Name: Eine auf Lebendzellen basierende Strategie für maschinelles Lernen zur Überwachung der Differenzierung pluripotenter Stammzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Erfahren Sie eine Strategie des maschinellen Lernens zur Überwachung der Differenzierung pluripotenter Stammzellen mittels Live-Zell-Bildgebung. Diese Methode optimiert Protokolle und verbessert die Reproduzierbarkeit.

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<meta charset="utf8"></head><body>Überwachung der Differenzierung pluripotenter Stammzellen durch bildbasierte ML-Strategie

<ol><li>Yoshida, Y., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+10+years+later%3A+for+cardiac+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells 10 years later: for cardiac applications.</a> Circ Res. 120 (12), 1958-1968 (2017).</li>
<li>Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+technology%3A+a+decade+of+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress.</a> Nat Rev Drug Discov. 16 (2), 115-130 (2017).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nat Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li>
<li>Mordwinkin, N. M., Burridge, P. W., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+high-throughput+drug+discovery%2C+cardiotoxicity+screening%2C+and+publication+standards%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiovasc+Transl+Res%22%5BJournal%5D)">A review of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for high-throughput drug discovery, cardiotoxicity screening, and publication standards.</a> J Cardiovasc Transl Res. 6 (1), 22-30 (2013).</li>
<li>Vanden Berg, C. W., Elliott, D. A., Braam, S. R., Mummery, C. L., Davis, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes+under+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes under defined conditions.</a> Methods Mol Biol. 1353, 163-180 (2016).</li>
<li>Burridge, P. W., Holmström, A., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+culture+and+cardiomyocyte+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Chemically defined culture and cardiomyocyte differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Curr Protoc Hum Genet. 87, 1-15 (2015).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+tissue-like+constructs+for+repairing+the+infarcted+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Human pluripotent stem cell-derived cardiac tissue-like constructs for repairing the infarcted myocardium.</a> Stem Cell Rep. 9 (5), 1546-1559 (2017).</li>
<li>Smith, A. S. T., Macadangdang, J., Leung, W., Laflamme, M. A., Kim, D. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPSC-derived+cardiomyocytes+and+tissue+engineering+strategies+for+disease+modeling+and+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Human iPSC-derived cardiomyocytes and tissue engineering strategies for disease modeling and drug screening.</a> Biotechnol Adv. 35 (1), 77-94 (2017).</li>
<li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+to+assess+drug+cardiotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes to assess drug cardiotoxicity.</a> Nat Protoc. 13 (12), 3018-3041 (2018).</li>
<li>Mehta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+targeted+and+testable+antiarrhythmic+therapy+for+long-QT+syndrome+type+2+using+a+patient-specific+cellular+model%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Identification of a targeted and testable antiarrhythmic therapy for long-QT syndrome type 2 using a patient-specific cellular model.</a> Eur Heart J. 39 (16), 1446-1455 (2018).</li>
<li>Cahan, P., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+and+implications+of+pluripotent+stem+cell+variability+and+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Origins and implications of pluripotent stem cell variability and heterogeneity.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (6), 357-368 (2013).</li>
<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+memory+in+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).</li>
<li>Rouhani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+background+drives+transcriptional+variation+in+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic background drives transcriptional variation in human induced pluripotent stem cells.</a> PLoS Genet. 10 (6), e1004432(2014).</li>
<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+cell+type+can+influence+the+epigenome+and+differentiation+potential+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Donor cell type can influence the epigenome and differentiation potential of human induced pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 29 (12), 1117-1119 (2011).</li>
<li>Garitaonandia, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+risk+of+genetic+and+epigenetic+instability+in+human+embryonic+stem+cells+associated+with+specific+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Increased risk of genetic and epigenetic instability in human embryonic stem cells associated with specific culture conditions.</a> PLoS One. 10 (2), e0118307(2015).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li>
<li>Matoba, N., Yamashita, T., Takayama, K., Sakurai, F., Mizuguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+human+iPS+cell+culture+method+for+efficient+hepatic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Optimal human iPS cell culture method for efficient hepatic differentiation.</a> Differentiation. 104, 13-21 (2018).</li>
<li>Volpato, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducibility+of+molecular+phenotypes+after+long-term+differentiation+to+human+iPSC-derived+neurons%3A+A+multi-site+omics+study%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Reproducibility of molecular phenotypes after long-term differentiation to human iPSC-derived neurons: A multi-site omics study.</a> Stem Cell Rep. 11 (4), 897-911 (2018).</li>
<li>Anderson, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+serendipity+and+reproducibility%3A+Pluripotent+stem+cells+as+experimental+systems+for+intellectual+and+developmental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Balancing serendipity and reproducibility: Pluripotent stem cells as experimental systems for intellectual and developmental disorders.</a> Stem Cell Rep. 16 (6), 1446-1457 (2021).</li>
<li>Sepac, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+cardiomyogenic+potential+among+human+ESC+and+iPSC+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Comparison of cardiomyogenic potential among human ESC and iPSC lines.</a> Cell Transplant. 21 (11), 2523-2530 (2012).</li>
<li>Laco, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+inconsistencies+of+cardiac+differentiation+efficiency+induced+by+the+GSK3%CE%B2+inhibitor+CHIR99021+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Unraveling the inconsistencies of cardiac differentiation efficiency induced by the GSK3β inhibitor CHIR99021 in human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Rep. 10 (6), 1851-1866 (2018).</li>
<li>Volpato, V., Webber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addressing+variability+in+iPSC-derived+models+of+human+disease%3A+guidelines+to+promote+reproducibility%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Addressing variability in iPSC-derived models of human disease: guidelines to promote reproducibility.</a> Dis Model Mech. 13 (1), 042317(2020).</li>
<li>Hu, B. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+follows+developmental+principles+but+with+variable+potency%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107 (9), 4335-4340 (2010).</li>
<li>Huo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+batch+variations+in+induced+pluripotent+stem+cell-derived+human+cardiomyocytes+from+2+major+suppliers%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Evaluation of batch variations in induced pluripotent stem cell-derived human cardiomyocytes from 2 major suppliers.</a> Toxicol Sci. 156 (1), 25-38 (2017).</li>
<li>Rostam, H. M., Reynolds, P. M., Alexander, M. R., Gadegaard, N., Ghaemmaghami, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+based+machine+learning+for+identification+of+macrophage+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Image based machine learning for identification of macrophage subsets.</a> Sci Rep. 7 (1), 3521(2017).</li>
<li>Christiansen, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+silico+labeling%3A+Predicting+fluorescent+labels+in+unlabeled+images%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">In silico labeling: Predicting fluorescent labels in unlabeled images.</a> Cell. 173 (3), 792-803 (2018).</li>
<li>Buggenthin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+of+hematopoietic+lineage+choice+by+deep+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Prospective identification of hematopoietic lineage choice by deep learning.</a> Nat Methods. 14 (4), 403-406 (2017).</li>
<li>Smith, Z. D., Nachman, I., Regev, A., Meissner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+single-cell+imaging+of+direct+reprogramming+reveals+an+early+specifying+event%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Dynamic single-cell imaging of direct reprogramming reveals an early specifying event.</a> Nat Biotechnol. 28 (5), 521-526 (2010).</li>
<li>Fan, K., Zhang, S., Zhang, Y., Lu, J., Holcombe, M., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+machine+learning+assisted%2C+label-free%2C+non-invasive+approach+for+somatic+reprogramming+in+induced+pluripotent+stem+cell+colony+formation+detection+and+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A machine learning assisted, label-free, non-invasive approach for somatic reprogramming in induced pluripotent stem cell colony formation detection and prediction.</a> Sci Rep. 7 (1), 13496(2017).</li>
<li>Kusumoto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+deep+learning-based+system+to+identify+endothelial+cells+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Automated deep learning-based system to identify endothelial cells derived from induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Rep. 10 (6), 1687-1695 (2018).</li>
<li>Zhu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+learning-based+predictive+identification+of+neural+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Deep learning-based predictive identification of neural stem cell differentiation.</a> Nat Commun. 12 (1), 2614(2021).</li>
<li>Qian, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+for+quality+control+of+cardiomyocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging for quality control of cardiomyocyte differentiation.</a> Nat Commun. 12 (1), 4580(2021).</li>
<li>Ounkomol, C., Seshamani, S., Maleckar, M. M., Collman, F., Johnson, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+prediction+of+three-dimensional+fluorescence+images+from+transmitted-light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Label-free prediction of three-dimensional fluorescence images from transmitted-light microscopy.</a> Nat Methods. 15 (11), 917-920 (2018).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+live-cell+image-based+machine+learning+strategy+for+reducing+variability+in+PSC+differentiation+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Discovery%22%5BJournal%5D)">A live-cell image-based machine learning strategy for reducing variability in PSC differentiation systems.</a> Cell Discovery. 9 (1), 53(2023).</li>
<li>Selvaraju, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grad-CAM%3A+Visual+explanations+from+deep+networks+via+gradient-based+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+IEEE+Int+Conf+Computer+Vision+%28ICCV%29%22%5BJournal%5D)">Grad-CAM: Visual explanations from deep networks via gradient-based localization.</a> Proc IEEE Int Conf Computer Vision (ICCV). , 618-626 (2017).</li>
<li>Isola, P., Zhu, J. -Y., Zhou, T., Efros, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-to-image+translation+with+conditional+adversarial+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+IEEE+Conf+Computer+Vision+Pattern+Recognition+%28CVPR%29%22%5BJournal%5D)">Image-to-image translation with conditional adversarial networks.</a> Proc IEEE Conf Computer Vision Pattern Recognition (CVPR). , 5967-5976 (2017).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ResNeSt%3A+Split-attention+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+IEEE%2FCVF+Conf+Computer+Vision+Pattern+Recognition+Workshops+%28CVPRW%29%22%5BJournal%5D)">ResNeSt: Split-attention networks.</a> Proc IEEE/CVF Conf Computer Vision Pattern Recognition Workshops (CVPRW). , 2735-2745 (2022).</li>
<li>Halabi, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-activatable+cell+tracker+for+controlled+and+prolonged+single-cell+labeling%29%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dual-activatable cell tracker for controlled and prolonged single-cell labeling).</a> ACS Chem. Biol. 15 (6), 1613-1620 (2020).</li>
<li>Hannan, N. R. F., Segeritz, C. -P., Touboul, T., Vallier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+hepatocyte-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Production of hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 8 (2), 430-437 (2013).</li>
<li>Zhang, H., Shen, M., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+quiescent+cardiac+fibroblasts+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of quiescent cardiac fibroblasts derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Methods Mol Biol. 2454, 109-115 (2022).</li>
<li>Harding, M. J., McGraw, H. F., Nechiporuk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+and+regulation+of+multicellular+rosette+structures+during+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The roles and regulation of multicellular rosette structures during morphogenesis.</a> Development. 141 (13), 2549-2558 (2014).</li>
<li>Najm, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+robust+generation+of+functional+oligodendrocyte+progenitor+cells+from+epiblast+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid and robust generation of functional oligodendrocyte progenitor cells from epiblast stem cells.</a> Nat Methods. 8 (11), 957-962 (2011).</li>
<li>Hogrebe, N. J., Maxwell, K. G., Augsornworawat, P., Millman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+insulin-producing+pancreatic+%CE%B2+cells+from+multiple+human+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of insulin-producing pancreatic β cells from multiple human stem cell lines.</a> Nat Protoc. 16 (9), 4109-4143 (2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0,25 % Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>Verdünnte Digests wurden für den CPC- und CM-Aufschluss verwendet</td></tr><tr><td>4 % Paraformaldehyd in PBS</td><td>KeyGEN BioTECH</td><td>KGIHC016</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Zellkulturplatte</td><td>NEST</td><td>703001</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Zellkulturplatte</td><td>NEST</td><td>701001</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement Minus Insulin</td><td>Gibco</td><td>A1895601</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>GPC BIOTECH</td><td>AA904-100G</td><td></td></tr><tr><td>Celldiscoverer 7</td><td>Zeiss</td><td>Instrumente zur Aufnahme von Hellfeldbildern während der Differenzierung und von finalen</td><td></td> cTnT-Bildern</tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Selleck</td><td>S1263</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>Esel-Anti-Maus-IgG (H+L) Hochgradig kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo</td><td>A-21202</td><td>Sekundärantikörper</td></tr><tr><td>FACSAria III</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Durchflusszytometrie-Sortierer</td></tr><tr><td>Fetales Rinderserum (FBS)</td><td>VISTECH</td><td>SE100-B</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>YEASEN</td><td>40732ES03</td><td></td></tr><tr><td>Humane pluripotente Stammzellen chemisch definiertes Medium</td><td>Cauliscell Inc</td><td>400105</td><td>Basalmedium des PSC-Präparationsmediums</td></tr><tr><td>iPS-18</td><td>TaKaRa</td><td>Y00300</td><td></td></tr><tr><td>iPS-B1</td><td>Cellapy</td><td>CA4025106</td><td></td></tr><tr><td>iPS-F</td><td>Nuwacell</td><td>RC01001-B</td><td></td></tr><tr><td>iPS-M</td><td>Nuwacell</td><td>RC01001-A</td><td></td></tr><tr><td>IWR1-1-endo</td><td>Selleck</td><td>S7086</td><td>IWR1</td></tr><tr><td>Jupyter Notebook</td><td>N/ A</td><td>Version 6.4.0<</td><td>a href="https://jupyter.org/">https://jupyter.org/</a></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>Version R2020a</td><td>Software für wissenschaftliche Berechnungen und Bildannotation</td></tr><tr><td>Matrigel Matrix</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Matrigel</td></tr><tr><td>Maus monoklonales IgG1 anti-cTnT</td><td>Thermo</td><td>MA5-12960</td><td>cTnT primärer Antikörper</td></tr><tr><td>Normaler Esel Serum</td><td>Jackson</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>ORCA-Flash 4.0 V3 digitale CMOS-Kamera</td><td>Hamamatsu</td><td>C13440-20CU</td><td>Die Digitalkamera montiert auf Celldiscoverer7</td></tr><tr><td>PBS</td><td>NEB</td><td>21-040-CVR</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Pluripotenzwachstum Mater 1 basales Medium</td><td>Cellapy</td><td>CA1007500-1</td><td>Basalmedium von PSC Kulturmedium</td></tr><tr><td>Pluripotenz Wachstum Mater 1 Ergänzung</td><td>Cellapy</td><td>CA1007500-2</td><td>Ergänzung des PSC-Kulturmediums</td></tr><tr><td>Prism</td><td>Graphpad</td><td>Version 8/9</td><td>Statistische Software zur statistischen Analyse und</td></tr><tr><td>Darstellung Python</td><td>N/A</td><td>Version 3.6</td><td>Python 3 Umgebung für wissenschaftliche Berechnungen, mit den Paketen pytorch (1.9.0), numpy, scipy, pandas, visdom, scikit-learn, scikit-image, OpenCV-Python und Matplotlib-Software für wissenschaftliche Berechnungen und Bildanmerkungen.</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11875176</td><td></td></tr><tr><td>Supplement hPSC-CDM (500x)</td><td>Cauliscell Inc</td><td>00015</td><td>Supplement des PSC-Präparationsmediums</td></tr><tr><td>TiE</td><td>Nikon</td><td></td><td>Ein inverses Fluoreszenzmikroskop (mit Modifikation) für die regionenselevtive Aufreinigung</td></tr><tr><td>Triton&nbsp; X-100</td><td>Amresco</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Versene Solution</td><td>Thermo</td><td>15040066</td><td>EDTA-Lösung für den PSC-Aufschluss</td></tr><tr><td>Y27632</td><td>Selleck</td><td>S6390</td><td></td></tr><tr><td>Zen</td><td>Zeiss</td><td>Version 3.1</td><td>Eine unterstützende Software von Celldiscoverer7 für die Bilderfassung, -verarbeitung und -analyse</td></tr></tbody></table>

eine auf lebendzellen basierende strategie für maschinelles lernen zur Überwachung der differenzierung pluripotenter stammzellen

A Live-cell Image-Based Machine Learning Strategy to Monitor Pluripotent Stem Cell Differentiation

Basierend auf Hellfeld-Imaging und ML kann der gesamte Differenzierungsprozess intelligent überwacht und optimiert werden. In der PSC-Phase entwickelten wir ein ML-Modell, das die endgültige Differenzierungseffizienz entsprechend den morphologischen Merkmalen der anfänglichen PSC-Kolonien vorhersagen konnte, um den am besten geeigneten oder geeigneten Zeitpunkt für die Einleitung der Differenzierung zu bestimmen (Abbildung 4A,B). Die vom Random-Forest-Modell vorhergesagte Differenzierungseffizienz korreliert stark mit der wahren Differenzierungseffizienz (Pearsons r = 0,76, P &lt; 0,0001) (Abbildung 4B). Das trainierte Modell hebt auch Merkmale hervor, die für die Unterscheidung am wichtigsten sind. Unter allen morphologischen Merkmalen der Kolonie sind die Standardabweichung, das Minimum und das Min/Max-Verhältnis der Mittelkonturabstände (CCD) sowie der Umfang, die Fläche, das Flächen-/Umfangsverhältnis, die Konvexität und die Zirkularität die 8 Merkmale mit dem wichtigsten Gewicht. Die Beziehung zwischen diesen Merkmalen und der endgültigen Effizienz deutet darauf hin, dass anfängliche PSC-Kolonien mit moderater Fläche und längeren, unregelmäßigen Peripherien tendenziell eine höhere Differenzierungseffizienz besaßen (Abbildung 4A), was uns dazu inspiriert, die Differenzierungseffizienz zu verbessern, indem wir die Verarbeitungszeit der Verdauungslösung erhöhten, um kleinere Kolonien mit längeren, unregelmäßigeren Grenzen zu erhalten (siehe Protokollschritt 1.3.1). Das ML-basierte Monitoring von PSC-Kolonien und die optimierten Zellpassage-Operationen realisieren die Optimierung des anfänglichen Zellzustands.
Im Stadium I der kardialen Differenzierung haben wir die Dosis von CHIR (einem Induktor für die frühe kardiale Differenzierung) mit Hilfe von ML bewertet und angepasst. Mit Hilfe der logistischen Regression kann die CHIR-Dosis anhand von 0-12 h Zeitraffer-Hellfeldbildern frühzeitig bewertet werden. Der logistische Regressionsklassifikator erreicht eine Genauigkeit von 93,1 %, eine Genauigkeit von 88,7 %, einen Abruf von 94,5 %, einen F1-Score von 91,1 % und eine AUC von 97,2 %, wenn die CHIR-Dauer auf 24 Stunden festgelegt ist. Die Deviation Scores (vorhergesagtes Ergebnis) korrelieren stark mit der "ΔCHIR-Konzentration" (wahres Ergebnis) für jede CHIR-Dosisbedingung in Experimenten (Pearsons r = 0,82, P &lt; 0,0001) (Abbildung 4C,D), was darauf hindeutet, dass die ML-Vorhersage die Abweichung der CHIR-Dosen vom Optimum widerspiegeln kann. Durch eine frühzeitige Bewertung der CHIR-Dosen können wir die Dauer oder Konzentration der CHIR-Behandlung vor 48 Stunden auf das Optimum einstellen, was uns ermöglicht, den falsch differenzierten Zellverlauf umgehend zu korrigieren und die CM-Differenzierung mit hoher Effizienz aufrechtzuerhalten.
Wir haben auch ML-Modelle entwickelt, um CPCs und CMs informativ aus Hellfeldbildern in Phase II und III der Differenzierung zu erkennen (Abbildung 5A-D). Durch die Eingabe von Hellfeldbildern lebender Zellen können trainierte ML-Modelle die regionale Verteilung von CPCs und CMs vorhersagen und die endgültige Differenzierungseffizienz nicht-invasiv bewerten. Für die CPC-Erkennung stimmen die von ResNeSt und Grad-CAM vorhergesagten CPC-Segmentierungsmasken mit manuell annotierten Masken überein (Abbildung 5A), mit einem mittleren IoU von 59,0 %. Der prognostizierte Anteil der CPC-Regionen kann auch als Indikator für die endgültige Differenzierungseffizienz dienen (Pearsons r = 0,88, P &lt; 0,0001) (Abbildung 5B). Für die CM-Erkennung kann das pix2pix-Modell cTnT-Fluoreszenzbilder erzeugen, die echten (experimentell erhaltenen) cTnT-Fluoreszenzbildern ähneln (Abbildung 5C), mit einer hohen Korrelation zwischen dem vorhergesagten und dem wahren Ganzwell-Differenzierungseffizienzindex (Pearsons r = 0,93, P &lt; 0,0001) (Abbildung 5D). Dieser Ansatz vermeidet irreversible Schäden an Zellen durch Immunfluoreszenzfärbung oder Flow-Sorting. Basierend auf einer photoaktivierten Sonde (DACT-1) ist es uns gelungen, eine effiziente regionenselektive CPC-Aufreinigung ohne Biomarker durchzuführen (Abbildung 5E,F), die eine Echtzeit-Aufreinigung des gewünschten Zelltyps während des Differenzierungsprozesses ermöglicht.
Durch die Nutzung von Hellfeld-Bildgebung und ML für lebende Zellen ermöglicht die Methodik eine Echtzeit-Vorhersage der Zelllinie und eine Effizienzbewertung im gesamten Differenzierungsprozess, wodurch die PSC-Differenzierung moduliert und stabilisiert wird.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66823/66823fig01.jpg"> 
Abbildung 1: Schematische Darstellung des ML-gestützten CM-Differenzierungs-Workflows. Der Experimentator führt eine kardiale Differenzierung durch und erhält Zeitraffer-Hellfeld-Zellbilder von einem Mikroskop; Bilder in jeder Phase der CM-Differenzierung werden zur Vorhersage an trainierte ML-Modelle übergeben; Anhand der Vorhersage als Feedback modulieren und optimieren die Experimentatoren das Differenzierungsschema in Echtzeit, um eine stabile, hocheffiziente Differenzierung zu erreichen. Maßstabsleiste = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66823/66823fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66823/66823fig02.jpg"> 
Abbildung 2: Aufnahme von Zellbildern. (A) Beispiel für ein Hellfeld-Lebendzellbild aus dem PSC-Stadium mit 70% Zellkonfluenz. (B) Beispiel für ein Hellfeld-Lebendzellbild aus dem PSC-Stadium mit 80-90% Zellkonfluenz. (C) Beispiel für ein Hellfeld-Lebendzellenbild aus der CPC-Phase. (D) Beispiel für ein Hellfeld-Lebendzellbild aus dem CM-Tisch. (E) Beispiel für Hellfeld und Fluoreszenz nach Immunfluoreszenzfärbung aus demselben Sichtfeld. (A-E) Maßstabsleiste = 250 μm. Abkürzungen: PSC = pluripotente Stammzelle; CPC = kardiale Vorläuferzelle; CM = Kardiomyozyten; cTnT = kardiales Troponin T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66823/66823fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66823/66823fig03.jpg"> 
Abbildung 3: Screenshots für die ML-Nutzung. (A-C) Repräsentative Screenshots für ML in der PSC-Phase, einschließlich (A) Datensatzvorbereitung, (B) Testen der Modellleistung und (C) Interpretation der Wichtigkeit von Funktionen. (D-F) Repräsentative Screenshots für ML in Phase I, einschließlich (D) Datensatzvorbereitung und (E,F) Modellbewertung. (G-I) Repräsentative Screenshots für ML in Phase II, einschließlich (G) Datensatzvorbereitung, (H) Modelltraining und (I) Modellbewertung. (J-L) Repräsentative Screenshots für ML in Phase III, einschließlich (J) Modelltraining und (K,L) Modellbewertung. Abkürzungen: ML = maschinelles Lernen; PSC = pluripotente Stammzelle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66823/66823fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66823/66823fig04.jpg"> 
Abbildung 4: Repräsentative Ergebnisse auf der PSC-Stufe und Stufe I für die ML-basierte CM-Differenzierung. (A) Ergebnisse der Merkmalsvisualisierung auf der PSC-Stufe. Der Zusammenhang zwischen der Differenzierungseffizienz und den acht wichtigsten Merkmalen wird aufgezeigt. Die Wichtigkeit von Features wird durch das trainierte ML-Modell bestimmt. Der Bereich der einzelnen Funktionen ist in 20 Klassen unterteilt. Differenzierung Effizienzindizes für Vertiefungen innerhalb jeder Klasse werden gemittelt und farblich angezeigt. Der Trend der Farbänderung stellt dar, wie jedes morphologische Merkmal die endgültige Differenzierungseffizienz beeinflusst. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine moderate Fläche, längere Umfänge, variierendere Achskonturabstände, eine geringere Zirkularität und eine höhere Konvexität für die Differenzierung förderlicher sind. (B) Leistungsbewertung von ML in der PSC-Phase durch Korrelationsanalyse zwischen dem wahren und dem prognostizierten Differenzierungseffizienzindex. Die hohe Korrelation deutet darauf hin, dass das Differenzierungspotenzial von PSC-Kolonien anhand ihrer morphologischen Merkmale vorhergesagt werden kann. n = 584 Vertiefungen. (C) Leistungsbewertung von ML in Stufe I unter Verwendung einer Korrelationsanalyse zwischen den vorhergesagten Abweichungswerten und den wahren ΔCHIR-Konzentrationen für jede CHIR-Dosisbedingung in einer Charge. Abweichungswerte (im Bereich von -1 bis 1) werden nicht-invasiv von ML unter Verwendung von 0-12 h Hellfeld-Bildströmen vorhergesagt. ΔCHIR-Konzentrationen (..., -4 μM, -2 μM, 0, 2 μM, 4 μM, ...) werden experimentell durch die endgültigen Differenzierungsergebnisse bestimmt, um die tatsächliche Abweichung von den optimalen Bedingungen für jede CHIR-Bedingung zu messen. Predicted Deviation Scores sind ein starker Indikator für die tatsächlichen ΔCHIR-Konzentrationen, was darauf hindeutet, dass die ML-Vorhersage als Signal für die Bewertung und Anpassung der CHIR-Dosis dienen kann. Blaue und rote Kästchen stellen die Unter- bzw. Überdosierungsbedingungen dar. (D) Leistungsbewertung von ML in Phase I mittels chargenübergreifender Validierung. In jeder Runde wird ein Batch zum Testen verwendet, während andere zum Training verwendet werden, um die Generalisierungsfähigkeit von ML-Modellen an neuen Batches zu testen. Es wird eine Korrelationsanalyse zwischen den vorhergesagten Abweichungswerten und den tatsächlichen ΔCHIR-Konzentrationen (unter einer CHIR-Dauer von 24 Stunden) durchgeführt. Die Farbe der Punkte steht für unterschiedliche Prüfchargen. n = 20 CHIR-Dosen. Diese Abbildung stammt von Yang et al.35. Abkürzungen: ML = maschinelles Lernen; PSC = pluripotente Stammzelle; CHIR = CHIR99021. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66823/66823fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66823/66823fig05.jpg"> 
Abbildung 5: Repräsentative Ergebnisse im CPC-Stadium und im CM-Stadium für die ML-basierte CM-Differenzierung. (A) Typisches Ergebnis von ML für die CPC-Erkennung im Stadium II. Gezeigt sind die echten cTnT-Fluoreszenzbilder an Tag 12 (links), die manuell annotierten CPC-Regionen (Mitte) und die CPC-Regionen, die von ML mit Hellfeldbildern an Tag 6 vorhergesagt wurden (rechts). Die vorhergesagten Ergebnisse ähneln stark den tatsächlichen experimentellen Ergebnissen. Maßstabsbalken = 1 mm. (B) Leistungsbewertung von ML in Stufe II mittels Korrelationsanalyse zwischen dem wahren Differenzierungseffizienzindex (ab cTnTT-Fluoreszenzmarkierungen an Tag 12) und dem vorhergesagten Prozentsatz der CPC-Regionen (aus Hellfeldbildern an Tag 6). Die hohe Korrelation deutet darauf hin, dass die Differenzierungseffizienz im Stadium II nicht-invasiv vorhergesagt werden kann. True Differentiation Efficiency Indizes werden zwischen 0 % und 100 % normalisiert. n = 35 Vertiefungen. (C) Typisches Ergebnis von ML für die CM-Erkennung im Stadium III. Dargestellt sind die wahren cTnT-Fluoreszenzergebnisse (links), die vorhergesagten cTnT-Fluoreszenzergebnisse (Mitte) und die Heatmap zum Vergleich der vorhergesagten und wahren Fluoreszenzintensitäten an jedem Pixel (rechts). Die Größe von Fluoreszenzbildern wird auf 512 x 512 Pixel geändert, und die Zahlen in den Heatmap-Abschnitten stellen die Häufigkeit von Pixeln pro 100 dar. Ein großer Teil der Pixel befindet sich entlang der diagonalen Linie der Heatmap, was darauf hindeutet, dass die vorhergesagten und die tatsächlichen Fluoreszenzintensitäten nahe beieinander liegen. Maßstabsbalken = 1 mm. (D) Leistungsbewertung von ML in Stufe III unter Verwendung einer Korrelationsanalyse zwischen dem wahren und dem vorhergesagten Differenzierungseffizienzindex. Wahre und vorhergesagte Differenzierungseffizienzindizes werden zwischen 0 % und 100 % normiert. n = 36 Vertiefungen. (E) Bildidentifizierter CPC-Reinigungseffekt von Tag 6. Nach FACS und 6-tägiger Kultivierung zeigen unmarkierte Bild-identifizierte CPCs eine hohe CM-Reinheit im Vergleich zu DACT-1-markierten Nicht-CPCs und Zellen der Kontrollgruppe (CTL). Maßstabsbalken = 100 μm. (F) Quantitative Analyse des Reinigungseffekts durch Vergleich des prozentualen Anteils der cTnT+ -Zellen in (E). Die Daten sind die Mittel ± SD. n = 5 Bilder. * P &lt; 0,05; P &lt; 0,0001 durch einfache ANOVA, gefolgt von Dunnetts Mehrfachvergleichstests. Diese Abbildung stammt von Yang et al.35. Abkürzungen: ML = maschinelles Lernen; PSC = pluripotente Stammzelle; CPC = kardiale Vorläuferzelle; CM = Kardiomyozyten; cTnT = kardiales Troponin T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66823/66823fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Beobachtetes Problem</td>
			<td colspan="4">Mögliche Ursache</td>
			<td colspan="5">Lösung</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">ML-Modelle funktionieren im Trainingssatz nicht gut.</td>
			<td colspan="4">1. Das Training des ML-Modells konvergiert nicht gut. 2. Bei herkömmlichem ML sind die extrahierten Bildmerkmale nicht informativ genug, um Zellzustände und Abstammungslinien widerzuspiegeln. 3. Für Deep Learning reicht die Darstellungsleistung des entworfenen neuronalen Netzes nicht aus, um die Aufgabe zu erfüllen. 4. Die Aufgabe selbst ist schwer zu erlernen.</td>
			<td colspan="5">1. Optimieren Sie Hyperparameter, z. B. erhöhen Sie die Anzahl der Epochen und ändern Sie die Lerngeschwindigkeit. 2. Beobachten Sie die Bilder, um morphologische Hinweise auf die Zellzustände zu finden. Biologisch plausible Merkmale entwerfen. 3. Ändern Sie die Netzwerkarchitektur, um ihre Komplexität zu erhöhen. 4. Untersuchen Sie den Datensatz und stellen Sie sicher, dass die Merkmale der Zielzellen leicht identifiziert werden können. Wenn das Modell die Aufgabe nicht lernt, versuchen Sie, ML in einer Phase anzuwenden, in der die bildgebenden Hinweise klarer sind, oder eine einfachere Aufgabe zu entwerfen.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">ML-Modelle funktionieren im Trainingssatz nicht gut, aber nicht im Testsatz.</td>
			<td colspan="4">1. Das Modell passt den Trainingssatz übermäßig an.</td>
			<td colspan="5">1. Reichern Sie die Trainingsdatasets an, und trainieren Sie das Modell erneut. Erhöhen Sie die Vielfalt der Trainingsdatensätze, indem Sie mehr Zelllinien, Differenzierungsbedingungen und Bildgebungsbedingungen einbeziehen. Bei herkömmlichem ML kann die Verwendung der Merkmalsauswahl zum Verringern der Anzahl der Eingabe-Features auch die Generalisierungsfähigkeit des Modells erhöhen.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">ML-Modelle funktionieren bei neuen Chargen oder neuen Zelllinien nicht gut.</td>
			<td colspan="4">1. Mikroskop- und Bildgebungsparameter ändern sich. 2. Die morphologischen Merkmale verschiedener Zelllinien können unterschiedlich sein.</td>
			<td colspan="5">1. Stellen Sie sicher, dass das Bildgebungsgerät mit dem während des Modelltrainings identisch ist. 2. Sammeln Sie markierte Daten, die von neuen Zelllinien und/oder neuen Bildgebungsbedingungen erfasst wurden, trainieren Sie die ML-Modelle neu oder optimieren Sie sie.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Die ML-gesteuerte Modulation des Differenzierungsprozesses scheint das Differenzierungsergebnis nicht zu verbessern.</td>
			<td colspan="4">1. Die ML-Ausgabe ist ungenau. 2. Es gibt Probleme mit den experimentellen Reagenzien oder Verfahren. 3. Die Zelllinie hat zugrunde liegende Probleme, da sie nicht in der Lage ist, sich zu differenzieren.</td>
			<td colspan="5">1. Versuchen Sie die oben genannten Schritte zur Fehlerbehebung. 2. Überprüfen Sie die Laborreagenzien und experimentellen Verfahren. 3. Ändern Sie die Zelllinien.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Nach der Aufreinigung besteht immer noch eine Zelltyp-Kontamination.</td>
			<td colspan="4">1. Ungenaue Vorhersageergebnisse. 2. Einige unerwünschte Zellen, die sich am Rand des gereinigten Bereichs befanden, wurden eingekapselt.</td>
			<td colspan="5">1. Optimieren Sie die ML-vorhergesagten Ergebnisse. 2. Verwenden Sie die ML-vorhergesagten Ergebnisse konservativer, d.h. angemessene Reduzierung der Größe der CM-Region.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Schlechter Zellstatus nach der Reinigung.</td>
			<td colspan="4">1. Phototoxizität des Lasers. 2. Langsamer Betriebsprozess. 3. Zellschäden durch Verdauung. 4. Zellschäden, die durch den Fließsortierprozess verursacht werden.</td>
			<td colspan="5">1. Eliminieren Sie die unerwünschten Zellen durch Laserbestrahlung anstelle von Zielzellen. 2. Schnellere Bedienung. 3. Passen Sie die Passage-Methode an, z. B. die Konzentration von Verdauungsenzymen zu reduzieren. 4. Passen Sie die Sortiermethode an, z. B. indem Sie die während des Sortiervorgangs eingestellte Zellströmungsgeschwindigkeit verringern.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 1: Tabelle zur Fehlerbehebung.

Eine auf Lebendzellen basierende Strategie für maschinelles Lernen zur Überwachung der Differenzierung pluripotenter Stammzellen

Pluripotent stem cell (PSC) technologies have been widely used in drug discovery, disease modeling, and regenerative medicine.&#160;However, available ...

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

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