sterile Kochsalzlösung (PBS) in eine Glasmikropipette zu füllen, und verwenden Sie dann den Injektionsmodus , um die zugewiesenen 1 μl Flüssigkeit zu testen.</li>
		<li>Legen Sie einen zweiten gestreckten Laborfilm auf die Oberfläche einer neuen 35 mm x 10 mm großen Zellkulturschale und geben Sie 1 μl grün gefärbte Virusvorräte von Fast auf die Folie.</li>
		<li>Senken Sie die Spitze der Mikropipette in den Virusvorrat und drücken Sie auf das Füllmodell , um die Glasmikropipette mit ~1 μl Virusmaterial zu füllen. HINWEIS: Um ein Austrocknen zu vermeiden, legen Sie die Spitze der gefüllten Mikropipette immer dann in sterile Kochsalzlösung (PBS), wenn es eine Pause im Verfahren gibt.</li>
		<li>Senken Sie die gefüllte Mikropipette aus Glas, die mit einem automatischen Injektor verbunden ist, mit Hilfe eines Präpariermikroskops in den Zielbereich des Lumens der Embryolinse ab.</li>
		<li>Stellen Sie die Lichtquelle so ein, dass die Umrisse des Linsenvesikels klar sichtbar sind. HINWEIS: Das Lumen der rechten Linse (mit dem Gesicht nach oben) wird in der Regel für die Injektion verwendet und das Lumen der linken Linse (mit dem Gesicht nach unten) wird als kontralaterale Kontrolle intakt gehalten.</li>
		<li>Sobald Sie sicher sind, dass sich die Mikropipette an der richtigen Stelle im Linsenlumen befindet, injizieren Sie 5-40 nL des Virusvorrats (Abbildung 3C). HINWEIS: Übung ist für eine optimale Injektionsplatzierung sehr notwendig.</li>
		<li>Warten Sie ~45 s und entfernen Sie dann vorsichtig die Glasmikropipette.</li>
		<li>Überprüfen Sie mit dem Präpariermikroskop die erfolgreiche Mikroinjektion in das Linsenlumen, indem Sie den Farbstoff Fast Green untersuchen, der im leeren Lumen der Linse verbleiben sollte, ohne dass es zu Leckagen kommt.</li>
		<li>Nach dem Injektionsvorgang wird die Eierschalenöffnung mit Tesafilm verschlossen.</li>
		<li>Der Embryo wird ohne Drehbewegung in den 37 °C warmen Befeuchtungsinkubator zurückgelegt, bis das gewünschte Embryonalalter für die Linsendissektion erreicht ist.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65727/65727fig03.jpg"> Abbildung 3: Mikroinjektions-Kükenvorbereitung und schematische Darstellung . (A) Öffnen eines Hühnereies. (B) Durchtrennen der Fruchtblase. (C) Schematische Darstellung der Mikroinjektion von Hühnerlinsenlumen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65727/65727fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Untersuchung der Proteinexpression während der Entwicklung von Hühnerlinsen

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<li>West-Mays, J. A., Pino, G., Lovicu, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+use+of+the+lens+epithelial+explant+system+to+study+lens+differentiation+and+cataractogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Development and use of the lens epithelial explant system to study lens differentiation and cataractogenesis.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 29 (2), 135-143 (2010).</li>
<li>Upreti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lens+epithelial+explants+treated+with+vitreous+humor+undergo+alterations+in+chromatin+landscape+with+concurrent+activation+of+genes+associated+with+fiber+cell+differentiation+and+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Lens epithelial explants treated with vitreous humor undergo alterations in chromatin landscape with concurrent activation of genes associated with fiber cell differentiation and innate immune response.</a> Cells. 12 (3), 501(2023).</li>
<li>Walker, J. L., Wolff, I. M., Zhang, L., Menko, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+SRC+kinases+signals+induction+of+posterior+capsule+opacification%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Activation of SRC kinases signals induction of posterior capsule opacification.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (5), 2214-2223 (2007).</li>
<li>Briskin, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+retroviral+transgenes+are+highly+expressed+in+chickens%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Heritable retroviral transgenes are highly expressed in chickens.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (5), 1736-1740 (1991).</li>
<li>Hughes, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RCAS+vector+system%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Biologica%22%5BJournal%5D)">The RCAS vector system.</a> Folia Biologica. 50 (3-4), 107-119 (2004).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass die Forschung in Abwesenheit von kommerziellen oder finanziellen Beziehungen durchgeführt wurde, die als potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnten.

Dieses experimentelle Modell bietet die Möglichkeit, das/die interessierende(n) Protein(e) in der intakten Linse zu exprimieren, was zur Untersuchung der funktionellen Relevanz dieser Proteine für die Struktur und Funktion der Linse führt. Das Modell der Mikroinjektion von embryonalen Küken basiert teilweise auf den Arbeiten von Fekete et. al.6 und wurde von Jiang et. al.8 und wurde als Mittel zum Einfügen von viralen Plasmiden und Wirkstoffen wie Agonisten, kleiner interfe...

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Methodik der Mikroinjektion eines RCAS(A) (replikationskompetentes aviäres Sarkom/Leukose-Retrovirus A) in embryonale Hühnerlinsen zu beschreiben. Die effektive retrovirale Verabreichung in eine embryonale Hühnerlinse hat sich als vielversprechendes Werkzeug für die In-vivo-Untersuchung des molekularen Mechanismus und der Strukturfunktion von Linsenproteinen in normaler Linsenphysiologie, pathologischen Bedingungen und Entwicklung erwiesen. Darüber hinaus könnte dieses experimentelle Modell für die Identifizierung therapeutischer Ziele und das Screening von Medikamenten für Erkrankungen wie den menschlichen kongenitalen Katarakt verwendet werden. Insgesamt zielt dieses Protokoll darauf ab, die notwendigen Schritte für die Entwicklung einer anpassbaren Plattform für die Untersuchung von Linsenproteinen festzulegen.
Embryonale Küken (Gallus domesticus) sind aufgrund ihrer Ähnlichkeit in Linsenstruktur und -funktion mit der menschlichen Linse ein etabliertes Tiermodell für die Untersuchung der Linsenentwicklung und -physiologie 1,2,3,4. Die Verwendung eines RCAS(A)-replikationskompetenten aviären Retrovirus gilt als hocheffektives, schnelles und anpassbares System zur Expression exogener Proteine in Kükenembryonen. Insbesondere hat es eine einzigartige Fähigkeit, den Zielgentransfer auf proliferative Linsenfaserzellen zu beschränken, ohne dass gewebespezifische Promotoren erforderlich sind, wobei der einzigartige embryonale Entwicklungszeitrahmen verwendet wird, in dem das Vorhandensein von leerem Linsenlumen eine In-situ-RCAS(A)-Mikroinjektion in die eingeschränkte Stelle für die Expression exogener Proteine in proliferativen Linsenfaserzellen ermöglicht5, 6,7,8.
Das hier ausführlich beschriebene Verfahren der Mikroinjektion von Kükenembryonen basiert ursprünglich teilweise auf den Arbeiten von Fekete et. al.6 und weiterentwickelt von Jiang et. al.8 und wurde als Mittel verwendet, um sowohl virale als auch nichtvirale Plasmide in die Linse embryonaler Küken einzuführen 1,9,10,11,12,13. Insgesamt zeigt die bisherige Arbeit das Potenzial der Verwendung dieser Methodik zur Untersuchung der Linsenentwicklung, -differenzierung, zellulären Kommunikation und des Fortschreitens von Krankheiten sowie zur Entdeckung und Erprobung therapeutischer Ziele für Linsenerkrankungen wie Katarakte.

<table><tbody><tr><td>0,22 &Mikro; m Filter</td><td>Corning</td><td>431118</td><td>Zur Entfernung von Zelltrümmern von Medien</td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm Kulturschale</td><td>FisherScientific</td><td>50-202-030</td><td>Zur Verwendung während der Mikroinjektion</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Fisherbrand</td><td>13-100-676</td><td>Schleuderlösung</td></tr><tr><td>Constructs</td><td>GENEWIZ-Zur</td><td></td> <td>Erzeugung von Konstrukten</td></tr><tr><td>Präpariermikroskop</td><td>AmScope</td><td>SM-4TZ-144A</td><td>Visualisierung einer Linse für</td>Mikroinjektions-DNA-PCR-Primer</tr><tr><td>Integrierte</td> <td>DNA-Technologien-Generierung</td><td></td> <td>von Primern: Intrazelluläre Schleife (IL)-deletiertes Cx50 (Reste 1&ndash; 97 und 149&ndash; 400) sowie der Cla12NCO-Vektor wurden mit dem folgenden Primerpaar erhalten: sense, CTCCTGAGAACCTACATCCT; antisense, CACCGCATGCCCAAAGTACAC ILs von Cx43 (Reste 98&ndash; 150) und Cx46 (Rückstände 98&ndash; 166) waren&nbsp; erhalten mit den folgenden Primerpaaren: sense, TACGTGATGAGGAAAGAAG; Antisense, TCCTCCACGCATCTTTACCTTG; Sinn, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCC AT ACGGATTC, bzw. Cla12NCO-Cx43 Konstruktvorlage wurde mit dem folgenden Primerpaar erhalten: sense, CTGCTTCGTACTTACATCATC; antisense, GAACAC GTGCGCCAGGTAC ILs von Cx50 (Rückstände 98&ndash; 148) oder Cx46 (Rückstände 98&ndash; I S. 166) wurden unter Verwendung der Konstrukte Cla12NCO-Cx50 und Cla12NCO-Cx46 als Vorlagen mit dem folgenden Primerpaar geklont: sense, CACCATGTCCGCATGGAGGAGA; antisense, GGTCCCC TC CAGGCGAAAC; Sinn, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCCATACGGATTC, bzw</td></tr>. <tr><td>Drummond Nanoject II Automatischer Nanoliter-Injektor</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-204</td><td>Mikroinjektionspipette</td></tr><tr><td>Dual Schwanenhalsleuchten Mikroskop Illuminator</td><td>AmScope</td><td>LED-50WY</td><td>Beleuchtung für die Visualisierung</td></tr><tr><td>Dulbecco' s modifiziertes Eagle Medium (DMEM)</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>für Zellkultur-Eierhalter</td></tr> <tr><td></td><td></td><td>-</td> <td>Hausgemachte Styroporringe mit 2 Zoll Durchmesser und einem halben Zoll Höhe</td></tr><tr><td>Eierinkubator</td><td>GQF Manufacturing Company Inc.</td><td>1502</td><td>Für die Inkubation von befruchteten Eiern</td></tr><tr><td>Fast</td><td>Green Fisher scientific</td><td>F99-10</td><td>Für die Visualisierung der Virusstamminjektion</td></tr><tr><td>Befruchtete weiße Leghorn-Hühnereier</td><td>Texas A& M University</td><td>N/A</td><td>Tiermodell der Wahl für Mikroinjektionen (https://posc.tamu.edu/fertile-egg-orders/)</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Hyclone Laboratories</td><td></td><td>Für Zellkulturen</td></tr><tr><td>Fluorescein-konjugiertes Anti-Maus-IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-095-003</td><td>Für Anti-FLAG&nbsp; 1:500</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>FisherScientific</td><td>22-327379</td><td>Zum Bewegen von Dingen und Isolierung</td></tr><tr><td>Glaskapillaren</td><td>Sutter Instruments</td><td>B100-75-10</td><td>Mikropipette aus Glas für die Mikroinjektion (AD 1,0 mm, ID 0,75 mm, 10 cm Länge)</td></tr><tr><td>Lipofectamine</td><td>Invitrogen</td><td>L3000001</td><td>Für die Transfektion</td></tr><tr><td>Manueller vertikaler Mikropipettenabzieher</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-30</td><td>Um eine Mikropipette aus Glas in der richtigen Größe</td></tr><tr><td>zu erhalten Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>FisherScientific</td><td>02-682-004</td> Mikroskop <td>mit auflösender Lösung</td></tr><tr><td></td><td>Keyence</td><td>BZ-X710</td><td>Für bildgebende Färbungen</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>FisherScientific</td><td>03-448-254</td><td>Einlagerungslösung</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Für Zellkulturen</td></tr><tr><td>Pico-Injektor</td><td>Harvard Gerät</td><td>PLI-100</td><td>Zum präzisen Fördern kleiner Flüssigkeitsmengen durch Mikropipetten durch Anlegen eines geregelten Drucks für einen digital eingestellten Zeitraum</td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-Küken AQP0</td><td>Selbst erzeugt</td> <td>-</td> <td>Jiang JX, White TW, Goodenough DA, Paul DL. Molekulare Klonierung und funktionelle Charakterisierung der Kükenlinsenfaser Connexin 45.6. Mol Biol Zelle. 1994 Mär; 5(3):363-73. DOI: 10.1091/MBC.5.3.363.</td></tr><tr><td>Kaninchen-Anti-FLAG-Antikörper</td><td>Rockland Immunichemicals</td><td>600-401-383</td><td>Zum Färben von FLAG</td></tr><tr><td>Rhodamin-konjugiertem Anti-Kaninchen-IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-295-003</td><td>Für Anti-AQP0&nbsp; 1:500</td></tr><tr><td>Schwamm-Klemmpad</td><td>Sutter Instruments</td><td>BX10</td><td>Für die Aufbewahrung von Mikropipetten aus Glas</td></tr></tbody></table>

mikroinjektion von rekombinantem rcas(a)-retrovirus in embryonale hühnerlinse

Microinjection of Recombinant RCAS(A) Retrovirus into Embryonic Chicken Lens

Das embryonale Huhn (Gallus domesticus) ist aufgrund seiner hohen Ähnlichkeit mit der menschlichen Linse ein etabliertes Tiermodell für die Untersuchung der Linsenentwicklung und -physiologie. RCAS(A) ist ein replikationskompetentes Hühner-Retrovirus, das sich teilende Zellen infiziert und als leistungsfähiges Werkzeug dient, um die In-situ-Expression und -Funktion von Wildtyp- und Mutantenproteinen während der Linsenentwicklung durch Mikroinjektion in das leere Lumen des Linsenvesikels in frühen Entwicklungsstadien zu untersuchen und seine Wirkung auf die umgebenden proliferierenden Linsenzellen zu beschränken. Im Vergleich zu anderen Ansätzen, wie z.B. transgenen Modellen und ex vivo Kulturen, bietet die Verwendung eines RCAS(A)-replikationskompetenten aviären Retrovirus ein hocheffektives, schnelles und anpassbares System zur Expression exogener Proteine in Kükenembryonen. Insbesondere kann der gezielte Gentransfer auf proliferative Linsenfaserzellen beschränkt werden, ohne dass gewebespezifische Promotoren erforderlich sind. In diesem Artikel geben wir einen kurzen Überblick über die Schritte, die für die Herstellung des rekombinanten Retrovirus RCAS(A) erforderlich sind, geben einen detaillierten, umfassenden Überblick über das Mikroinjektionsverfahren und stellen Beispielergebnisse der Technik zur Verfügung.

Nach der Bestimmung eines oder mehrerer spezifischer Zielproteine und der Identifizierung der zugehörigen Gensequenz(en) umfasst der experimentelle Gesamtansatz die Klonierung der Gensequenz(en) in einen retroviralen RCAS(A)-Vektor durch die anfängliche Klonierung in einen Adaptervektor, gefolgt von einem viralen Vektor. Zweitens werden hochtitrige Viruspartikel mit Hilfe von Verpackungszellen hergestellt, um die Virionen zu ernten und zu konzentrieren. Diese ersten beiden Hauptschritte wurden an anderer Stelle ausführli...

Dieses Protokollpapier beschreibt die Methodik der Mikroinjektion eines RCAS(A)-Retrovirus in embryonale Hühnerlinsen als Werkzeug zur Untersuchung der In-situ-Funktion und Expression von Proteinen während der Linsenentwicklung.

Mikroinjektion von rekombinantem RCAS(A)-Retrovirus in embryonale Hühnerlinse

Embryonic chicken (Gallus domesticus) is a well-established animal model for the study of lens development and physiology, given its high degree of ...

Die vorgestellte Methodik der Mikroinjektion eines RCAS-Retrovirus in embryonale Hühnerlinsen ist als Werkzeug zur Untersuchung der in situ Funktion und Expression von Proteinen während der Linsenentwicklung gedacht. Im Vergleich zu anderen Ansätzen, wie z.B. transgenen Modellen und ex vivo Kulturen, bietet das RCAS-replikationskompetente aviäre Retrovirus ein hocheffektives, schnelles und anpassbares System zur Expression exogener Proteine in Kükenembryonen. Der gezielte Gentransfer kann auf proliferative Linsenfaserzellen beschränkt werden, ohne dass Promotoren erforderlich sind.Es besteht ein erhebliches Potenzial für den Einsatz dieser Methodik, um die Entwicklung, Differenzierung, zelluläre Kommunikation und das Fortschreiten von Krankheiten zu untersuchen und therapeutische Ziele für pathologische Erkrankungen wie Katarakte zu entdecken und zu testen.

microinjection-recombinant-rcas-retrovirus-into-embryonic-chicken

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Mit feiner Spitze Mikropipetten spritzen wir Plasmid-DNA in Subdomains Huhn Somiten oder neuronale Röhren. Die Konzentration der Plasmid wird angepasst, um einzelne transfizierten Zellen zu generieren. Dann erlauben wir die Zellen in klonalen Populationen zu entwickeln.

Single Cell Transfektion in Hühnerembryonen

Das übergeordnete Ziel dieses Videos ist zu zeigen, wie die gezielte Injektion Netzhaut führen...

In ovo Elektroporation in embryonalen Hühnchenretina

Diese Operationstechnik veranschaulicht die Injektion von Gentherapie-Vektoren und Stammzellen in den subretinalen Raum des Auges Maus.

Subretinalen Injektion von Vektoren für die Gentherapie und Stammzellen in die Maus Eye

Embryonale Küken Netzhautzellkulturen stellen wertvolle Werkzeuge für das Studium der Photorezeptorbiologie. Wir haben ein effizientes Gentransfertechnik, die auf ex ovo Elektroporation von Plasmid der Netzhaut vor der Kultur entwickelt. Diese Technik wesentlich erhöht Transfektionseffizienzen über derzeit verfügbaren Protokolle, was die genetische Manipulation möglich für dieses System.

Effizienten Gentransfer in Küken Netzhäute für primäre Zellkulturstudien: Eine Ex-ovo Elektroporation Ansatz

Die subretinale Injektion ist eine chirurgische Technik zur effektiven Genabgabe an das retinale Pigmentepithel im Mausauge.  Hier beschreiben wir eine einfache und replizierbare Methode zur subretinalen Injektion von viralen Vektoren in retinales Pigmentepithel bei Versuchsmäusen.

Limbus-Ansatz-Subretinale Injektion von viralen Vektoren für die Gentherapie bei Mäusen Retinapigmentepithel

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren, um zu sezieren, experimentell zu manipulieren und Kultur ganze Retina-Explantaten aus Hühnerembryonen. Das Explantat-Kulturen sind nützlich, wenn hohe Erfolgsrate, Wirksamkeit und Reproduzierbarkeit sind notwendig, um die Auswirkungen von Plasmiden für die Elektroporation und / oder Reagenz Substanzen, dh, enzymatischer Inhibitoren zu testen.

Whole Retinal Explantaten aus Hühnerembryonen für die Elektroporation und Reagens-Behandlungen

Wir präsentieren ein Protokoll, um eine neuartige somatische Gentherapie-Transfer-System unter Verwendung RIP-Tag zu demonstrieren; RIP-tva Maus-Modell für die Funktion von Genen in Metastasen zu untersuchen. Die Vogelgrippe Retroviren liefern wir Intracardiacally um Gentransfer in Pre-maligne, nicht-invasive Läsionen des Pankreas β-Zellen bei Erwachsenen Mäusen zu gewährleisten.

Identifizierung und Charakterisierung von metastasierendem Faktoren durch Gentransfer in die neuartige RIP-Tag; RIP-tva Mausmodell

Bei dieser Methode sind embryonale Herz Gewebe chirurgisch Microdissected, dissoziiert, Eindringmittel beschriftet und in Host embryonalen Gewebe implantiert. Dies bietet eine Plattform für das Studium der Einzelperson oder Gewebe Ebene Entwicklungen Organisation unter ektopische hämodynamischen Bedingungen und/oder veränderten parakrine/Juxtacrine Umgebungen.

Mikroinjektion basierenden System für In Vivo Implantation von embryonalen Kardiomyozyten des aviären Embryos

Wir beschreiben eine Methode zur Gewinnung von Primärkulturen von Zapfenphotorezeptoren aus der Netzhaut von Hühnerembryonen und deren Verwendung für ein High-Content-Screening.

Mit Zapfen angereicherte Kulturen von der Netzhaut von Hühnerembryonen zur Untersuchung zellulärer Interaktionen von Stäbchen zu Zapfen

Wir haben einen neuartigen Loss-of-Function-Ansatz entwickelt, der die Einführung und genomische Integration künstlicher Mikro-RNA-Sequenzen in Kükenembryonen unter Verwendung der In-ovo-Elektroporation und des Tol2-Transposon-Systems beinhaltet. Diese Technik bietet eine robuste und stabile Gen-Knockdown-Methode für Studien der Genfunktion während der Entwicklung.

Loss-of-Function-Ansatz in der embryonalen Küken-Netzhaut unter Verwendung von Tol2-Transposon-vermittelter transgener Expression künstlicher microRNAs

Das übergeordnete Ziel dieses Papiers ist es, zu beschreiben, wie bei der intrazellulären Injektion von exogenen Materialien in Hühnerembryonen durchgeführt werden kann. Dieser Ansatz ist sehr nützlich, um die Entwicklungsbiologie von Hühnerembryonen zu untersuchen.

In Ovo Intravaskuläre Injektion in Hühnerembryonen

Lernen Sie die Mikroinjektion von RCAS(A)-Retrovirus in embryonale Hühnerlinsen zur Untersuchung der Proteinfunktion während der Linsenentwicklung. Diese Methode ermöglicht gezielte Gentransfer-Studien in vivo.

Mikroinjektion von rekombinantem RCAS(A)-Retrovirus in embryonale Hühnerlinse

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