Die Beurteilung Neural Stem Cell Motilität Mit einem Agarosegel-basierte Mikrofluidikvorrichtung
11. Februar 2008
Wir zeigen, dass die Überexpression des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptoren (EGFR) die Beweglichkeit der neuralen Stammzellen (NSCs) unter Verwendung eines neuartigen Agarosegel basierten mikrofluidischen Gerät verbessert. Diese Technologie kann ohne weiteres auf andere Säugetierzellen Systeme, bei denen Zellen Quellen sind rar, wie menschliche neurale Stammzellen, und die Umdrehung um Zeit ist von entscheidender Bedeutung.
Hallo, ich bin Kevin hat gewonnen. Ich studiere einen Master of Engineering am Biofluids Lab der Cornell University. Und heute werde ich über die Verwendung eines agros-basierten mikrofluidischen Geräts sprechen, um die Wirkung des epidermalen Wachstumsfaktors EGF auf Maureen-Neurostammzellen zu untersuchen.
Das Gerät besteht im Wesentlichen aus drei mikrofluidischen Kanälen mit einer Breite von jeweils 150 Mikrometern. Der EGF wird in einen der Seitenkanäle gepumpt, und der Puffer wird in den anderen Seitenkanal gepumpt. Es richtet im Grunde einen statischen linearen chemischen Gradienten über den mittleren Kanal ein.
Da das EGF-Diffundieren leicht durch das Agrogel diffundiert, werden die Neuronenstammzellen im mittleren Kanal ausgesät und der Fortschritt ihrer Wanderung durch ein Mikroskop überwacht. Die Geräte bestehen also im Wesentlichen aus einer Plexiglas-Deckschicht, die alle Ein- und Auslässe für den Anschluss an die Schläuche aufweist. Und darunter befindet sich eine Agro-Gel-Membran, in der sich vier Mustergeräte befinden.
Dieser ist von einem PDMS-Abstandshalter umgeben, der eine konstante Dicke im gesamten Gerät garantiert. Das PDMS und das Gel versammeln sich auf einem Objektträger, der mit ect beschichtet ist. Dies hilft den Zellen, an dem Objektträger zu haften.
Außerdem wird die Edelstahlplatte zur Befestigung des gesamten Gerätes verwendet und wir Sam sandwichen das Gerät mit Schrauben zusammen. Die Wildtyp-Zelllinie wurde mit einem Retrovirus-Vektor transfiziert, um den Wildtyp-EGF-Rezeptor zu überexprimieren, und die Delta-Zelllinie wurde mit einer mutierten Version des EGF-Rezeptors transfiziert, die es ihr ermöglicht, ohne den EGF-Liganden konstitutiv aktiv zu sein. Okay, ich beginne damit, den Montageprozess unseres mikrofluidischen Geräts zu erklären.
Also habe ich den PDMS-Spacer zunächst um die Reliefmerkmale der Silizium-Mikrokanäle in unseren Mastern gelegt. Jetzt werde ich also 0,3 Gramm Agros abwiegen. Jetzt werde ich also 10 Millionen CO2-unabhängige Medien aufgreifen und das dem Agros hinzufügen.
Und ich werde auf und ab pipettieren, um das aros-Pulver mit den CO2-unabhängigen Medien zu vermischen. Jetzt sind wir bereit für die Mikrowelle. Wie Sie jetzt sehen können, ist das Agros jetzt verflüssigt, aber es sind noch einige Granulate übrig.
Ich werde versuchen, dies herumzuwirbeln, um das Granulat aufzulösen und die Luftblasen loszuwerden. Also gieße ich das geschmolzene Agros auf die Reliefelemente des Silikonmeisters und nehme nun einen sterilen Objektträger und lege ihn über den PDMS-Abstandhalter. Und ich habe es in einem Winkel platziert, um zu versuchen, die meisten Luftblasen im Agro-Gel herauszudrücken.
Und ich habe Druck ausgeübt und werde weiterhin Druck ausüben, bis sich die Agros-Schale verfestigt. Nach ein bis zwei Minuten ist es also erstarrt. Jetzt werde ich das überschüssige Agros von der Rutsche entfernen.
Der nächste Schritt besteht darin, den Glasschieber vorsichtig abzuschieben und schon kann dieser Glasträger montiert werden. Jetzt werde ich versuchen, das Muster aros vorsichtig auf einen Objektträger zu übertragen, den ich zuvor mit Fibronektin beschichtet habe. Grundsätzlich verwende ich diese sterile Kunststoffplatte, um das Modell Agros mit dem PDMM MS Abstandshalter abzuheben, und ich werde das Modell Agros mit den Kanälen nach unten in Richtung Schieber übertragen.
Jetzt, wo dieser fest auf dem Glasschieber sitzt, werde ich Löcher in die einzelnen Behälter stanzen, damit der Kunststoffverteiler Zugang zu den Kanälen hat. Ich mache das mit einem kleinen Locher aus Metall. Jetzt sind wir mit dem Stanzen von Löchern in das Gerät fertig.
Ich werde 500 Mikroliter CO2-unabhängiges Medium hinzufügen, um eine Austrocknung der Mikrokanäle zu verhindern, und ich werde es jetzt ein bis zwei Minuten ruhen lassen. Okay, nach ein bis zwei Minuten werde ich versuchen, das überschüssige Medium abzulassen, und jetzt richte ich die Löcher, die in das Muster Agros gestanzt sind, mit den Einlass- und Auslasslöchern des Plexiglasverteilers aus. Und wenn die Löcher ausgerichtet sind, drücke ich fest, um eine schöne Versiegelung zu bilden.
Nun lege ich den Plexiglasverteiler über die Edelstahlhalterungen und klemme das Gerät nun vorsichtig mit Schrauben zusammen. Ich achte sehr darauf, die Schrauben nicht zu fest anzuziehen, da dies die Kanäle zusammendrückt, und setze die Schrauben im Uhrzeigersinn ein, um zu verhindern, dass sich das Agros-Gel im Inneren einrastet. Ich werde eine Million Medien ziehen und diese Spritze verwenden, um das Gerät zu testen.
Und wie Sie sehen können, injiziere ich Flüssigkeit in jeden Mikrokanal und suche nach Flüssigkeit, die aus jedem Auslass austritt. Im Moment habe ich das zusammengebaute Gerät in die Klimakammer des Mikroskops gelegt. Diese wird bei 37 Grad Celsius gehalten, so dass das Gerät aufgewärmt wird und es bereit ist, wenn wir die Zellen aussäen müssen.
Und wie ihr seht, habe ich die beiden, den Schirmpumpenschlauch schon durch das Setup gefädelt. Und ich spüle gerade die Schläuche mit PBS in Vorbereitung auf unsere Experimente. Jetzt werden wir also die Schläuche einrichten.
Ich werde den Schlauch der Sonnenschirmpumpe durch die Kappen fädeln, in die bereits Löcher gestanzt sind. Und jeder Schlauch hat eine bestimmte Anzahl von Kerben, damit ich sowohl den Einlass als auch den Auslass des Schlauchs identifizieren kann. Der Schlauch mit vier Kerben darauf erhält also die 10 Nanogramm pro Mil.
Die EGF-Lösung befestigt nun den Schlauch am Gerät. Also befestige ich es an jedem Gerät, je nachdem, wie viele Kerben es hat. Es entspricht also der Lösung, die es aufgreift.
Und jetzt befestige ich den Auslassschlauch. Wir verwenden einen durchsichtigen Tigon-Schlauch, um sicherzustellen, dass das Medium tatsächlich durch den Auslassschlauch fließt und es keine Verstopfungen im Kanal gibt. Und jetzt werde ich die Sonnenschirmpumpen starten.
Jetzt beginne ich mit dem Verfahren zum Aussäen der Zellen in den mittleren Kanal. Ich beginne damit, das überschüssige Medium im Sensorkanal herauszunehmen. Jetzt werde ich mir die Zellen ansehen.
Die Zellen befinden sich bereits in CO2-unabhängigen Medien in Suspension. Und ich war verkauft, ich saß 60 m in den Einlass des Mittelkanals und ich saß 20 Mikroliter in den Auslass. Und hoffentlich werden die Zellen durch die Schwerkraft sitzen gelassen.
Und ich wiederhole diese Prozedur für die beiden anderen empfindlichen Kanäle und wir werden dies nun unter dem Mikroskop beobachten, um zu sehen, ob die Zellsitzung erfolgreich war. Jetzt haben sich die Zellen an den Objektträger geheftet und in wenigen Minuten beginnen sie, sich auszubreiten und ihre einzigartige Morphologie zu erreichen. Heute haben wir uns also mit dem Zusammenbau des eigentlichen Geräts, der Vorbereitung der Reagenzien und den Mikroskoptechniken befasst, mit denen ich die Zellmigration innerhalb des Geräts abbilde.
Zusammenfassend hoffen wir, dass dieses Gerät eine viel breitere Abdankung haben wird, insbesondere im klinischen Umfeld. Stellen Sie also die erste horizontal vor. Es zeigt die Trajektorien der C 17.2-Zellen und den vertikalen Anstieg der EGF-Konzentrationen.
Es zeigt die Trajektorien der verschiedenen Stämme der C 17.2-Zellen, die wir in unseren Experimenten mit der gleichen EGF-Konzentration verwendet haben. Die Daten der Elternzellen zeigen, dass es einen Höhepunkt der Motilität bei dem EGF-Konzentrationsgradienten von 10 Nanogramm pro Monat gibt, was darauf hindeutet, dass die Rezeptoren bei einer höheren EGF-Konzentration mit Liganden gesättigt sind. Und Wildtyp-Daten zeigen, dass es eine Zunahme der Motilität bei einer Konzentration von hundert Nanogramm pro Monat (EGF) gibt.
Dies deutet darauf hin, dass die Rezeptoren bei höheren EGF-Konzentrationen nicht gesättigt werden. Dies ist sinnvoll, da sie so konzipiert wurden, dass sie den EGF-Rezeptor überexprimieren. Schließlich deuten die Daten der Delta-Zelllinie darauf hin, dass die Motilität der Zellen in etwa unabhängig von der EGF-Konzentration ist.
Dies ist auch zu erwarten, da die mutierten EGF-Rezeptoren so konzipiert wurden, dass sie unabhängig von der Anwesenheit von EGF aktiviert werden können.
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Übersicht
Diese Studie zeigt, dass die Überexpression von epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptoren (EGFR) die Motilität von neuronalen Stammzellen (NSCs) mithilfe einer neuartigen, auf Agarosegel basierenden mikrofluidischen Vorrichtung erhöht. Diese Technologie ist auf andere Säugetierzellsysteme übertragbar, bei denen Zellquellen knapp sind.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Mikrofluidik
Hintergrund
- Der epidermale Wachstumsfaktor (EGF) beeinflusst das Zellverhalten.
- Neurale Stammzellen (NSCs) sind entscheidend für die neuronale Regeneration.
- Mikrofluidische Geräte ermöglichen eine präzise Steuerung der zellulären Umgebungen.
- Das Verständnis der NSC-Motilität kann in der regenerativen Medizin hilfreich sein.
Zweck der Studie
- Untersuchung der Wirkung von EGF auf die Motilität von NSC.
- Entwicklung einer mikrofluidischen Vorrichtung zur Untersuchung zellulärer Reaktionen.
- Gewinnung von Erkenntnissen zum Verhalten von NSC unter kontrollierten Bedingungen.
Verwendete Methoden
- Entwicklung einer auf Agarosegel basierenden mikrofluidischen Vorrichtung.
- Erzeugung eines statischen linearen chemischen Gradienten von EGF.
- Beobachtung der NSC-Motilität als Reaktion auf EGF-Exposition.
- Nutzung mikrofluidischer Kanäle zur präzisen Kontrolle von Flüssigkeiten.
Hauptergebnisse
- Die Überexpression von EGFR erhöht die Motilität von NSC signifikant.
- Die mikrofluidische Vorrichtung erzeugt effektiv chemische Gradienten.
- Die Ergebnisse deuten auf mögliche Anwendungen in regenerativen Therapien hin.
- Die Befunde können auf humane neurale Stammzellen übertragen werden.
Schlussfolgerungen
- EGF spielt eine entscheidende Rolle bei der NSC-Motilität.
- Das entwickelte Gerät ist ein wertvolles Werkzeug für zelluläre Untersuchungen.
- Zukünftige Forschungsarbeiten können auf andere Zelltypen und Bedingungen ausgeweitet werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Motilität neuraler Stammzellen dient als prädiktiver Biomarker für das Tumorbildungspotential und Entwicklungserkrankungen, weshalb ihre quantitative Bewertung bei der Validierung von Zielstrukturen in einem frühen Stadium entscheidend ist. Die auf Agarosegel basierende mikrofluidische Plattform ermöglicht reproduzierbare, gradientengesteuerte Motilitätsassays, die eine mechanistische Risikominderung bei EGFR-Signalwegsmodulatoren unterstützen. Dieser Ansatz erhöht die Zuverlässigkeit bei der Identifizierung von Leitstrukturen, indem er eine Überexpression von Rezeptoren mit funktionalen phänotypischen Ausgaben in einem krankheitsrelevanten System verknüpft.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung der EGFR-abhängigen Motilität als funktionellen Endpunkt für die Zielstrukturenbindung in neuronalen Stammzellen.
- Operationaler Wert: Bietet ein kontrolliertes Mikromilieu, um die Effekte der EGFR-Signalübertragung von störenden Variablen in Motilitätsassays zu isolieren.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt das phänotypische Screening von EGFR-Modulatoren durch Quantifizierung von Motilitätsänderungen unter definierten chemischen Gradienten.
Screening und Assay-Entwicklung
- Testbereitschaft: Erzeugt quantitative, optische Beweglichkeitsmessungen, die für die Analyse mit hohem Informationsgehalt und die Wirkstoff-Screening geeignet sind.
- Reproduzierbarkeit: Die Herstellung von Agarose-Gelen gewährleistet eine konsistente Kanalgeometrie und Diffusionseigenschaften über alle Wiederholungen hinweg.
- Skalierbarkeit: Die parallele Anordnung mehrerer Geräte in einer einzigen Gelmembran ermöglicht die gleichzeitige Prüfung mehrerer Bedingungen oder Zelllinien.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Verbindet die Motilität von NSC mit der Bewertung tumorigener Faktoren und unterstützt präklinische Modelle der Invasion von bösartigen Stammzellen des Gehirns.
- Mechanistische Entlastung: Klärt, ob eine Überexpression von EGFR eine ligandenunabhängige Motilität verursacht, und liefert damit Grundlagen für die Auswahl von Zielstrukturen für inhibitorische Strategien.
- Translationale Kontinuität: Ermöglicht den Vergleich von Wildtyp-, überexprimierten und konstitutiv aktiven EGFR-Varianten, um klinische Ansprechmodelle vorherzusagen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Das Gerät fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Testung von Zielhypothesen bis hin zur Optimierung von Wirkstoffkandidaten ein und liefert beweglichkeitsbasierte phänotypische Daten, die vor der präklinischen Investition über Go/No-Go-Entscheidungen informieren.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung zur Rolle des EGFR bei der NSC-Motilität durch präzise Gradientenkontrolle und Echtzeit-Bildgebung.
- Screening: Liefert standardisierte, quantitative Motilitätsparameter, die den Vergleich von EGFR-modulierenden Substanzen oder genetischen Varianten ermöglichen.
- Analytik: Erzeugt auf Trajektorien basierende Metriken, die den statistischen Vergleich der Motilität unter verschiedenen Bedingungen und in verschiedenen Zelllinien erleichtern.
- Translationale Forschung: Verbindet in-vitro-Motilitätsbefunde mit pathophysiologischer Relevanz in Modellen der neuronalen Entwicklung und von Hirntumoren.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Die Agarosegel-Plattform ist auf andere Säugetierzelltypen übertragbar und unterstützt die standardisierte Anwendung in projektenübergreifenden, motilitätsbasierten Assays.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert die mechanistische Unklarheit bei der EGFR-Signalübertragung, indem der Rezeptorzustand mit funktionellen Motilitätsphänotypen verknüpft wird.
- Operativer Wert: Stellt die Reproduzierbarkeit des Assays sicher, indem standardisierte Gele hergestellt und Gradienten über eine Seitenkanal-Perfusion erzeugt werden.
- Strategischer Wert: Verbessert die Priorisierung von Zielstrukturen, indem funktionelle Validierung über Bindungs- oder Expressionsassays hinaus bereitgestellt wird.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Weiterentwicklung von EGFR-gerichteten Kandidaten auf Grundlage einer motilitätsgetriebenen phänotypischen Entschärfung von Risiken.
Durchführungsaspekte
- Setzt Fachkenntnisse in der Montage von Mikrofluidiksystemen, im Umgang mit Agarosegel und in der Live-Cell-Bildgebung unter kontrollierter Perfusion voraus.
- Hängt von dem Zugang zu Perfusionssystemen, Umweltkammern und inversen Mikroskopen für die zeitraffende Verfolgung der Zellmotilität ab.
- Erfordert die Standardisierung der Zellansaatdichte und der Geletstärke, um reproduzierbare Diffusionsgradienten und Zelladhäsion zu gewährleisten.
- Beinhaltet Anpassungen für verschiedene Zelltypen, abhängig von deren Adhäsionseigenschaften und Beweglichkeitsverhalten auf Fibronectin-beschichteten Oberflächen.
- Ist durch die optische Durchgängigkeit der Gelmatrix und mögliche Autofluoreszenz eingeschränkt, die bestimmte fluoreszenzbasierte Messungen beeinträchtigen kann.
