Automatisierte Hochdurchsatz-Multiplex-Immunfluoreszenz-Assays für die translationale Forschung

Wir entwickeln Kits für schnelle und empfindliche Multiplex-Immunfluoreszenz-Assays. Ziel ist es, Forschern dabei zu helfen, verschiedene Zelltypen zu profilieren, die in FFPE-Gewebe vorkommen

Die Immunfluoreszenz wird üblicherweise mit Farbstoff- oder Peroxidase-markierten Sekundärantikörpern durchgeführt. Die Immunhistochemie neigt dazu, Low Plex zu sein. Farbstoffmarkierte Sekundärantikörper leiden unter einem geringeren Signal. Tyramid-Signalamplifikationsassays sind mühsam zu optimieren und dauern mehrere Stunden bis mehrere Tage.

Die Marker der Assays sind voroptimiert und deutlich schneller als andere Techniken. Das Stehen von vier Markern dauert weniger als acht Stunden, und etwa drei weitere Stunden für jeweils vier weitere Biomarker.

Die Möglichkeit, die Multiplex-Immunfluoreszenz schneller durchzuführen, wird eine breitere Anwendung der räumlichen Proteomik ermöglichen und die Barriere für das Verständnis der räumlichen Textur von Gewebe verringern.

[Erzähler] Tauen Sie zunächst alle Reagenzien des Kits bei Raumtemperatur auf. Lagern Sie die Antikörperkonjugate, das Amplifikationsenzym, den Austauschinitiator und den Austauschneutralisator bis zur Verwendung bei minus 20 Grad Celsius. Vortex, ein aufgetautes Antikörperverdünnungsmittel. Pipettieren Sie das Antikörperverdünnungsmittel in einen Behälter. Kurz zentrifugieren und alle Antikörper in den Behälter für Antikörper-Färbelösung 1 geben. Geben Sie das mitgelieferte Antikörperverdünnungsmittel in einer Verdünnung von 1 bis 100 zu. Mischen Sie die Lösung dann mit einer Pipette vorsichtig und vermeiden Sie ein Vortexen. Die vor der Amplifikation gemischte Lösung nach dem Auftauen vortexen, um sie gründlich zu mischen. Gib dann die Lösung in den jeweiligen Mischbehälter. Den Amplifikationspuffer vortexen und pipettieren, das Amplifikationsenzym mischen. Verdünnen Sie das Amplifikationsenzym im Verhältnis 1 zu 10 im Amplifikationspuffer, um den Amplifikationspuffer herzustellen. Vorsichtig durch Pipettieren mischen, dabei Wirbelbildung vermeiden. Dann die mitgelieferte nukleare Gegenfärbelösung vortexen und zentrifugieren und 1 bis 100 in Reinstwasser verdünnen. Als nächstes verdünnen Sie 1 Lösung mit Fluoreszenzsonden im Verhältnis 1 zu 20 in Sondenpuffer. Führen Sie den vollständigen Reagenzstab in das Gerät ein, um die Messung des Reagenzvolumens zu ermöglichen. Navigieren Sie zur Registerkarte "Objektträger-Setup" oben in der Auto-Stainer-Software, sobald alle Reagenzien vorbereitet sind. Klicken Sie auf die Schaltfläche Studie hinzufügen und geben Sie die Studien-ID, den Namen der Studie und alle Studienkommentare nach Bedarf ein. Wählen Sie unter Dosiervolumen die Option 150 Mikroliter aus und wählen Sie als Zubereitungsmethode *Entwachsung in 4 Schritten. Wenn es in der Dropdown-Liste nicht verfügbar ist, öffnen Sie das Menü "Protokoll-Setup", markieren Sie das bevorzugte Kontrollkästchen und klicken Sie auf OK. Nachdem die Studie erstellt wurde, klicken Sie auf die Schaltfläche Folie hinzufügen, die sich auf der rechten Seite des Bildschirms Folieneinrichtung befindet. Geben Sie unter Folienkommentare einen eindeutigen Namen für die Folie ein. Legen Sie den Gewebetyp auf Gewebe im entsprechenden Feld testen fest. Wählen Sie dann 150 Mikroliter für das Dosiervolumen und stellen Sie den Färbemodus in der linken Dropdown-Liste auf Single und in der rechten Dropdown-Liste auf Routine ein. Wählen Sie unter Process (Prozess) die Option IHC aus, und legen Sie den Marker auf Antikörperfärbelösung fest. Wählen Sie im Abschnitt Protokolle des Fensters Folie hinzufügen die Option Färbeassay 1 für die Färbung, *Entwachsung 4 Schritte für die Vorbereitung und *HIER 20 Minuten mit ER2 für HIER aus. Lassen Sie das Enzymprotokoll auf den Sternstrich eingestellt, und klicken Sie auf Folie hinzufügen, wenn alle Felder ausgefüllt sind. Nachdem Sie alle Objektträger hinzugefügt haben, schließen Sie das Fenster Folie hinzufügen, drucken Sie die Objektträgerbeschriftungen, indem Sie sie jeweils an den entsprechenden Gewebeabschnitt anbringen. Legen Sie jeden beschrifteten Objektträger auf das Tablett und legen Sie Abdeckkacheln auf jeden Gewebeabschnitt. Setzen Sie das Objektträgertablett in das Gerät ein und wählen Sie den entsprechenden Auto-Stainer auf der rechten Seite des Software-Bildschirms aus. Vergewissern Sie sich, dass alle drei Objektträgerschalen und alle Reagenzieninformationen, einschließlich Bulk- und vorbereiteter Reagenzien, sichtbar sind. Prüfen Sie, ob die Behälter für Schüttgutreagenzien ausreichend gefüllt sind und ob die Abfallbehälter genügend Volumen haben, um den Lauf abzuschließen. Drücken Sie dann die Play-Taste, um den Färbelauf zu starten und sicherzustellen, dass die Objektträger nach Abschluss des Vorgangs rechtzeitig aus dem automatischen Färbegerät entfernt werden. Legen Sie fleckige Dias in den PBS-Puffer und bringen Sie Deckgläser mit dem Eindeckmedium an. Bilden Sie die Objektträger mit einem Fluoreszenzmikroskop oder einem Scanner für ganze Objektträger mit Filtern ab, die mit den Assay-Farbstoffen kompatibel sind. Tauen Sie den Austauschpuffer für den Austauschassay bei Raumtemperatur auf. Bewahren Sie den Austauschneutralisator und den Austauschinitiator bis zur Verwendung bei minus 20 Grad Celsius auf. Bereiten Sie zwei Reagenzientitrationsbehälter vor und entnehmen Sie das Nachweiskit für die Verwendung während des Austauschprotokolls. Wirbeln Sie den Austauschpuffer ein. Und pipettieren Sie den Austauschinitiator. Bereiten Sie die Austauschlösung in dem dafür vorgesehenen Behälter vor, indem Sie die erforderlichen Volumina des Austauschinitiators und des Austauschpuffers mischen. Mischen Sie den Inhalt nur durch Pipettieren. Kombinieren Sie nun die Fluoreszenzsonden 2 Lösung mit dem verdünnten Austauschpuffer in dem jeweiligen Behälter. Nur der Sondenpuffer und die Fluoreszenzsonde werden mit einem Vortex verzerrt und die endgültige Lösung mit einer Pipette vermischt. Legen Sie den vollständigen Reagenzstab mit allen vorbereiteten Reagenzien auf den Autostainer. Lassen Sie das Gerät einen Tauchtest an allen Reagenzien durchführen. Nachdem Sie die Folien hinzugefügt haben, setzen Sie die Markierung auf *Negativ. Wählen Sie für Vorbereitung, HIER und Enzym die Option Sternchen Bindestrich aus, da für das Austauschprotokoll keine Entparaffinierung oder Antigenentnahme erforderlich ist. Klicken Sie auf Folie hinzufügen, wenn Sie fertig sind. Nachdem Sie alle Objektträger hinzugefügt haben, schließen Sie das Fenster Folie hinzufügen, und drucken Sie die Objektträgerbeschriftungen, die an den entsprechenden Gewebeabschnitten angebracht werden sollen. Legen Sie jeden Objektträger auf das Tablett und legen Sie eine Abdeckplatte über jeden Gewebeabschnitt, bevor Sie das Tablett in den automatischen Färber legen. Drücken Sie nun die Play-Taste, um den Lauf zu starten. Bilder eines Gewebe-Microarray-Kerns, der über zwei Färberunden mit einem Acht-Plex-Immunfluoreszenzprotokoll aufgenommen wurde, zeigten in jeder Runde unterschiedliche Immunmarker, wobei die erfolgreiche Bildkoregistrierung beide Runden zu einem einheitlichen Komposit kombinierte. Die Bildgebung des gesamten Objektträgers von kolorektalem Karzinomgewebe ermöglichte die Identifizierung von Immunphänotypen auf der Grundlage der Kolokalisation von Markern, einschließlich regulatorischer T-Zellen, erschöpfter T-Zellen und immunsuppressiver Makrophagen. Die Immunfluoreszenzfärbung zeigte eine Co-Expression von CD3, CD4 und FoxP3 in regulatorischen T-Zellen. PD1 und PDL1 in Tumor- und Stromazellen. CD3, CD8 und PD1 in erschöpften zytotoxischen T-Zellen. Und CD 68 und PDL1 in immunsuppressiven Makrophagen. Der Vergleich der Immunhistochemie mit einem einzelnen Marker und der Immunfluoreszenz mit einem oder multiplex bestätigte die qualitative Übereinstimmung der Färbemuster über alle Marker hinweg. Die serielle Schnittfärbung über verschiedene Gewebetypen hinweg bestätigte konsistente Expressionsmuster von Immunmarkern mit repräsentativen Gewebekernen, was eine erfolgreiche Färbung und minimale Variabilität zeigte. Mandelschnitte, die in sechs seriellen Objektträgern für CD8 gefärbt wurden, zeigten eine hohe Reproduzierbarkeit mit nahezu identischer Signalverteilung über alle Bilder. Die Quantifizierung der markerpositiven Zelldichten über alle Gewebetypen hinweg zeigte die höchsten Dichten in Mandeln und Lymphknoten und die niedrigsten in Melanomen und Dickdarm.