Name: Erforschung der Lebensgeschichte: Verwendung von Temperatur und Substrattyp als interagierende Faktoren für Schmeißfliegenlarven und weibliche Präferenzen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-17T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 14 s
Description: Erfahren Sie, wie man Nahrungs- und Eiablagepräferenzen von Schmeißfliegen untersucht. Diese Methode evaluiert Substrattyp und Temperatur als interagierende Faktoren für Larven und Weibchen.

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Wir danken Patrícia J. Thyssen, Gabriela S. Zampim und Lucas de Almeida Carvalho für die Bereitstellung der L. cuprina-Kolonie und für ihre Unterstützung bei der Einrichtung des Experiments. Wir möchten uns auch bei Rafael Barros de Oliveira für das Filmen und Schneiden des Videos bedanken. Diese Forschung wurde durch den Developing Nation Research Grant der Animal Behavior Society an V.A.S.C. und durch einen FAPESP Dimensions US-Biota-São Paulo Grant an T.T.T. (20/05636-4) unterstützt. S.T. und D.L.F. wurden durch ein FAPESP unterstützt (19/07285-7 Postdoktorandenstipendium bzw. 21/10022-8 PhD-Stipendium). V.A.S.C. und A.V.R. wurden durch CNPq-Promotionsstipendien unterstützt (141391/2019-7, 140056/2019-0). T.T.T. wurde von CNPq (310906/2022-9) unterstützt.

Die Fliegenproben wurden mit Hilfe von Fallen und nicht von befallenen Tieren gewonnen. Es wurde eine SISBIO-Lizenz (67867-1) erteilt, um Fliegen der Familie Calliphoridae in Gefangenschaft unter Laborbedingungen zu sammeln und zu halten. Insektenproben sind in der brasilianischen Forschung von der ethischen Bewertung ausgenommen. Rinderfleisch und -blut wurden kommerziell gewonnen, und es war keine ethische Unbedenklichkeit erforderlich.
1. Fütterungspräferenz der Larven
<ol><li>Zubereitung der Petrischalen mit 2%igem Agar<ol><li>Bereiten Sie vier Petrischalen mit 2%igem Agar zu. Geben Sie dazu 6 g bakteriologischen Agar in 300 ml Wasser und schmelzen Sie diese Mischung in der Mikrowelle. Dann teilen Sie das Volumen gleichmäßig auf vier Petrischalen aus Glas (150 x 20 mm) auf und verwenden Sie etwa 70 ml in jeder Schale. HINWEIS: Bereiten Sie Petrischalen entsprechend der Anzahl der gewünschten experimentellen Wiederholungen vor. In dieser Studie wurden 36 Replikate verwendet.</li>
		<li>Sobald der Agar erstarrt ist, stanzen Sie mit einem konischen 50-ml-Röhrchen (3 cm Durchmesser) vier Löcher in den Agar, zwei auf jeder Seite der Petrischale, und folgen Sie dabei dem mitgelieferten Schnittmuster (Abbildung 1). HINWEIS: Dieser Aufbau ähnelt den zuvor beschriebenen Protokollen von Fouche et al. (2021)40 und Boulay et al. (2016)42.</li>
	</ol></li>
	<li>Vorbereitung von Substraten<ol><li>Um das frische Fleisch mit Blut zuzubereiten, geben Sie 12 ml verdünntes Rinderblut zu 200 g frischem Rinderhackfleisch. Gründlich mischen. Achten Sie darauf, für jede Fleischsorte unterschiedliche Messzylinder und Löffel zu verwenden, um eine Kreuzkontamination zwischen den Substraten zu vermeiden. HINWEIS: Das verdünnte Blut besteht zu 50 % aus reinem Blut, das mit einem Gerinnungshemmer (3,8 % Natriumcitrat) und 50 % gefiltertem Wasser vermischt ist.</li>
		<li>Um das faule Substrat vorzubereiten, geben Sie 12 ml gefiltertes Wasser in 200 g 5 Tage altes verdorbenes Rinderhackfleisch und mischen Sie es gut. ANMERKUNG: Faules Fleisch wurde gewonnen, indem frisches Hackfleisch fünf Tage lang bei 25 °C in nicht hermetischen Kunststofftöpfen inkubiert wurde (Mischung aus aerober und nicht-aerober Zersetzung). Jeder Topf enthielt 200 g frisches Hackfleisch. Es wurde dann bis zur Verwendung eingefroren.</li>
		<li>Füllen Sie in jeder Petrischale zwei Löcher mit der frischen Fleisch-Blut-Mischung und die restlichen zwei Löcher mit der verdorbenen Fleisch-Wasser-Mischung. HINWEIS: Um Positionsverzerrungen zu vermeiden, variieren Sie die Platzierung der verschiedenen Fleischsorten in den Petrischalen. Zum Beispiel sollten einige Petrischalen die gleiche Fleischsorte haben, während in anderen Gerichten die Fleischsorte gekreuzt werden sollte, wie in Abbildung 2 gezeigt.</li>
	</ol></li>
	<li>Versuchsaufbau<ol><li>Positionieren Sie das Heizkissen bei einer Raumtemperatur (RT) von 25 °C direkt unter einer Lichtquelle, um den Versuchsbereich gleichmäßig auszuleuchten und eine Verhaltensverzerrung gegenüber oder gegen das Licht zu vermeiden. Legen Sie Papppads um das Heizkissen, um sicherzustellen, dass der Versuchsaufbau waagerecht bleibt. HINWEIS: Bei der verwendeten Lichtquelle handelte es sich um weißes, wärmearmes Licht, z. B. eine Neonröhre. Das Heizkissen wurde auf einem Tisch direkt unter den Deckenlampen positioniert (Abbildung 3).</li>
		<li>Decken Sie das Heizkissen und die Nivellierpapppads mit schwarzer Pappe ab und schalten Sie das Heizkissen ein. HINWEIS: Die schwarze Pappabdeckung sollte verwendet werden, um visuelle Hinweise zu vermeiden, die den Verhaltenstest verzerren könnten.</li>
		<li>Legen Sie sechs Petrischalen mit Agar- und Fleischsubstrat auf den schwarzen Karton mit zwei Substraten, eines von jedem Typ, auf das Heizkissen und die anderen beiden von der Oberfläche des Heizkissens (Abbildung 2). Die Substrate ca. 10 Min. erhitzen lassen. HINWEIS: Auf dem Deckel der Petrischalen kann sich Kondenswasser bilden.</li>
	</ol></li>
	<li>Larventest<ol><li>Prüfen Sie die Temperatur der Substrate (kalte Seite: 25 ± 2 °C; heiße Seite: 33 ± 2 °C) mit einem Infrarot-Thermometer. HINWEIS: Das Heizkissen bleibt während der gesamten Dauer des Experiments eingeschaltet. Zu Beginn und am Ende des Experiments wurden Temperaturmessungen durchgeführt. Obwohl die Temperatur um ± 2 °C schwankte, gab es immer noch einen Temperaturunterschied von mindestens 8 °C zwischen den heißen und kalten Bedingungen.</li>
		<li>Nachdem Sie die gewünschte Temperatur erreicht haben, legen Sie fünf Larven mit einer Pinzette in die Mitte jeder Petrischale (Abbildung 2) und decken Sie die Petrischalen mit den Deckeln ab. Lassen Sie das Auswahlexperiment 10 Minuten lang laufen. HINWEIS: Einige Larven können an den Rändern und auf dem Deckel der Petrischalen herumkrabbeln. Wenn eine Larve entweicht, lege sie mit einer Pinzette zurück in die Mitte der Petrischale.</li>
		<li>Nach 10 Minuten alle Petrischalen vom Heizkissen nehmen und auf eine andere Oberfläche stellen, um ein weiteres Erhitzen der Substrate zu vermeiden. Zählen Sie dann die Anzahl der Larven in jedem Substrat sowie diejenigen, die kein Substrat gewählt haben. HINWEIS: Lucilia cuprina-Larven bleiben in ihrem gewählten Substrat, wie in diesem Experiment beobachtet.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Präferenz für die Eiablage des Weibchens
<ol><li>Versuchsaufbau<ol><li>Verwenden Sie ein normales Regal, das zuvor mit schwarzem Karton abgedeckt und mit weißen LED-Lichtleisten gleichmäßig ausgeleuchtet wurde. HINWEIS: Die schwarzen Pappabdeckungen sollten verwendet werden, um visuelle Hinweise zu vermeiden, die den Verhaltenstest verzerren könnten. Die weißen LED-Streifen sind der Länge nach in der Mitte des Regals direkt über dem Experiment befestigt. Die Regale, die beim Aufbau verwendet wurden, wurden im Abstand von 45 cm platziert.</li>
		<li>Bei RT (25 °C) ein Heizkissen in die Mitte des Regals legen. Verwenden Sie Papppads um das Heizkissen als Stütze, um sicherzustellen, dass der Versuchsaufbau nivelliert ist.</li>
		<li>Decken Sie das Heizkissen und die Nivellierpapppads mit einem schwarzen Karton ab, um das gleiche visuelle Muster unter allen Substraten zu erhalten.</li>
		<li>Stellen Sie zwei kreuzförmige Glasbehälter auf ein Regal, jeder sollte zwei Arme über der schwarzen Pappe und dem Heizkissen haben. Schalten Sie die weißen LED-Lichtleisten und die Heizkissen vor Beginn des Experiments ein.</li>
		<li>Verwenden Sie 70% Ethanol, um die Kreuze (im Kreuz und im Deckel) zu reinigen, um eine Geruchskontamination zu vermeiden.</li>
	</ol></li>
	<li>Vorbereitung von Substraten<ol><li>Bereiten Sie vier Petrischalen (60 mm x 15 mm) pro Kreuz mit 5 g 5 Tage altem, verdorbenem oder frischem Fleisch (zwei von jeder Art von Substrat) zu. HINWEIS: Bereiten Sie Petrischalen entsprechend der Anzahl der gewünschten experimentellen Wiederholungen mal vier vor. In dieser Studie wurden 30 Replikate verwendet, insgesamt 120 präparierte Petrischalen.</li>
		<li>1 ml verdünntes Rinderblut (50 % reines Blut mit Antikoagulans und 50 % gefiltertes Wasser) auf das frische Fleisch und 1 ml gefiltertes Wasser auf das verdorbene Fleisch geben. Mischen Sie das Fleisch (frisch oder verdorben) gründlich mit der Flüssigkeit (Blut oder Wasser) und verwenden Sie für jede Fleischsorte einen anderen Löffel. HINWEIS: Die Vorbereitung des Fleisches für den weiblichen Test ist dem Larventest sehr ähnlich, obwohl die Mengen unterschiedlich sind, da der weibliche Test länger läuft als der Larventest. Denken Sie daran, für jede Fleischsorte unterschiedliche Pipettenspitzen und Löffel zu verwenden, um eine Kreuzkontamination zwischen den Substraten zu vermeiden.</li>
		<li>Prüfen Sie, ob der Alkohol vollständig aus den Kreuzen verdunstet ist. Platzieren Sie dann vier Petrischalen (eine von jeder Fleischsorte auf dem Heizkissen und die anderen beiden von der Oberfläche des Heizkissens) am Ende jedes Arms des Kreuzes (Abbildung 4). Die Kreuze mit dem Deckel verschließen und die Substrate ca. 10 min erhitzen lassen. HINWEIS: Um Positionsverzerrungen zu vermeiden, variieren Sie außerdem die Platzierung der verschiedenen Fleischsorten in den Kreuzen. Zum Beispiel sollten einige Kreuzungen die gleiche Fleischsorte auf benachbarten Armen haben, während bei anderen Kreuzungen die gleiche Fleischsorte einander gegenüberliegen sollte, wie in Abbildung 4 dargestellt.</li>
	</ol></li>
	<li>Weiblicher Test<ol><li>Sammeln Sie trächtige Weibchen im Fliegenkäfig und isolieren Sie sie in einzelne Röhrchen. ANMERKUNG: Trächtige Weibchen zeichnen sich durch einen vergrößerten und weißlich-gelben Hinterleib im Gegensatz zu nicht-trächtigen Weibchen aus (Abbildung 5). Trächtige Weibchen wurden zwischen 10 und 16 Tagen nach dem Schlüpfen für die Experimente gesammelt.</li>
		<li>Kontrollieren Sie die Temperatur der Substrate in den Kreuzen (kalte Seite: 25 ± 2 °C; heiße Seite: 33 ± 2 °C) mit einem Infrarot-Thermometer. HINWEIS: Genau wie beim Larventest bleibt das Heizkissen während der gesamten Dauer des Experiments eingeschaltet. Zu Beginn und am Ende des Experiments wurden Temperaturmessungen durchgeführt. Obwohl die Temperatur um ± 2 °C schwankte, gab es immer noch einen Temperaturunterschied von mindestens 8 °C zwischen den heißen und kalten Bedingungen.</li>
		<li>Lege das Röhrchen mit einem trächtigen Weibchen verkehrt herum in die Öffnung in der Mitte jedes Kreuzes. Nachdem das Weibchen in das Kreuz eingedrungen ist, entfernen Sie das Röhrchen und verschließen Sie die Öffnung mit dem kleinen Deckel. Nachdem Sie alle Kreuze geschlossen haben, legen Sie eine schwarze Pappe in die Vorderseite des Regals, um den Versuchsaufbau zu umschließen. Lassen Sie das Experiment 4 Stunden lang laufen.</li>
		<li>Danach entfernst du das Weibchen, indem du es vorsichtig mit einem Röhrchen auffängst und prüfst, ob sich Eier auf den Substraten befinden.</li>
		<li>Identifizieren Sie den Deckel jeder Petrischale mit dem Substrattyp aus jedem Kreuz. Verwenden Sie 70%iges Ethanol, um die Kreuze (im Inneren des Kreuzes und des Deckels) von jeglichem Geruch aus dem Test zu reinigen. HINWEIS: Falls die Eier nicht direkt nach dem Versuch gezählt werden können, können die Petrischalen mit Substraten bei -20 °C gelagert werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Anzahl der Eier HINWEIS: Wenn die Substrate in den Petrischalen gefroren waren, tauen Sie sie vor dem Zählen auf.<ol><li>Verwenden Sie ein Stereomikroskop, um die Anzahl der Eier zu zählen, die in jedes Substrat gelegt wurden. Verwende eine Bürste und Wasser, um die Eier zu trennen und zu zählen.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Datenanalyse und Statistik
<ol><li>Berechnung von Präferenzindizes<ol><li>Berechnen Sie für jede Wiederholung von Larven- (n = 36) und Weibchentests (n = 30) den Präferenzindex für Fleisch (alsPI-Fleisch bezeichnet), indem Sie das Verhältnis der Larven oder Eier auf frischen Substraten (frisch heiß und frisch kalt) zur Gesamtzahl der Larven oder Eier auf allen Substraten (frisch heiß + frisch kalt + faul heiß + verdorben kalt) bestimmen. PI-Fleisch = (# Larven oder Eier auf frischen Substraten) / # Gesamtzahl der Larven oder Eier HINWEIS: Die Begriffe "heiß" und "kalt" beziehen sich auf Temperaturbedingungen von 33 ± 2 °C bzw. 25 ± 2 °C.</li>
		<li>Berechnen Sie auch den Präferenzindex für die Temperatur (PITemp) für jede Wiederholung von Larven- und Weibchentests als die Anzahl der Larven oder Eier, die auf heißen Substraten (frisch heiß und faul heiß) vorhanden sind, geteilt durch die Gesamtzahl der Larven oder Eier auf allen Substraten (frisch heiß + frisch kalt + faul heiß + verdorben kalt). PItemp = (# Larven oder Eier auf heißen Substraten) / # Gesamtzahl der Larven oder Eier HINWEIS: Werte nahe 1 spiegeln eine Präferenz für frische oder heiße Substrate wider, und Werte nahe Null zeigen eine Präferenz für faule oder kalte Substrate an. Die PIs können manuell oder mit dem bereitgestellten Code (Supplemental Files S1 und Supplemental Files S2) berechnet werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Vergleich der beobachteten Präferenz mit simulierten Zufallsdaten<ol><li>Führen Sie den bereitgestellten Code (Ergänzungsdatei S1 und Ergänzungsdatei S1) aus, um die simulierten Daten zu generieren und mit den beobachteten Daten zu vergleichen. HINWEIS: Dieser Code generiert 1000 simulierte zufällige Datensätze für Larven und Weibchen und berechnet die Präferenzindizes (PIs) für jede Replikation der simulierten und beobachteten Daten von L. cuprina. Die Simulationen gehen davon aus, dass sowohl Larven als auch Weibchen keine Substratpräferenz aufweisen und zufällige Entscheidungen treffen. Die Simulationen berücksichtigen wichtige Verhaltensaspekte der Tiere und umfassen verschiedene Szenarien, wie z. B. die Wahrscheinlichkeit, dass die Larven kein Substrat auswählen und dass erwachsene Weibchen ihre Eiablage auf ein einziges Substrat konzentrieren oder ihre Eier entweder gleichmäßig oder nicht gleichmäßig auf verschiedene Substrate verteilen. Verallgemeinerte lineare Modelle (GLM, Familie: Quasibinomial; Link: Logit) wurden verwendet, um die beobachteten Daten aus den Verhaltensassays mit den simulierten Zufallsdaten zu vergleichen. Der verwendete GLM war für diese Analyse aufgrund der begrenzten Natur des Präferenzindex (PI), der zwischen 0 und 1 liegt, gut geeignet. GLMs sind versiert im Umgang mit nicht-normalverteilten Antwortvariablen und ermöglichen robuste statistische Vergleiche. Diese Wahl ermöglichte aussagekräftige Erkenntnisse, indem sie es ermöglichte, beobachtete Daten aus Verhaltenstests effektiv mit komplexen Mustern zu vergleichen, die durch simulierte Zufallsdaten generiert wurden. Für andere strukturierte Datensätze können geringfügige Anpassungen am Code erforderlich sein.</li>
	</ol></li>
</ol>

Keine deklariert.

Um die Evolution der Nahrungsgewohnheiten, insbesondere im Zusammenhang mit dem Parasitismus bei Schmeißfliegen, zu verstehen, ist es erforderlich, die Substratpräferenzen in verschiedenen Lebensstadien für die Nahrungsaufnahme oder Eiablage zu untersuchen. Daher wurden in dieser Studie robuste und einfache Methoden zur Untersuchung von Substratpräferenzen bei Larven und Weibchen von Schmeißfliegen vorgeschlagen. Diese Methoden wurden an Lucilia cuprina, einer fakultativen parasitären Schmeißfliege, getestet<sup...

Fliegen, insbesondere Calyptrat-Muskoide (u.a. Schmeißfliegen, Stubenfliegen, Bot-Fliegen und Fleischfliegen), zeigen ein breites Spektrum an Lebensweisen, das parasitäre und nekro-saprophage Verhaltensweisen umfasst1. Parasitäre Arten verursachen typischerweise Myiasis, einen Befall von lebendem Gewebe durch Maden (Larven)2. In der Familie der Calliphoridae sind sowohl obligate als auch fakultative parasitäre Arten die Hauptursachen für wirtschaftliche Verluste und schlechtes Tierwohl aufgrund von Madenbefall 2,3,4,5,6,7. Besonders problematisch sind obligate Parasiten wie der Neuwelt- und der Altwelt-Schraubenwurm (Cochliomyia hominivorax bzw. Chrysomyia bezziana) 4,7,8,9,10 sowie fakultative Parasiten wie die Schafschmeißfliegen (Lucilia cuprina und Lucilia sericata)2,5,6, 7. Anmelden Nicht-parasitäre Arten, einschließlich sapro-nekrophager Arten, entwickeln sich in verrottender und nekrotischer organischer Substanz und sind häufig in unhygienischen Umgebungen zu finden. Ihre strikt nicht-parasitäre Lebensweise kann erfolgreich für die Madentherapie eingesetzt werden, bei der Fliegenlarven verwendet werden, um Wunden von nekrotischem Gewebe zu reinigen11,12,13. Schmeißfliegen werden auch in der Forensik eingesetzt, da sie zu den ersten Organismen gehören, die kürzlich verstorbene Leichen lokalisieren und besiedeln, wobei die sich entwickelnden Larven dazu dienen, den Todeszeitpunkt abzuschätzen14.
Die Lebensweise von Schmeißfliegen war aufgrund ihrer Bedeutung in Bezug auf menschliche Interessen Gegenstand verschiedener Forschungsstudien (z. B. 15,16,17,18,19,20,21). Das Verständnis der biologischen Mechanismen, die die Lebensweise einer Art steuern, kann wertvolle Erkenntnisse zur Verbesserung von Methoden zur Bekämpfung von Schädlingsarten liefern. Darüber hinaus bietet die Vielfalt und Evolution der Lebensweise von Schmeißfliegen einen idealen Kontext, um die Ursprünge und Mechanismen komplexer Merkmale (z.B. Parasitismus) zu untersuchen. Parasitismus durch Maden, die sich von lebendem Gewebe ernähren, hat sich innerhalb der Familie der Calliphoridae mehrmals unabhängig voneinander entwickelt22,23. Die Evolutionsgeschichte der Fressgewohnheiten von Schmeißfliegen ist jedoch noch weitgehend unbekannt, da sich die Studien darauf beschränken, die Gewohnheiten entlang der Phylogenien (z. B. 16,19,22) ohne die Hilfe von funktionellen Assays zu kartieren. Zum Beispiel ist es ungewiss, ob sich obligate Parasiten aus Generalisten (d.h. fakultativen Parasiten) oder direkt aus nekrophagen Arten entwickelt haben. Die molekularen, physiologischen und verhaltensbezogenen Prozesse, die mit den evolutionären Veränderungen des Lebensstils einhergehen, sind ebenfalls weitgehend unbekannt.
In diesem Zusammenhang bieten fakultative Parasiten, wie z.B. die Schafschmeißfliege Lucilia cuprina, die sich als Parasiten auf einem Wirt oder als Nekrophagen auf Kadavern entwickeln können, die Möglichkeit, die Faktoren und Mechanismen zu erforschen, die die Wahl des Lebensstils steuern. Lucilia cuprina ist eine kosmopolitische Art, die dafür bekannt ist, Schaffliegenbefall zu verursachen, insbesondere in Australien, wo sie als Schädling gilt 3,16. Myiasis durch L. cuprina kann auch bei anderen Nutztieren, Haustieren und Menschen auftreten 3,24,25,26,27,28,29,30. Ihre Larven können sich jedoch auch in nekrotischen Geweben und verwesender Materie entwickeln, und diese Art wurde erfolgreich in der forensischen Entomologie eingesetzt, da sie sehr schnell Leichen lokalisiert und besiedelt31,32,33,34. Obwohl die parasitäre vs. nicht-parasitäre Lebensweise von Schmeißfliegen durch das Larvenstadium definiert wird, ist es das erwachsene Weibchen, das den Eiablageplatz auswählt. Folglich beeinflusst das erwachsene Weibchen die Lebensweise der Larven stark, da diese in ihrer Beweglichkeit eingeschränkt sind. Die Wahl des Weibchens bedeutet jedoch nicht zwangsläufig, dass die Larven das gleiche Substrat bevorzugen würden, wenn sie die Wahl hätten35. Eine Hypothese ist, dass Verhaltensänderungen, die dazu führten, dass Weibchen ihre Eier auf lebendem Gewebe ablegten, Teil einer frühen Umstellung auf eine parasitäre Lebensweise gewesen sein könnten. Voranpassungen oder physiologische Fähigkeiten der entstehenden Larven wären für ihre erfolgreiche Entwicklung auf dem lebenden Gewebe unerlässlich gewesen, was zur Entstehung der parasitären Lebensweise geführt hätte. Daher müssen die betroffenen und ausgewählten Prozesse nicht unbedingt zwischen beiden Lebensphasen übereinstimmen.
In diesem Zusammenhang wurden zwei Methoden entwickelt, um die Verhaltenspräferenz von Schmeißfliegen, insbesondere für L. cuprina, in Bezug auf das Futtersubstrat der Larven (Larvenpräferenz-Assay) und den Eiablageort (weiblicher Präferenz-Assay) zu testen. Bei diesen Methoden werden zwei Faktoren berücksichtigt, die zusammenwirken: Temperatur und Frische des Fleisches. Die Temperatur wurde als entscheidender Faktor gewählt, da die meisten Fälle von Myiasis bei homöothermen Tieren auftreten2. Daher wurde eine Temperatur von 33 °C als Proxy für den "parasitären Lebensstilfaktor" gewählt, während eine Temperatur von 25 °C (Raumtemperatur) den "nicht-parasitären Faktor" darstellt. Es wurde eine Temperatur von 25 °C gewählt, da sie repräsentativ für die in Brasilien gemessene Jahresdurchschnittstemperatur ist (Nationales Institut für Meteorologie, INMET). Zusätzlich wurden zwei Arten von Fleischsubstraten in Betracht gezogen, die beide aus bovinen Quellen stammen: (i) frisches Fleisch, das mit Blut angereichert ist und das Substrat für die parasitäre Lebensweise nachahmt, das zur Aufzucht der parasitären Schmeißfliege Co. hominivorax unter Laborbedingungen verwendet wird36, und (ii) 5 Tage altes verdorbenes Fleisch, das das Substrat für die nekrophage Lebensweise nachahmt. Das Rindersubstrat wird üblicherweise für die Aufzucht von L. cuprina unter Laborbedingungenverwendet 27,37,38,39, da es mehrere Vorteile in Bezug auf Verfügbarkeit, Kosteneffizienz und Praktikabilität bietet und gleichzeitig ein ökologisch vertretbares Substrat ist. Andere Studien40,41, in denen die Wirkung von faulen und frischen Substraten bei Schmeißfliegen verglichen wurde, verwendeten 7 Tage altes, verrottetes Substrat (unter anaeroben Bedingungen) und zeigten eine nachteilige Wirkung des faulen Substrats auf die Entwicklungsraten, das Überleben und das Wachstum. Da L. cuprina dafür bekannt ist, frische Kadaver zu besiedeln, die normalerweise der Luft ausgesetzt sind, haben wir uns entschieden, 5 Tage altes verdorbenes Fleisch (Rinderhackfleisch) in nicht-hermetischen Töpfen (aerobe und anaerobe Zersetzung) zu verwenden, um ein nekrophages Substrat zu imitieren.
Die hier vorgestellten Versuchsdesigns bieten den Vorteil, dass sie sowohl für einzelne Faktoren als auch für deren kombinierte Effekte differenziert werden können. Darüber hinaus sind die bewerteten Phänotypen, d.h. die Wahl des Larvenfuttersubstrats und die Anzahl der gelegten Eier, direkt relevant für die biologischen und ökologischen Aspekte von Schmeißfliegenarten. Die Eignung dieser Protokolle wird durch den Nachweis ihrer Wirksamkeit bei L. cuprina unterstrichen. Darüber hinaus wird ein Skript für die statistische Analyse bereitgestellt, mit dem die beobachteten Ergebnisse von L. cuprina mit simulierten Zufallsdaten verglichen werden können, um eine robuste statistische Analyse und Interpretation zu gewährleisten.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>05038-500G</td><td>Für Mikrobiologie</td></tr><tr><td>Schwarze Kartons</td><td>-</td><td></td><td>-70x50 cm</td></tr><tr><td>Rinderblut mit Antikoagulat&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td>50% reines Rinderblut mit Antikoagulans (3,8% Natriumcitrat) + 50% gefiltertes Wasser</td></tr><tr><td>Rinderhackfleisch</td><td>-</td><td>-</td><td>Etwa 7-8% Fett</td></tr><tr><td>Bürste</td><td>-</td><td>-</td><td>Hergestellt aus Kunststoff</td></tr><tr><td>Konisches Rohr</td><td>Falke oder Generika</td> <td>-</td><td>50 mL</td></tr><tr><td>Kreuzförmige Glasbehälter</td><td>Handgefertigt</td><td>NA</td><td>48x48 cm, 8 cm Höhe und 8 cm Breite</td></tr><tr><td>Erlenmeyer</td><td>Vidrolabor</td><td>NA</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td>Synth</td><td>A1084.01.BL</td><td>70% Ethylethanol absolut + 30% gefiltertes Wasser</td></tr><tr><td>Messzylinder</td><td>Nalgon oder Generic-500</td><td></td> <td>mL und 50 mL</td></tr><tr><td>Heizkissen</td> Thermolux-30x40 <td></td><td></td><td>cm Abmessungen, 40 W, 127 V</td></tr><tr><td>Infrarot-Thermometer</td><td>HeTaiDa</td><td>HTD8808</td><td>Berührungsloses Körperthermometer (Abtastrate: 0,5 S, Genauigkeit: &plusmn; 0,2 &Grad; C, Maße: 5-15 cm)</td></tr><tr><td>Petrischale (Glas)</td><td>Präzision</td><td>NA</td><td>150x20 mm Abmessungen</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>(Hinweis: Die Petrischalen können aus Plastik sein, wenn sie nur einmal verwendet werden)</td></tr><tr><td>Petrischale PS</td><td>Cralplast</td><td>18130</td><td>60x15 mm Abmessungen</td></tr><tr><td>Pasteurpipette aus Kunststoff</td><td></td> <td>-</td> <td>3 ml (Gesamtvolumen)</td></tr><tr><td>Natriumcitrat</td><td>Synth</td><td>C11033.01.AG</td><td>3,8% Natriumcitrat (38 g verdünnt in 1 l gefiltertem Wasser)</td></tr><tr><td>Löffel</td> <td>-</td><td></td> <td>Mehr als ein Löffel ist erforderlich. Verwenden Sie eines für jede Art von Fleischsubstrat. Vorzugsweise Edelstahl.</td></tr><tr><td>Edelstahlspatel</td><td>Generisches</td><td></td> <td>flaches Ende und Löffelende</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td> Bioptika-WF10X <td></td><td></td><td>/ 22 Linsen</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td></td> <td>-</td> <td>Metall hergestellt und feine Spitze</td></tr><tr><td>Weiße LED-Lichtstreifen</td><td>NA</td><td>NA</td><td>4,8 W, 2x0,05 mm&sup2;, 320 Lumen, Farbtemperatur: 6500 K (weiß)</td></tr></tbody></table>

erforschung der lebensgeschichte: verwendung von temperatur und substrattyp als interagierende faktoren für schmeißfliegenlarven und weibliche präferenzen

Exploring Life History Choices: Using Temperature and Substrate Type as Interacting Factors for Blowfly Larval and Female Preferences

Schmeißfliegen (Diptera: Calliphoridae) weisen eine breite Palette von Larvenlebensweisen auf, die typischerweise als obligater Parasitismus, fakultativer Parasitismus und vollständige Sapro-Nekrophagie klassifiziert werden. Mehrere parasitäre Arten, sowohl obligat als auch fakultativ, gelten als von hygienischer und wirtschaftlicher Bedeutung, da ihre Larven Myiasis (Madenbefall in lebendem Gewebe) verursachen können. Bemerkenswert ist jedoch, dass das erwachsene Weibchen bei der Wahl des Eiablageplatzes eine entscheidende Rolle spielt und damit maßgeblich das Fressverhalten und die Entwicklungsbedingungen der Larven bestimmt. In dieser Studie werden zwei Protokolle vorgeschlagen, um die Fresspräferenz der Larven und die Präferenz der weiblichen Eiablage unter Berücksichtigung zweier interagierender Faktoren zu testen: Fleischsubstrattyp und Temperatur. Die hier vorgestellten Versuchsanordnungen ermöglichten es, Lucilia cuprina-Larven und trächtige Weibchen in einem Vier-Auswahl-Assay mit zwei Temperaturen (33 ± 2 °C und 25 ± 2 °C) und zwei Arten von Fleischsubstraten (frisches Fleisch mit Blut und 5 Tage altes verdorbenes Fleisch) zu testen. Larven oder trächtige Weibchen können wählen, ob sie ihre Eier in einer der folgenden Sorten eingraben bzw. ablegen möchten: verdorbenes Fleisch bei 25 °C (simuliert einen nekrophagen Artenzustand), frisches Fleisch, das mit Blut bei 33 °C angereichert wird (simuliert einen parasitären Artzustand) und zwei Kontrollen, verdorbenes Fleisch bei 33 °C oder frisches Fleisch, das mit Blut bei 25 °C ergänzt wird. Die Präferenz wird bewertet, indem die Anzahl der Larven oder Eier gezählt wird, die in jeder Option für jedes Replikat gelegt wurden. Der Vergleich der beobachteten Ergebnisse mit einer Zufallsverteilung ermöglichte die Schätzung der statistischen Signifikanz der Präferenz. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass L. cuprina-Larven eine starke Präferenz für das verrottete Substrat bei 25 °C haben. Umgekehrt war die Präferenz der Weibchen für die Eiablage für die Fleischsorte unterschiedlicher. Diese Methodik kann angepasst werden, um die Präferenz anderer Insektenarten ähnlicher Größe zu testen. Auch andere Fragestellungen können unter Verwendung alternativer Bedingungen untersucht werden.

Um die Wirksamkeit der vorgestellten Methoden zu demonstrieren, wurden die Experimente an einer Laborpopulation von Lucilia cuprina (Familie: Calliphoridae), einer fakultativen parasitären Schmeißfliege, durchgeführt2. Der gesamte Rohdatensatz für diese Art ist in der Ergänzungsdatei S3 mit den Ergebnissen der Substratpräferenztests für Larven und Weibchen zu finden. Um zu beurteilen, ob die Larven und Weibchen eine Präferenz für ein beliebiges Substrat zeigen, wurden die...

In diesem Artikel werden zwei Protokolle zur Beurteilung der Nahrungsquelle und der Eiablagepräferenzen bei Larven und Weibchen von Schmeißfliegen beschrieben. Diese umfassen vier Auswahlmöglichkeiten mit zwei interagierenden Faktoren: Substrattyp und Temperatur. Die Assays ermöglichen die Bestimmung der Nahrungsquellenpräferenz der Larven und der Eiablagepräferenz für die Weibchen.

Erforschung der Lebensgeschichte: Verwendung von Temperatur und Substrattyp als interagierende Faktoren für Schmeißfliegenlarven und weibliche Präferenzen

Blowflies (Diptera: Calliphoridae) present a wide range of larval lifestyles, typically classified as obligate parasitism, facultative parasitism, and ...

Schmeißfliegen sind eine vielfältige Gruppe von Fliegen, die obligate oder fakultative Parasiten sowie sapro-nekrophage Parasiten sein können. Obligate parasitäre Arten ernähren sich ausschließlich von lebendem Gewebe und verursachen Myiasis bei Wirbeltieren, während sapro-nekrophage Arten sich von verrottendem organischem Material ernähren. Fakultative Parasiten können sich sowohl von lebendem als auch von verwesendem Material ernähren und als Parasiten leben oder nicht.Obwohl das Larvenstadium das problematischste ist, spielt das Weibchen eine entscheidende Rolle, da es den Ort der Eiablage wählt und somit weitgehend kontrolliert, wo sich die Larven ernähren und entwickeln werden. Das übergeordnete Ziel der hier vorgestellten Methoden ist es, sowohl die Nahrungssubstratpräferenz der Larven als auch die Wahl des weiblichen Eiablageplatzes bei Schmeißfliegen zu beurteilen. Bevorzugte Fütterung der Larven.Schritt eins, Zubereitung der Petrischalen mit Agar 2%Petrischalen mit 2%Agar zubereiten. Dazu fügen Sie sechs Gramm bakteriologischen Agar in 300 Milliliter Wasser hinzu und schmelzen diese Mischung in der Mikrowelle. Anschließend teilen Sie das Volumen in vier Petrischalen auf.Bereiten Sie die Anzahl der Petrischalen mit Agar-Agar entsprechend der Anzahl der gewünschten Replikate vor. Nachdem der Agar erstarrt ist, stanzen Sie vier Löcher in den Agar mit dem in unserem Papier enthaltenen Schneidepetter in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen mit einem Durchmesser von drei Zentimetern, zwei Löcher auf jeder Seite der Petrischale. Schritt zwei: Vorbereitung der Substrate.Um das frische Fleisch mit Blut zuzubereiten, verwenden Sie 12 Milliliter verdünntes Rinderblut, das zur Hälfte aus Blut mit gerinnungshemmender Lösung und zur Hälfte aus gefiltertem Wasser besteht. Geben Sie diese Lösung dann zu 200 Gramm frischem Rinderhackfleisch und rühren Sie es gut um. Denken Sie daran, für jede Fleischsorte unterschiedliche Gradmesser und Löffel zu verwenden, um weitere Verunreinigungen zwischen den Substraten zu vermeiden.Um das faule Substrat vorzubereiten, geben Sie 12 Milliliter gefiltertes Wasser in 200 Gramm verdorbenes Fleisch und rühren Sie es genauso um, wie es mit dem frischen Fleisch gemacht wurde. Vor Beginn des Experiments wird das Fleisch fünf Tage lang bei 25 Grad Celsius in einem Inkubator verrotten gelassen. Nachdem Sie das Fleischsubstrat vorbereitet haben, füllen Sie die Löcher im Agar auf jeder Seite mit frischem und faulem Fleisch.Denken Sie daran, die Position des Fleisches in den Petrischalen zufällig zu bestimmen, wie wir es hier zeigen. Schritt drei: Versuchsaufbau. Stellen Sie das Heizkissen in einem Raum bei 25 Grad Celsius direkt unter eine Lichtquelle, um den Präferenz-Assay gleichmäßig in einer breiten Verhaltensverzerrung zum oder gegen das Licht auszuleuchten.Verwenden Sie dann Pappe um das Heizkissen herum als Stütze, um alles auf der gleichen Höhe zu halten. Legen Sie eine schwarze Pappe über das gesamte Set, das Heizkissen und die Stützpappe, um das gleiche Farbmuster über allen Substraten zu erhalten. Stellen Sie sechs Petrischalen mit Agar-Agar und Fleischsubstrat auf den schwarzen Karton mit zwei Substraten, eines von jeder Art auf dem Heizkissen und die anderen beiden außerhalb der Heizkissenoberfläche.Auf diese Weise lassen wir zu, dass jede der Petrischale vier Substrate hat: frisch und kalt, faul und kalt, frisch und heiß und schließlich faul und heiß. Lassen Sie das Substrat ca. 10 Minuten erhitzen. Schritt vier, Larventest.Überprüfen Sie die Temperatur des Substrats mit einem Infrarot-Thermometer. Die kältere Seite sollte bei etwa 25 Grad Celsius und die heißere bei etwa 33 Grad Celsius liegen. Nachdem Sie die gewünschte Temperatur erreicht haben, legen Sie mit einer Pinzette fünf dritte Larven in die Mitte jeder Petrischale.Dann die Petrischale mit dem Deckel abdecken und das Auswahlexperiment genau 10 Minuten laufen lassen. Während des Experiments krabbeln die Larven um die Petrischale herum und wählen eine der vier Optionen. Wenn Larven entweichen, nehmen Sie sie mit einer Pinzette und legen Sie sie zurück in die Mitte der Petrischale.Nach 10 Minuten alle Experimentier-Petrischalen aus dem Heizkissen nehmen und auf eine andere Unterlage stellen. Zählen Sie dann, wie viele Larven sich in jedem Substrat befinden. Wir haben beobachtet, dass bunte Larven in ihrem gewählten Substrat bleiben.Präferenz für die Eiablagestelle des Weibchens. Schritt eins: Versuchsaufbau. Die Aufgabe kann auf einem normalen Regal erledigt werden, das zuvor mit schwarzen Kartons abgedeckt war.Diese Pappen werden, genau wie bei einem Larven-Assay, benötigt, so dass für die erwachsenen Weibchen keine visuellen Hinweise zur Verfügung stehen. Außerdem muss das Regal gleichmäßig mit LED-Streifen ausgekleidet werden. Legen Sie in einem Raum bei 25 Grad Celsius das Heizkissen in die Mitte des Regals.Verwenden Sie Pappe um das Heizkissen herum als Stütze, um alles auf dem gleichen Niveau zu halten. Legen Sie einen schwarzen Karton über das gesamte Set, ein Heizkissen und Stützpappe, um das gleiche Farbmuster über allen Substraten zu erhalten. Positionieren Sie die Heizkissen unter zwei Armen desselben Kreuzes zwischen zwei verschiedenen Kreuzen.Dadurch kann der Platz im Regal besser genutzt werden. Schalten Sie die LED-Leuchten und das Heizkissen vor Beginn des Experiments ein. Denken Sie daran, die kreuzförmigen Gläser immer mit 70%igem Ethanol zu reinigen, um eine Geruchskontamination zwischen den Tests zu vermeiden.Schritt zwei: Vorbereitung der Substrate. Bereiten Sie die Plastik-Petrischalen mit fünf Gramm frischem oder verdorbenem Fleisch zu. Das Substrat ist das gleiche wie beim Larventest, frisch und fünf Tage alt, verfault.Für jedes Kreuz werden insgesamt vier Petrischalen benötigt, zwei mit frischem Fleisch und zwei mit verdorbenem Fleisch. Für das frische Fleisch fügen Sie einen Millimeter verdünntes Rinderblut hinzu, das zur Hälfte aus gerinnungshemmendem Blut und zur Hälfte aus Wasser besteht. Für das verdorbene Fleisch einen Millimeter gefiltertes Wasser hinzugeben.Denken Sie daran, beide Substrate gut umzurühren und verschiedene Löffel zu verwenden, um eine Geruchskreuzkontamination zwischen verdorbenem und frischem Fleisch zu vermeiden. Prüfen Sie, ob der Alkohol an den Kreuzen vollständig verdunstet ist. Stellen Sie dann vier Petrischalen mit Fleisch an die Enden der gekreuzten Arme, eine von jeder Fleischsorte auf das Heizkissen und die anderen beiden außerhalb der Heizkissenoberfläche.Auf diese Weise kann jedes der Kreuze vier Substrate haben: frisch und kalt, faul und kalt, frisch und heiß und schließlich faul und heiß. Die Öffnung der Kreuze verschließen und die Substrate ca. 10 Minuten erhitzen lassen. Schritt drei, weiblicher Test.Sammle ein Weibchen im Fliegenkäfig. Sie zeichnen sich durch einen vergrößerten und weißlich-gelben Hinterleib aus. Trennen Sie eine Buchse für jedes Kreuz in einzelnen Röhren.Überprüfen Sie die Temperatur der Substrate mit einem Infrarot-Thermometer. Die kältere Seite sollte bei etwa 25 Grad Celsius und die heißere bei etwa 33 Grad Celsius liegen. Lege ein Röhrchen mit einem gegriffenen Weibchen direkt in die mittlere Öffnung jedes Kreuzes.Nachdem das Weibchen das Kreuz betreten hat, schließen Sie die Öffnung mit dem Deckel. Nachdem Sie alle Weibchen in jedes Kreuz gelegt haben, schließen Sie den offenen Teil des Regals mit der schwarzen Pappe, um sie vor externen Lichtquellen zu schützen. Lassen Sie das Experiment genau vier Stunden laufen.Nach Ablauf dieser Zeit wird das Weibchen mit einem Schlauch von den Kreuzen entfernt. Prüfen Sie dann, ob es eine andere Position auf dem Substrat gab. Identifizieren Sie den Deckel jeder Petrischale mit dem Namen des Substrats.Verwenden Sie 70%iges Ethanol, um die Kreuze von jeglichem Geruch aus dem Test zu reinigen. Schritt vier: Eier zählen. Die Petrischalen können vor dem Zählen eingefroren werden.In diesem Fall die Petrischalen auftauen. Zählen Sie dann die Anzahl der Eier in jedem Substrat mit einem Stereomikroskop. Datenanalyse und Statistik.Schritt eins: Berechnung des Präferenzindexes. Für jede Wiederholung der Verhaltenstests wird ein Präferenzindex separat für die Art des Substrats und für die Temperatur berechnet. Der Präferenzindex für den Substrattyp wird durch die Anzahl der Larven oder Eier auf Frischfleischsubstraten dividiert durch die Gesamtzahl der Larven oder Eier auf allen Substraten dargestellt.Der Präferenzindex für die Temperatur wird durch die Anzahl der Larven oder Eier auf heißen Substraten geteilt durch die Gesamtzahl der Larven oder Eier auf allen Substraten dargestellt. Unter Berücksichtigung beider Indexpräferenzen spiegeln Werte nahe eins die Präferenz für frische oder heiße Substrate wider. Und Werte nahe Null bedeuten die Bevorzugung von faulen oder kalten Substraten.Schritt zwei: Vergleich der beobachteten Präferenz mit der Zufallswahl. Wir können den Präferenzindex für die Temperatur auf der Y-Achse und den Präferenzindex für das Fleisch auf der X-Achse visualisieren. Um festzustellen, ob die Larven und/oder Weibchen eine Präferenz für eine Erkrankung zeigen, verglichen wir unsere Ergebnisse mit einer zufälligen Auswahl unter Verwendung simulierter Daten.Unsere Larvenergebnisse unterschieden sich signifikant von allen simulierten Datensätzen in Bezug auf Temperatur und Fleischpräferenz. Grafisch ist ersichtlich, dass die Larven eine starke Vorliebe für das faule und kalte Substrat zeigten. Wir fanden heraus, dass sich die weibliche Präferenz für eine Fleischsorte in etwa 30% der Vergleiche signifikant von einer zufälligen Wahl unterschied.Bei der Temperatur ergaben rund 70 % unserer Vergleiche eine signifikante Präferenz. Beide Protokolle bieten die Möglichkeit, die Präferenz von Larven und Weibchen für zwei interagierende Faktoren, die Fleischsorte und die Temperatur, zu testen. Die Tests sind unkompliziert und können angepasst werden, um die Präferenz anderer Arten der gleichen Größe und/oder anderer Bedingungen zu testen.Wir wissen, dass das Verhalten von Tieren sehr variabel ist und von mehreren Umweltfaktoren beeinflusst wird, daher sollte besonders darauf geachtet werden, ungleichmäßige Beleuchtung, anhaltende Gerüche und andere Verunreinigungen des Substrats durch gemeinsam genutzte Utensilien zu vermeiden. Danke fürs Zuschauen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Behavior

Verhalten

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Erforschung der Lebensgeschichte: Verwendung von Temperatur und Substrattyp als interagierende Faktoren für Schmeißfliegenlarven und weibliche Präferenzen (Video) | JoVE Journal

Erforschung der Lebensgeschichte: Verwendung von Temperatur und Substrattyp als interagierende Faktoren für Schmeißfliegenlarven und weibliche Präferenzen

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