Evaluation of Cancer Stem Cell Migration Mit Abschottung Mikrofluidiksysteme und Live Cell Imaging

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Migration von Krebszellen durch ein kompartimentierendes mikrofluidisches Gerät visuell zu untersuchen und zu charakterisieren. Dies wird erreicht, indem zunächst bereits vorhandene Neurosphären von Hirntumor-Stammzellen dissoziiert werden, die in serumfreiem Medium gezüchtet werden. Der zweite Schritt besteht in der Herstellung eines zweischichtigen SU-Acht-Masters unter Verwendung des Softlithographie-Stempels A-P-D-M-S, der ein Kompartimentierungsdesign aufweist.

Als nächstes bauen Sie das mikrofluidische Gerät zusammen und beladen es mit Hirntumor-Stammzellen. Schließlich wird die Langzeit-Zeitraffer-Bildgebung der Migration von Hirntumor-Stammzellen mit einem mikroskopischen All-in-One-System durchgeführt. Letztendlich zeigen die Ergebnisse, dass Hirntumor-Stammzellen während ihrer Wanderung durch extrem enge Räume eine rotierende Abfolge morphologischer Stadien aufweisen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Massen wie der Transwell-Boyton-Kammer besteht darin, dass Mikrogeräte eine visuelle Inspektion des Migrationsprozesses, die kontrollierte Platzierung von Zellen und die präzise Abgabe von Faktoren ermöglichen. Daher zeichnet sich die Mikroforic-Technologie durch eine zuverlässige, effiziente und kostengünstige Einzelzellauswahl und -navigation aus. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie von Krebsmetastasen und -rezidiven, da die Einzelzellanalyse von hochwandernden Zellen potenzielle zukünftige chemotherapeutische Ziele identifizieren kann.

Obwohl diese Methode Einblicke in das Migrationsverhalten des Krebssystems geben kann, kann sie auch auf andere Systeme wie die Embryonalentwicklung, Immunantworten, Wundheilung und Organregeneration angewendet werden. Beginnend mit der Zellsuspension von BTSC-abgeleiteten Neuros-Speeren. Poolen Sie die Zellen in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei 900 U/min, aber nicht schneller.

Aspirieren Sie das Super Natin. Lassen Sie dann die Neurosphären lockern, indem Sie sie fünf bis 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in 0,5 Milliliter vorwarmem Accutane inkubieren. Nach der Inkubation die Zellen mit 10 bis 20 sanften Zügen einer P 100-Pipette mechanisch aufbrechen.

Geben Sie dann 1,5 Milliliter Stammzellmedium hinzu, um die Accutane-Zentrifuge zu neutralisieren, die Zellsuspension bei 1300 U/min für fünf Minuten und resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter Stammzellmedium. Überprüfen Sie die Zelldichte mit einem Hämozytometer und stellen Sie die Dichte auf 20.000 Zellen pro Mikroliter ein. Um mit der Herstellung des SU eight Masters zu beginnen, bereiten Sie zwei Fotomasken mit Adobe Illustrator und Laserdruck-Diafolie mit integriertem Image Setter vor.

Die erste Schicht der Fotomaske besteht aus zwei Passermarken und einem Array von Mikrokanälen, und die zweite Schicht der Fotomaske hat die Sitz- und Empfangskammern. Reinigen Sie beide Maskenschichten mit Isopropanol und lassen Sie sie an der Luft trocknen. Nun wird ein Griffwafer mit drei Mikrometern dickem SU-Acht-Fotolack geschleudert, gefolgt von einem weichen Backen.

Belichten Sie dann mit der ersten Schicht der Fotomaske in engem Kontakt mit UV-Strahlung, belichten Sie das Foto, resistieren Sie es und lassen Sie es aushärten. Dann nachbacken und die ausgehärtete Waffel entwickeln. Decken Sie die Markierungsbereiche des Griffwafers mit Klebeband ab.

Anschließend wird der Wafer mit einem 250 Mikrometer dicken Fotolack geschleudert. Ziehen Sie anschließend das Klebeband ab, um die Markierungen zum Ausrichten freizulegen. Platzieren Sie die zweite Schicht Fotolack und richten Sie die Passermarken aus.

Dann die Fotomaske der zweiten Schicht UV-belichten und aushärten, gefolgt vom Nachbacken und Entwickeln. Isieren Sie nun den SU eight Master durch Bedampfung, um die Klebrigkeit der Oberfläche zu reduzieren. Legen Sie die Wafer mindestens eine Stunde lang unter Vakuum in ein Trockenmittel mit mehreren Tropfen Trichlorklinelösung.

Der Master ist dann einsatzbereit, um PDMS mit dem Master zu formen. Beginnen Sie damit, die Prepolymerbasis gründlich mit der Aushärtung im Verhältnis 10 zu eins zu mischen. Geben Sie dann die Mischung zur Vakuumentgasung in ein Trockenmittel, bis keine Luftblase mehr zu sehen ist.

Gießen Sie die Mischung auf die Maske und entgasen Sie sie erneut. Wenn neue Luftblasen eingebracht werden, härten Sie die Form auf einer ebenen Heizplatte zwei Stunden lang bei 90 Grad Celsius aus. Nachdem es auf Raumtemperatur abgekühlt ist, lösen Sie den PDMS-Stempel vorsichtig.

So werden die Kultivierungskanäle in PDMS graviert und sind bereit für die Montage des mikrofluidischen Geräts. Der Master ist wiederverwendbar zum Formen, bis er gerissen oder abgenutzt ist. Wenn der Master klebrig wird, kann die Antihaftbeschichtung erneut aufgetragen werden.

Beginnen Sie damit, Ein- und Auslässe in das mikrofluidische Gerät durch den PDMS-Stempel zu machen. Reinigen Sie den PDMS-Stempel mit einer Biopsielochpunktion, indem Sie ihn 30 Minuten lang in 70%igem Ethanol einweichen und dann 10 Minuten lang mit deionisiertem Wasser abspülen. Sterilisieren und vervollständigen Sie die Vernetzungsreaktionen des PDMS-Stempels durch Autoklavieren.

Legen Sie nun den PDMS-Stempel auf einen mit Poly-L-Lysin beschichteten Glasdeckglas. Das Gerät wird dann mit Laminat beschichtet, indem die Kammern durch die Reservoireinlässe mit Laminatlösung gefüllt und über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubiert werden. Saugen Sie am nächsten Tag das Laminat aus dem Gerät ab.

Waschen Sie dann das Gerät, indem Sie es zweimal mit Stammzellmedium fluten. Laden Sie nun 11 Mikroliter dissoziierte Zellen in eines der Seeding-Reservoirs. Verwenden Sie bei Bedarf eine Vakuumaspiration, um die Zellen in die Kammer zu drücken. Laden Sie dann weitere sieben Mikroliter Zellen in das angrenzende Sitzreservoir.

Nach fünf Minuten werden die Sitz- und Annahmebecken mit Medien geflutet. Legen Sie nun eine 0,5 bis einen Millimeter dicke sterile PDMS-Folie auf das Gerät. Die natürliche Oberflächenhaftung von PDMS mit sich selbst versiegelt das Gerät, sobald es versiegelt ist, ist es bereit für den Transport, die Inkubation und die mikroskopische Bildgebung.

Equilibrieren Sie das Biot, IM, indem Sie es 45 Minuten lang laufen lassen. Um die Temperatur, Feuchtigkeit und Luftzufuhr zu stabilisieren, geben Sie mehrere Schalen Wasser in die Probenkammer, um die richtige Luftfeuchtigkeit zu erhalten. Laden Sie das vorbereitete Gerät in die Probenkammer des Mikroskops.

Zentrieren Sie das Gerät mit einer Mikropinzette. Stellen Sie nun mit der Biot-Software die Fokuspositionspunkte und Zeitpunkte ein und starten Sie ggf. die Zeitrafferaufnahmen. Ersetzen Sie nach fünf Tagen in der Kultur die Nährmedien.

Die im Gerät geseedeten BTCs wurden kontinuierlich per Phasenbild aufgezeichnet. Fünf Tage lang blieben die spindelförmigen Zellen in der Sitzkammer im Vormigrationsstadium. Als sie sich dem Eingang des Mikrokanals näherten, dehnten sich einige Zellen aus und erzeugten adhäsive Vorsprünge.

Nur eine Zelle war in der Lage, den Eingang zu besetzen und die Migrationsrichtung zu erkunden. Sobald die Zelle die Migrationsrichtung bestimmt hatte, fuhr sie mit gleichmäßig hoher Geschwindigkeit durch den gesamten Mikrokanal. Am Ende des Mikrokanals erkundete die Zelle den offenen Raum der Empfangskammer, bevor sie schließlich in diese eindrang.

Bei der Beobachtung der Zellen mit zwei Sekunden Bildgebungsintervallen schien die Migrationsleistung hauptsächlich durch eine Babbing-Aktivität erzeugt zu werden, ähnlich der einer OID-Zelle. Beim Versuch des Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass das Design des Geräts so flexibel ist, dass die Mikrokanalabmessungen manipuliert werden können, um einen gewünschten Grad der Zellmigration zu erreichen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein einzigartiges kompartimentierendes mikrofluidisches Gerät erstellen, das für die Kultivierung Ihrer interessierenden Zellen geeignet ist, und dann eine Langzeit-Zeitraffer-Bildgebung durchführen, um die Migrationseigenschaften dieser Zellen qualitativ und quantitativ zu definieren. Nach diesem Verfahren.

Andere Methoden wie Next Generation Sequencing oder DNA-Microarray können eingesetzt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z.B. wie genetisch unterschiedlich die hochwandernden Krebszellen sind.