Die Beurteilung Neural Stem Cell Motilität Mit einem Agarosegel-basierte Mikrofluidikvorrichtung

Hallo, ich bin Kevin hat gewonnen. Ich studiere einen Master of Engineering am Biofluids Lab der Cornell University. Und heute werde ich über die Verwendung eines agros-basierten mikrofluidischen Geräts sprechen, um die Wirkung des epidermalen Wachstumsfaktors EGF auf Maureen-Neurostammzellen zu untersuchen.

Das Gerät besteht im Wesentlichen aus drei mikrofluidischen Kanälen mit einer Breite von jeweils 150 Mikrometern. Der EGF wird in einen der Seitenkanäle gepumpt, und der Puffer wird in den anderen Seitenkanal gepumpt. Es richtet im Grunde einen statischen linearen chemischen Gradienten über den mittleren Kanal ein.

Da das EGF-Diffundieren leicht durch das Agrogel diffundiert, werden die Neuronenstammzellen im mittleren Kanal ausgesät und der Fortschritt ihrer Wanderung durch ein Mikroskop überwacht. Die Geräte bestehen also im Wesentlichen aus einer Plexiglas-Deckschicht, die alle Ein- und Auslässe für den Anschluss an die Schläuche aufweist. Und darunter befindet sich eine Agro-Gel-Membran, in der sich vier Mustergeräte befinden.

Dieser ist von einem PDMS-Abstandshalter umgeben, der eine konstante Dicke im gesamten Gerät garantiert. Das PDMS und das Gel versammeln sich auf einem Objektträger, der mit ect beschichtet ist. Dies hilft den Zellen, an dem Objektträger zu haften.

Außerdem wird die Edelstahlplatte zur Befestigung des gesamten Gerätes verwendet und wir Sam sandwichen das Gerät mit Schrauben zusammen. Die Wildtyp-Zelllinie wurde mit einem Retrovirus-Vektor transfiziert, um den Wildtyp-EGF-Rezeptor zu überexprimieren, und die Delta-Zelllinie wurde mit einer mutierten Version des EGF-Rezeptors transfiziert, die es ihr ermöglicht, ohne den EGF-Liganden konstitutiv aktiv zu sein. Okay, ich beginne damit, den Montageprozess unseres mikrofluidischen Geräts zu erklären.

Also habe ich den PDMS-Spacer zunächst um die Reliefmerkmale der Silizium-Mikrokanäle in unseren Mastern gelegt. Jetzt werde ich also 0,3 Gramm Agros abwiegen. Jetzt werde ich also 10 Millionen CO2-unabhängige Medien aufgreifen und das dem Agros hinzufügen.

Und ich werde auf und ab pipettieren, um das aros-Pulver mit den CO2-unabhängigen Medien zu vermischen. Jetzt sind wir bereit für die Mikrowelle. Wie Sie jetzt sehen können, ist das Agros jetzt verflüssigt, aber es sind noch einige Granulate übrig.

Ich werde versuchen, dies herumzuwirbeln, um das Granulat aufzulösen und die Luftblasen loszuwerden. Also gieße ich das geschmolzene Agros auf die Reliefelemente des Silikonmeisters und nehme nun einen sterilen Objektträger und lege ihn über den PDMS-Abstandhalter. Und ich habe es in einem Winkel platziert, um zu versuchen, die meisten Luftblasen im Agro-Gel herauszudrücken.

Und ich habe Druck ausgeübt und werde weiterhin Druck ausüben, bis sich die Agros-Schale verfestigt. Nach ein bis zwei Minuten ist es also erstarrt. Jetzt werde ich das überschüssige Agros von der Rutsche entfernen.

Der nächste Schritt besteht darin, den Glasschieber vorsichtig abzuschieben und schon kann dieser Glasträger montiert werden. Jetzt werde ich versuchen, das Muster aros vorsichtig auf einen Objektträger zu übertragen, den ich zuvor mit Fibronektin beschichtet habe. Grundsätzlich verwende ich diese sterile Kunststoffplatte, um das Modell Agros mit dem PDMM MS Abstandshalter abzuheben, und ich werde das Modell Agros mit den Kanälen nach unten in Richtung Schieber übertragen.

Jetzt, wo dieser fest auf dem Glasschieber sitzt, werde ich Löcher in die einzelnen Behälter stanzen, damit der Kunststoffverteiler Zugang zu den Kanälen hat. Ich mache das mit einem kleinen Locher aus Metall. Jetzt sind wir mit dem Stanzen von Löchern in das Gerät fertig.

Ich werde 500 Mikroliter CO2-unabhängiges Medium hinzufügen, um eine Austrocknung der Mikrokanäle zu verhindern, und ich werde es jetzt ein bis zwei Minuten ruhen lassen. Okay, nach ein bis zwei Minuten werde ich versuchen, das überschüssige Medium abzulassen, und jetzt richte ich die Löcher, die in das Muster Agros gestanzt sind, mit den Einlass- und Auslasslöchern des Plexiglasverteilers aus. Und wenn die Löcher ausgerichtet sind, drücke ich fest, um eine schöne Versiegelung zu bilden.

Nun lege ich den Plexiglasverteiler über die Edelstahlhalterungen und klemme das Gerät nun vorsichtig mit Schrauben zusammen. Ich achte sehr darauf, die Schrauben nicht zu fest anzuziehen, da dies die Kanäle zusammendrückt, und setze die Schrauben im Uhrzeigersinn ein, um zu verhindern, dass sich das Agros-Gel im Inneren einrastet. Ich werde eine Million Medien ziehen und diese Spritze verwenden, um das Gerät zu testen.

Und wie Sie sehen können, injiziere ich Flüssigkeit in jeden Mikrokanal und suche nach Flüssigkeit, die aus jedem Auslass austritt. Im Moment habe ich das zusammengebaute Gerät in die Klimakammer des Mikroskops gelegt. Diese wird bei 37 Grad Celsius gehalten, so dass das Gerät aufgewärmt wird und es bereit ist, wenn wir die Zellen aussäen müssen.

Und wie ihr seht, habe ich die beiden, den Schirmpumpenschlauch schon durch das Setup gefädelt. Und ich spüle gerade die Schläuche mit PBS in Vorbereitung auf unsere Experimente. Jetzt werden wir also die Schläuche einrichten.

Ich werde den Schlauch der Sonnenschirmpumpe durch die Kappen fädeln, in die bereits Löcher gestanzt sind. Und jeder Schlauch hat eine bestimmte Anzahl von Kerben, damit ich sowohl den Einlass als auch den Auslass des Schlauchs identifizieren kann. Der Schlauch mit vier Kerben darauf erhält also die 10 Nanogramm pro Mil.

Die EGF-Lösung befestigt nun den Schlauch am Gerät. Also befestige ich es an jedem Gerät, je nachdem, wie viele Kerben es hat. Es entspricht also der Lösung, die es aufgreift.

Und jetzt befestige ich den Auslassschlauch. Wir verwenden einen durchsichtigen Tigon-Schlauch, um sicherzustellen, dass das Medium tatsächlich durch den Auslassschlauch fließt und es keine Verstopfungen im Kanal gibt. Und jetzt werde ich die Sonnenschirmpumpen starten.

Jetzt beginne ich mit dem Verfahren zum Aussäen der Zellen in den mittleren Kanal. Ich beginne damit, das überschüssige Medium im Sensorkanal herauszunehmen. Jetzt werde ich mir die Zellen ansehen.

Die Zellen befinden sich bereits in CO2-unabhängigen Medien in Suspension. Und ich war verkauft, ich saß 60 m in den Einlass des Mittelkanals und ich saß 20 Mikroliter in den Auslass. Und hoffentlich werden die Zellen durch die Schwerkraft sitzen gelassen.

Und ich wiederhole diese Prozedur für die beiden anderen empfindlichen Kanäle und wir werden dies nun unter dem Mikroskop beobachten, um zu sehen, ob die Zellsitzung erfolgreich war. Jetzt haben sich die Zellen an den Objektträger geheftet und in wenigen Minuten beginnen sie, sich auszubreiten und ihre einzigartige Morphologie zu erreichen. Heute haben wir uns also mit dem Zusammenbau des eigentlichen Geräts, der Vorbereitung der Reagenzien und den Mikroskoptechniken befasst, mit denen ich die Zellmigration innerhalb des Geräts abbilde.

Zusammenfassend hoffen wir, dass dieses Gerät eine viel breitere Abdankung haben wird, insbesondere im klinischen Umfeld. Stellen Sie also die erste horizontal vor. Es zeigt die Trajektorien der C 17.2-Zellen und den vertikalen Anstieg der EGF-Konzentrationen.

Es zeigt die Trajektorien der verschiedenen Stämme der C 17.2-Zellen, die wir in unseren Experimenten mit der gleichen EGF-Konzentration verwendet haben. Die Daten der Elternzellen zeigen, dass es einen Höhepunkt der Motilität bei dem EGF-Konzentrationsgradienten von 10 Nanogramm pro Monat gibt, was darauf hindeutet, dass die Rezeptoren bei einer höheren EGF-Konzentration mit Liganden gesättigt sind. Und Wildtyp-Daten zeigen, dass es eine Zunahme der Motilität bei einer Konzentration von hundert Nanogramm pro Monat (EGF) gibt.

Dies deutet darauf hin, dass die Rezeptoren bei höheren EGF-Konzentrationen nicht gesättigt werden. Dies ist sinnvoll, da sie so konzipiert wurden, dass sie den EGF-Rezeptor überexprimieren. Schließlich deuten die Daten der Delta-Zelllinie darauf hin, dass die Motilität der Zellen in etwa unabhängig von der EGF-Konzentration ist.

Dies ist auch zu erwarten, da die mutierten EGF-Rezeptoren so konzipiert wurden, dass sie unabhängig von der Anwesenheit von EGF aktiviert werden können.