Name: Automatisierte Hochdurchsatz-Multiplex-Immunfluoreszenz-Assays für die translationale Forschung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Lernen Sie automatisierte Hochdurchsatz-Multiplex-Immunfluoreszenz-Assays für die translationale Forschung. Diese Methode ermöglicht räumliche Proteomik mit hoher Reproduzierbarkeit an FFPE-Geweben.

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<ol><li>McGinnis, L. M., Ibarra-Lopez, V., Rost, S., Ziai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+research+applications+of+multiplexed+immunohistochemistry+and+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Clinical and research applications of multiplexed immunohistochemistry and in situ hybridization.</a> J Pathol. 254 (4), 405-417 (2021).</li>
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Die hochmultiplexierte Immunfluoreszenz (mIF) ist eine fortschrittliche Technik, die den Bereich der Gewebeanalytik revolutioniert, indem sie die gleichzeitige Visualisierung mehrerer Protein-Biomarker innerhalb eines einzigen Gewebeabschnitts ermöglicht 1,2. Diese Fähigkeit bietet ein beispielloses Maß an Detailgenauigkeit und räumlicher Auflösung, was oft entscheidend für das Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Zelltypen mit komplexen Morphologien innerhalb der Gewebemikroumgebung über mehrere räumliche Skalen hinweg ist3. Die Technik ist besonders wertvoll in der onkologischen Forschung, wo sie zur Co-Lokalisierung von Tumor-Biomarkern, Protein-Wirkstoffzielen, dem lokalen Immun- und Checkpoint-Status, den Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Zelltypen und sogar den subzellulären Kolokalisationsmustern im Zusammenhang mit dem Arzneimittelstoffwechsel im Gewebe verwendet werdenkann 4,5,6.
Trotz ihres Potenzials stehen die meisten mIF-Technologien noch vor großen Herausforderungen, insbesondere wenn es darum geht, Empfindlichkeit und Durchsatz mit Multiplexing-Funktionen in Einklang zu bringen. Diese Einschränkung ist besonders wichtig für den Nachweis klinischer Biomarker, die eine sehr geringe Expression aufweisen können, wie z. B. HER2 und PD-L1 7,8,9. Um zu verstehen, warum das so ist, ist es wichtig, andere Modalitäten von mIF zu verstehen. Diese traditionellen Methoden haben den Weg für ausgefeiltere mIF-Plattformen geebnet, aber sie haben ihre eigenen Vorteile und Einschränkungen.
Bei der direkten Immunfluoreszenz (DIF) werden Antikörper verwendet, die direkt an Fluorophore oder an ein Oligonukleotid konjugiert sind, das in der Lage ist, Fluorophore zu rekrutieren10. Diese Methode ist einfach zu multiplexen, leidet jedoch unter einer geringeren Empfindlichkeit und Schwierigkeiten bei der Auflösung von Signalen aus dem Gewebehintergrund oder Färbeartefakten.
Bei der indirekten Immunfluoreszenz (IIF) wird ein Sekundärantikörper verwendet, der an den Primärantikörper bindet. Dies hat das Signal im Vergleich zu primärbasiertem DIF erhöht. In Kombination mit verbesserten Flusszellendesigns kann die sequentielle IIF bis zu 40 Biomarker in einem Assay nachweisen 2,11. Diese leiden jedoch immer noch unter einem relativen Mangel an Sensitivität im Vergleich zu enzymbasierten Strategien zur Signalamplifikation, wie sie in der Immunhistochemie (IHC) zu finden sind.
Enzymkatalyse-basierte Immunfluoreszenz wird am häufigsten bei IHC-Methoden beobachtet, bei denen Meerrettichperoxidase (HRP) für die chromogene (DAB) oder fluoreszierende Farbstoffabscheidung (z. B. Tyramid-Signalamplifikation (TSA)) verwendet wird. Da diese Assays auf demselben katalytischen Enzym basieren, ist ihre Nachweisempfindlichkeit ähnlich, so dass multispektrale TSA-basierte mIF-Assays für klinische Anwendungen geeignet sind 2,12. Der Vorteil der DNA-basierten Signalverstärkung ist der hohe Grad an Multiplexing, der bei gleichzeitiger Beibehaltung einer hervorragenden Signalverstärkung und Modularität möglich ist. Im Gegensatz dazu sind HRP-basierte Methoden weniger modular und schwer zu optimieren, so dass zusätzliche Panelentwicklungs- und Testzyklen erforderlich sind.
DNA-Barcoded-Antikörper-Immunfluoreszenz Der hier gezeigte mIF-Assay verwendet eine DNA-Polymerase zur gleichzeitigen Amplifikation von DNA-barcodierten Antikörpern, gefolgt von Zyklen der Reportersondenfärbung und -entfärbung mit vier fluoreszierenden Oligonukleotiden pro Bildgebungsrunde (Abbildung 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67584/67584fig01.jpg"> 
Abbildung 1: Grafische Darstellung des Multiplex-Immunfluoreszenz-Assay-Protokolls. Barcode-konjugierte Antikörper werden in einem einzigen Schritt hinzugefügt und die Barcodes gleichzeitig amplifiziert. In jedem Zyklus werden Gruppen von vier Fluoreszenzsonden hinzugefügt, so dass vier Marker gleichzeitig sichtbar gemacht werden können. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/67584fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Diese einstufige Antikörperzugabe und die einstufige Amplifikation vereinfachen das Assay-Protokoll erheblich. Der Prozess wird durch automatisierte Hochdurchsatz-Färbe- und Scansysteme erleichtert, die reproduzierbare Ergebnisse von Objektträger zu Objektträger und von Charge zu Charge für eine große Anzahl von Proben gewährleisten, die in klinischen Studien verwendet werden13.
Einer der Hauptvorteile dieser Technologie ist ihre Fähigkeit, eine hohe Empfindlichkeit aufrechtzuerhalten und gleichzeitig ein umfangreiches Multiplexing zu ermöglichen2. Der Workflow stellt auch sicher, dass der Bildgebungsdurchsatz hoch bleibt, wodurch eine der größten Einschränkungen von hochgemultiplexten mIF-Technologien (z. B. &gt; 8 Biomarkern) für klinische Studien behoben wird. Dies ist besonders wichtig in der klinischen Forschung, wo subtile Variationen in den Wirkstoffzielen mit geringer Abundanz (z. B. niedriger HER2) bei Patienten wichtige Einblicke in das therapeutische Ansprechen geben können.
Zusätzlich zu diesen Schlüsselattributen bietet dieser Assay auch die Konfigurierbarkeit des Panels, Hochdurchsatz-Bildgebungsfunktionen für ganze Objektträger und die optische Auflösung, die für die Untersuchung subzellulärer Prozesse und Kompartimente sowie zellulärer Vorsprünge im Zusammenhang mit Makrophagen und dendritischen Zellen erforderlich sind. Die Fähigkeit, komplexe zelluläre Phänotypen über mehrere räumliche Skalen hinweg zu untersuchen, ist ein entscheidender Vorteil der optischen Bildgebung gegenüber bildgebenden Massenzytometrie (IMC)-basierten Methoden2.
In dieser Arbeit wird ein Protokoll für einen 8-plex-mIF-Assay unter Verwendung eines Autostainers und eines Ganzobjektträger-Scanners vorgestellt. Dieser Assay enthält ein Panel mit acht primären Antikörpern: CD3, CD4, CD8, CD68, FOXP3, PD-1, PD-L1 und pan-Cytokeratin14. Dieses Panel von Markern wird die Erstellung von Immunprofilen von Tumorgewebe und die Identifizierung von Zellen ermöglichen, die in der Tumor- oder Stromaumgebung gefunden werden. Bei diesem Protokoll wird ein automatisierter Objektträgerfärbeer für die erste Färbung und Sondenwechselrunden verwendet, und die Färbung und Bildgebung kann innerhalb von 2 Tagen abgeschlossen werden. Es werden auch Methoden zur Validierung eines mIF-Assays und zur Analyse der resultierenden Bilder gezeigt.

<table><tbody><tr><td>Anti-CD3</td><td>Ultivue</td><td></td><td>Klon BC33 (BioCare). Teil von ULT50801</td></tr><tr><td>Anti-CD4</td><td>Ultivue</td><td></td><td>Clone SP35 (Abcam). Teil ULT50801</td></tr><tr><td>Anti-CD68</td><td>Ultivue</td><td></td><td>Klon KP1 (BioCare). Teil ULT50801</td></tr><tr><td>Anti-CD8</td><td>Ultivue</td><td></td><td>Klon C8/144B (BioCare). Teil der ULT50801</td></tr><tr><td>Anti-Cytokeratin + Anti-SOX10</td><td>Ultivue-Klone</td><td></td><td>AE1/AE3 (Bethyl Labs) und BC34 (BioCare). Teil ULT50801, wird als Mischung</td></tr><tr><td>Anti-FOXP3</td><td>Ultivue</td><td></td><td>Clone 236A/E7 (Thermo) geliefert. Teil ULT50801</td></tr><tr><td>Anti-PD1</td><td>Ultivue</td><td></td><td>Klon CAL20 (Abcam). Teil von ULT50801</td></tr><tr><td>Anti-PDL1</td><td>Ultivue</td><td></td><td>Clone 73-10 (Abcam). Teil ULT50801</td></tr><tr><td>Axioscan.Z1 Mikroskops</td><td>Zeiss</td><td></td><td>genanntes Fluoreszenzmikroskop im Text</td></tr><tr><td>Bond Dewax Solution</td><td>Leica</td><td>AR9222</td><td></td></tr><tr><td>Bond Epitope Retrieval Solution 2</td><td>Leica</td><td>AR9640</td><td></td></tr><tr><td>Bond Open Containers, 30 mL</td><td>Leica</td><td>OP309700</td><td></td></tr><tr><td>Bond Research Detection Kit</td><td>Leica</td><td>DS9455</td><td></td></tr><tr><td>Bond Titration Inserts</td><td>Leica</td><td>OPT9049</td><td></td></tr><tr><td>Bond Titration Kit</td><td>Leica</td><td>OPT9719</td><td></td></tr><tr><td>Bond Universal Covertiles</td><td>Leica</td><td>S21.4611</td><td></td></tr><tr><td>Bond Wash Solution 10x Konzentrat</td><td>Leica</td><td>AR9590</td><td></td></tr><tr><td>BondRX Autostainer</td><td>Leica</td><td></td><td>im Text "Autostainer" genannt</td></tr><tr><td>BondRX Software</td><td>Leica</td><td></td><td>Version 6.0 oder höher</td></tr><tr><td>Deckgläser, #1,5 Dicke</td><td>Corning</td><td>2980-244</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, 200 proof</td><td>VWR</td><td>89370-084</td><td></td></tr><tr><td>FFPE-Gewebeblöcke</td><td>BioIVT-Gewebetypen</td><td></td><td>variieren</td></tr><tr><td>OmniVUE 8-Plex-Assay (CD3, CD4, CD8, CD68, FOXP3, PD-1, PD-L1, pan-Cytokeratin/SOX10)</td><td>Ultivue</td><td>ULT50801</td><td>enthält alle anderen Ultivue-Komponenten</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Boston BioProducts</td><td>C-9911F</td>(<td>pH 7,4 mit 2,7 mM KCl und 137 mM NaCl)</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Eindeckmittel</td><td>Thermo</td><td>P10144</td> im Text UltiAnalyzer.AI Ultivue <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UltiStacker.AI</td><td>Ultivue</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultivue Amplification Buffer</td><td>Ultivue</td> als "Eindeckmedium" bezeichnet<td></td><td>Teil von ULT50801</td></tr><tr><td>Ultivue Antikörper-Verdünnungsmittel</td><td>Ultivue</td><td></td><td>Teil von ULT50801</td></tr><tr><td>Ultivue Exchange Buffer</td><td>Ultivue</td><td></td><td>Teil von ULT50801</td></tr><tr><td>Ultivue Exchange Initiator</td><td>Ultivue</td><td></td><td>Teil von ULT50801</td></tr><tr><td>Ultivue Exchange Neutralizer</td><td>Ultivue</td><td></td><td>Teil von ULT50801</td></tr><tr><td>Ultivue Fluoreszenzsonden 1</td><td>Ultivue</td><td></td><td>Teil von ULT50801</td></tr><tr><td>Ultivue Fluoreszenzsonden 2</td><td>Ultivue</td><td></td><td>Teil von ULT50801</td></tr><tr><td>Ultivue Pre-Amplification Mix</td><td>Ultivue</td><td></td><td>Teil von ULT50801</td></tr><tr><td>Ultivue Sonde Puffer</td><td>Ultivue</td><td></td><td>Teil von ULT50801</td></tr><tr><td>Reinstwasser</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr></tbody></table>

automatisierte hochdurchsatz-multiplex-immunfluoreszenz-assays für die translationale forschung

High-Throughput Automated Multiplex Immunofluorescence Assays for Translational Research

Gemäß dem obigen Protokoll wird FFPE-Gewebe mit mehreren Zielen gefärbt, und es wurden qualitativ hochwertige Bilder aller Marker in Vierergruppen erhalten (Abbildung 3A, B). Die Bild-Co-Registrierungssoftware ermöglicht es, Bilder von derselben Folie zu kombinieren und co-zu registrieren, wie in Abbildung 3C zu sehen ist. Ähnliche Ergebnisse sind in Abbildung 4 für einen Gewebeschnitt bei Darmkrebs (CRC) dargestellt.
Der Erfolg des Protokolls sollte durch die Beurteilung des erwarteten Färbemusters bestimmt werden. Im gezeigten SFB-Beispiel wird jedes der gefärbten Ziele im erwarteten subzellulären Kompartiment exprimiert, z. B. nukleäres FoxP3, membranöses CD3, zytoplasmatisches CD68 (Abbildung 4B-D). Jedes der funktionellen Ziele wird auf dem entsprechenden Zelltyp exprimiert, wie das Beispiel der Co-Lokalisation von PD1 und CD3 oder von PDL-1 und CD68 zeigt, die erschöpfte T-Zellen bzw. immunsuppressive Makrophagen zeigen. Die Beurteilung eines guten Signal-zu-Hintergrund-Verhältnisses, das eine erfolgreiche Unterscheidung zwischen richtig positivem Signal und potenziellem Hintergrundrauschen ermöglicht, wird in der Regel qualitativ von Pathologen oder Bildanalyseexperten durchgeführt, die die Qualität der Färbung bestätigen, was eine erfolgreiche Bildanalyse ermöglicht. Um die Qualität und Leistung der Färbung weiter zu bestätigen, kann ein Vergleich mit dem Goldstandard IHC (chromogenes DAB) auf seriellen Schnitten hinzugefügt werden (siehe Beispiel in Abbildung 5) sowie eine Positivkontrollgewebeprobe wie z. B. eine menschliche Mandel, die für die meisten Immunziele nützlich sein kann, um den Erfolg des Färbelaufs zu bestätigen. Es ist zu beachten, dass Krebserkrankungen eine geringere Expression von Zielen aufweisen können als menschliche Mandeln16.
Nachdem die Ergebnisse qualitativ bestätigt wurden, kann eine quantitative Analyse durchgeführt werden. In dieser Arbeit besteht dies hauptsächlich aus der Berechnung der Zelldichte verschiedener Phänotypen (Anzahl der Zellen/mm2), die ein bestimmtes Ziel oder Ziele exprimieren, sowie aus der Berechnung der durchschnittlichen Intensitätsniveaus von funktionellen Zielen, die einen breiten dynamischen Expressionsbereich aufweisen können. Bei der Beurteilung der Genauigkeit von mIF-Assays sollten serielle Schnitte, die mit denselben Markern gefärbt wurden, vergleichbare Signale zwischen den Objektträgern zeigen, was qualitativ in Abbildung 6 zu sehen ist. Beispiele für quantitative Ergebnisse von Einzelmarkerdichten in verschiedenen Gewebetypen sind in Abbildung 7 dargestellt. Die Bildanalyse auf diesen Bildern ermöglicht die Identifizierung positiver Zellen und die Berechnung einer entsprechenden positiven Zelldichte für jeden Marker sowie die durchschnittliche Signalintensität pro positiver Zelle. Auf diese Weise kann für jeden Marker ein Variabilitätskoeffizient (CV) berechnet werden, um die Genauigkeit des Multiplexing-Assays zu beurteilen (Tabelle 4).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67584/67584fig03.jpg"> 
Abbildung 3: Bilder eines Gewebe-Microarrays (TMA)-Kerns, die aus aufeinanderfolgenden Färberunden im 8-Plex-Immunfluoreszenzprotokoll gewonnen wurden. (A) Bild aus der ersten Bildgebungsrunde mit den Markern CD8, PD1, PD-L1 und CD68. Nach dem Austauschprotokoll zeigt (B) die zweite Bildgebungsrunde auf demselben Objektträger für die zweite Runde der Marker CD3, CD4, FoxP3 und CK/SOX10, und (C) zeigt ein co-registriertes Bild, das die Bilder (A) und (B) kombiniert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/67584fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67584/67584fig04.jpg"> 
Abbildung 4: Repräsentative Färbung von Darmkrebsgewebe mit 8-Plex-Immunfluoreszenzfärbung. Die Abbildung zeigt zelluläre Phänotypen, die durch die Co-Lokalisierung mehrerer Ziele in derselben Zelle identifiziert werden können. (nach oben) Bild des gesamten Objektträgers von Darmkrebsgewebe. (unten) Detaillierte Ansichten von Regionen des Gewebes, die (A) T-reg-Zellen (CD3+/CD4+/FOXP3+), (B) PD-1- und PD-L1-exprimierende Zellen in Tumoren und Stroma, (C) erschöpfte zytotoxische T-Zellen (CD3+/CD8+/PD-1), (D) immunevagnierende Tumorzellen (PD-L1+/CK+) und immunsuppressive Makrophagen (CD68+/PDL1+) hervorheben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/67584fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67584/67584fig05.jpg"> 
Abbildung 5: Qualitativer Vergleich der Immunhistochemie (IHC) mit der Immunfluoreszenz (IF)-Färbung. Serielle Schnitte, die mit einer immunhistochemischen Einzelmarker-Färbung (DAB, obere Reihe), einer Einzelmarker-Immunfluoreszenz (ISP-Monoplex) und einer Einkanalansicht der Multiplex-Immunfluoreszenz (ISP-Multiplex) gefärbt wurden, zeigen die qualitative Übereinstimmung zwischen den verschiedenen Färbemethoden. Maßstabsbalken = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/67584fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67584/67584fig06.jpg"> 
Abbildung 6: Färbung des seriellen Schnitts. (A) Diagramm, das das Layout einer Multigewebe-TMA zeigt. (B) Repräsentative 8-Plex-Bilder von Gewebekernen jedes Gewebetyps in der TMA. (C) Repräsentative Bilder von CD8 in einem Mandelkern über sechs serielle TMA-Schnitte, die in einem einzigen Lauf gefärbt wurden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/67584fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67584/67584fig07.jpg"> 
Abbildung 7: Quantifizierung der Einzelmarkerdichte pro Gewebetyp, der in der TMA enthalten ist. Die Dichten pro Gewebe sind die durchschnittlichen Dichten über drei repräsentative Kerne jedes Gewebetyps auf dem TMA-Objektträger. Die y-Achse stellt die einzelnen Markerdichten in verschiedenen Gewebetypen auf der x-Achse dar, in Einheiten von positiven Zellen/mm2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/67584fig07large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67584/67584fig08.jpg"> 
Abbildung 8: Region of Interest (ROI)-Analyse des relativen Fluoreszenzsignals im Vergleich des in diesem Protokoll beschriebenen verstärkten ISP mIF mit dem indirekten ZF. (A) Repräsentativer Objektträger, gefärbt für CK (links) oder PD-L1 (rechts) mit fünf angezeigten ROIs. (B) Repräsentative ROI-Bilder für CK (oben) und PD-L1 (unten). Mittlere Signalintensität, die mit amplifiziertem mIF (violett) und indirektem IF (blau) für (C) CK und (D) PD-L1 über fünf ROIs mit den Maßen 100 μm x 100 μm und ca. 200 Zellen erreicht wird. Die Werte der Y-Achse zeigen beliebige fluoreszierende Einheiten und Fehlerbalken zeigen Standardabweichungen (n=3) an. (E) Die relative Signalintensität, die mit verstärktem ISP-mIF (violett) und indirektem IF (blau) erreicht wurde, wurde berechnet, indem das Verhältnis des mittleren verstärkten mIF-Signals zum mittleren indirekten IF-Signal über alle ROIs hinweg genommen wurde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/67584fig08large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Tabelle 4: Berechneter Varianzkoeffizient (CV). Die CV der positiven Zelldichte und die mittlere Signalintensität für die Tonsillenbilder sind in Abbildung 6 dargestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/Table04_RE.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>

Automatisierte Hochdurchsatz-Multiplex-Immunfluoreszenz-Assays für die translationale Forschung

Multiplex immunofluorescence (mIF) is an advanced technique that allows for detailed, spatially resolved analysis of tissue samples by visualizing ...

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Hier beschreiben wir eine optimierte Multiplex-Reverse-Transkriptase-quantitative PCR (qRT-PCR)-Protokoll in Kombination mit einer mikrofluidischen Plattform als zeit-und kosteneffektiver High-Throughput-Screening-Tool für microRNA (miRNA) Expression, besonders beim Arbeiten mit geringen Mengen der Probe.

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Multiplexed Fluorometric Immunoassay Testing Methodology und Fehlerbehebung

Wir präsentieren in der aktuellen Studie eine neuartige fluoreszenzbasierten Assays von einer transgenen Maus abgeleiteten Lymphozyten. Dieser Assay ist für Hochdurchsatz-Screening (HTS) von kleinen Molekülen dotiert mit einer Kapazität von entweder Hemmung oder Förderung der Lymphozytenaktivierung geeignet.

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Ein detailliertes Protokoll für ein sechs-Marker multiplex Immunfluoreszenz-Panel optimiert und durchgeführt ist, mit Hilfe einer automatisierten Stainer für konsistentere Ergebnisse und eine kürzere Verfahrensdauer. Dieser Ansatz kann direkt von jedem Labor für Immuno-onkologischen Studien angepasst werden.

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Multiplex-Fluoreszenz-Immunhistochemie ist eine neue Technologie, die die Visualisierung mehrerer Zelltypen innerhalb intakten formalinfixierten, paraffineingebetteten (FFPE) Gewebeermöglicht. Präsentiert werden Richtlinien zur Sicherstellung eines erfolgreichen 7-Farben-Multiplex mit Anweisungen zur Optimierung von Antikörpern und Reagenzien, zur Vorbereitung von Dias, Design und Tipps zur Vermeidung von häufigauftretenden Problemen.

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Die Implementierung einer kostengünstigen, vielseitigen Photobestrahlungstechnik mit der manuellen IBEX-Methode ermöglicht eine optimale Bildgebung von menschlichem Gewebe mit signifikanter nativer Autofluoreszenz. Dieses Protokoll beschreibt, wie man Multiplex-Bilder von Ganzobjektträgern aus archivierten klinischen Proben mit einem inversen Mikroskop, weit verbreiteten Reagenzien und Open-Source-Software für die Bildausrichtung und -verarbeitung erhält.

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Multiplexierte Immunfluoreszenz ermöglicht die sequentielle Markierung mehrerer Antikörpermarker innerhalb eines einzelnen Gewebeschnitts, um die räumliche Analyse der Gewebearchitektur und Zellpopulationen zu unterstützen. Hier wird ein Arbeitsablauf zur Multiplexerkennung von seneszenzassoziierten, strukturellen und immunen Markern präsentiert, einschließlich manueller und automatisierter Objektträgervorbereitung, iterativer Bildgebung und Einzelzellanalyse mit digitaler Pathologiesoftware.

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Lernen Sie automatisierte Hochdurchsatz-Multiplex-Immunfluoreszenz-Assays für die translationale Forschung. Diese Methode ermöglicht räumliche Proteomik mit hoher Reproduzierbarkeit an FFPE-Geweben.

Automatisierte Hochdurchsatz-Multiplex-Immunfluoreszenz-Assays für die translationale Forschung

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