Isolierung und Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnung von hippokampalen Mikroglia aus adulten Mäusen

Unsere Forschung konzentriert sich auf die akute Isolierung von Mikroglia für Ganzzellaufzeichnungen, einschließlich Kaliumströme, um die Aktivität der Ionenkanäle zu verstehen. Das Protokoll ist auch für die Isolierung von Mikroglia für verschiedene Gehirnregionen anpassbar und bietet Einblicke in Null bei verschiedenen neurologischen Erkrankungen.

Zu den jüngsten Entwicklungen in unserem Forschungsbereich gehört die Verwendung des traditionellen Pankreatitis-Enzymverdaus, kombiniert mit der Reinigung von Mikroglia durch fluoreszenzaktive Zellsortierung. Diese Fortschritte haben die Genauigkeit und Effizienz der Isolierung spezifischer Mikroglia-Populationen für weitere Studien verbessert.

Unser Protokoll untersucht die elektrophysiologischen Eigenschaften von Mikroglia direkt aus dem Hippocampus der adulten Maus, anstatt sich auf primär kultivierte CS zu verlassen. Dieser Ansatz ermöglicht eine genauere Analyse der Mikroglia-Funktionen in ihrer natürlichen Umgebung.

Unsere Ergebnisse haben den Weg für neue wissenschaftliche Fragen über die biochemischen und funktionellen Eigenschaften von Mikroglia sowohl unter physiologischen als auch unter Krankheitsbedingungen geebnet und bieten Forschern wertvolle Hinweise zur weiteren Erforschung dieser Aspekte.

[Moderator] Legen Sie zunächst das betäubte Tier in Rückenlage auf einen Seziertisch und stecken Sie seine Gliedmaßen fest. Legen Sie den Brustkorb frei und perfundieren Sie das Herz mit eiskaltem, sterilem PBS, um intravaskuläre zirkulierende Blutzellen zu entfernen. Halten Sie dann den Kopf fest und schneiden Sie die Haut entlang der Gehirnmittellinie mit einer Schere ein, um den Schädel freizulegen. Schneiden Sie anschließend den hinteren Teil des Schädels beidseitig und zwischen den Augenhöhlen mit einer kleinen Schere ab. Schneide den Schädel entlang der sagittalen Naht ab und entferne den Schädel mit einer Pinzette. Entnehmen Sie danach schnell das Gehirngewebe. Legen Sie nun das Hirngewebe in 10 Zentimeter große Kulturschalen, die eiskaltes PBS enthalten. Präpariere die Großhirnrinde beidseitig mit einer Pinzette. Isolieren Sie das Hippocampusgewebe und schneiden Sie es in kleinere Stücke. Übertragen Sie die Stücke in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Suspendieren Sie dann die kleinen Stücke des Hippocampusgewebes wieder in zwei Millilitern eiskalter Hanks' Balanced Salt Solution oder HBSS. Und zentrifugieren Sie bei 300 g drei Minuten lang bei Raumtemperatur. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, geben Sie 1.950 Mikroliter der Enzymmischung eins in das 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, das die Hippocampus-Gewebestücke enthält. Schütteln Sie das Zentrifugenröhrchen fünf Minuten lang kontinuierlich in einem 37 Grad heißen Wasserbad. Geben Sie anschließend 30 Mikroliter der frisch zubereiteten Enzymmischung zwei in das 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Pipettieren Sie die Gewebefragmente 20 Mal mit einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze auf und ab und inkubieren Sie fünf Minuten lang in einem Wasserbad unter ständigem Schütteln bei 37 Grad Celsius. Nachdem Sie das Zentrifugenröhrchen entfernt haben, pipettieren Sie die Suspension mehrmals mit einer Ein-Milliliter-Pipette auf und ab, bis keine großen Gewebestücke mehr übrig sind. Filtrieren Sie dann die Zellsuspension durch einen 70-Mikrometer-Zellsiebfilter und sammeln Sie das Filtrat in einem sauberen 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Das Filtrat wird in ein neues 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen umgefüllt und 10 Minuten lang bei 300 g bei vier Grad Celsius zentrifugiert. Entsorgen Sie dann den Überstand mit einer Ein-Milliliter-Pipette. Pipettieren Sie nun die Zellsuspension 20 Mal mit 15 Millilitern HBSS auf und ab, um sie zu waschen, und zentrifugieren Sie sie bei 300 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, suspendieren Sie das Zellpellet wieder in einem Milliliter magnetisch aktiviertem Zellsortierpuffer. Zu Beginn wird ein Milliliter der vorbereiteten einzelligen Suspension in ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt und drei Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 300 g zentrifugiert. Sobald der Überstand entfernt ist, suspendieren Sie das einzellige Pellet wieder in 90 Mikrolitern magnetisch aktivierter Zellsortierung oder maximalem Puffer. Fügen Sie 10 Mikroliter CD11b- oder c-Mikrokügelchen hinzu und inkubieren Sie die Suspension 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius auf einem horizontalen Shaker. Geben Sie dann einen Milliliter maximalen Puffer direkt in das Röhrchen, um die einzellige Suspension zu waschen. Nach der Zentrifugation resuspendieren Sie das Zellpellet in maximal 500 Mikrolitern Puffer. Mit einer Ein-Milliliter-Pipette wird die resuspendierte Zellsuspension in die Sortiersäule im Magnetfeld überführt. Während sie im Magnetfeld verbleibt, waschen Sie die Säule dreimal mit 500 Mikrolitern maximalem Puffer. Entfernen Sie dann die Sortiersäule aus dem Magnetfeld. Geben Sie einen Milliliter maximalen Puffer in die Säule und drücken Sie ihn langsam mit dem Kolben durch. Sammeln Sie den Durchfluss. Säen Sie nun die ausgewählten Zellen in eine 24-Well-Platte, die ein mit Poly-L-Lysin beschichtetes Deckglas enthält. Fügen Sie 200 Mikroliter Nährmedium hinzu und inkubieren Sie 20 Minuten lang in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 95 % Sauerstoff, 5 % Kohlendioxid und 60 bis 80 % Luftfeuchtigkeit. Nehmen Sie zunächst die kultivierten Mikroglia, die aus dem Gehirngewebe von Mäusen isoliert wurden. Lokalisieren Sie die kugelförmigen Mikroglia unter einem Wassermikroskop mit dem 40x-Objektiv. Füllen Sie als Nächstes die Elektrode mit intrazellulärer Lösung und befestigen Sie sie an der Verstärkerkopfstufe des Elektrophysiologie-Setups. Üben Sie positiven Druck aus. Wechseln Sie zum 4x Objektiv und lokalisieren Sie die Elektrode. Senken Sie dann die Elektrode in die Badlösung. Stellen Sie den Verstärker auf den Spannungsklemmmodus, um den Membrantest im Badmodus durchzuführen. Wechseln Sie danach wieder zum 40x Objektiv und bewegen Sie die Elektrodenspitze näher an die Mikroglia. Üben Sie dann einen winzigen Unterdruck aus, um die Zelle zu halten. Wenn der Widerstand 100 Megaohm erreicht, wechseln Sie im Membrantest vom Bad- in den Patch-Modus. Wenn der Widerstand 300 Megaohm erreicht, lassen Sie den Unterdruck ab. Wenn der Widerstand die Bildung einer Giga-Ohm-Dichtung zwischen der Elektrode und der Mikrogliamembran anzeigt. Wechseln Sie im Membrantest vom Patch- in den Zellmodus. Wenden Sie dann einen kleinen Sog an und lösen Sie einen elektrischen Schlag aus, um die Membran zu sprengen. Wechseln Sie danach in den Spannungsklemmmodus, öffnen Sie das Aufnahmeprogramm und zeichnen Sie Kaliumströme für 200 Millisekunden auf.