Profilierung von permethylierten Mucin-O-Glykanen mittels matrixgestützter Laserdesorption/Ionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie

Wir untersuchen die Glykobiologie der Wirtsmikroben-Interaktionen im Magen-Darm-Trakt mit Schwerpunkt auf der Rolle der Schleimschicht, die den Magen-Darm-Trakt bedeckt, insbesondere Mucine und deren Glykane bei Gesundheit und Krankheit. Mucinglykane werden zunehmend als wichtige Faktoren in Wirt-Mikroben-Interaktionen anerkannt, da sie Nährstoffe und Bindungsstellen für Bakterien bereitstellen. Eine Veränderung des Glykosylierungsprofils kann zu einer Störung der mikrobiotischen Zusammensetzung führen und umgekehrt, Phänotypen, die häufig bei Krankheitszuständen beobachtet werden.

Mucine sind jedoch berüchtigt schwierig zu untersuchen, da sie stark glykosyliert sind. Innovationen in den Probenahmetechniken und der nachfolgenden bioinformatischen Analyse können das Feld voranbringen, ebenso wie neue Probenverarbeitungsansätze, um den Durchsatz zu erhöhen und die Zeit von der Probenentnahme bis zum Ergebnis zu verkürzen. Andere analytische Techniken ermöglichen eine detailliertere strukturelle Charakterisierung von Glykanen, erfordern jedoch eine lange Laufzeit und Analysezeit.

Die hier beschriebene Technik mit MALDI-TOF-Massenspektrometrie hat den Vorteil der Geschwindigkeit, was sie hochdurchsatzfähig und für Screening und Profilierung geeignet macht. Zunächst mischen Sie gereinigte Mucine mit 250 Mikrolitern des Beta-Eliminationspuffers in einem vier Milliliter großen Glasfläschchen. Versiegeln Sie das Fläschchen fest mit einer mit Polytetrafluorethylen ausgekleideten Kappe und inkubieren Sie die Reaktion bei 45 Grad Celsius für 16 Stunden.

Auf Eis geben Sie einen Milliliter der 5%igen Essigsäurelösung tropfenweise zur Reaktionsmischung. Zum Entsalzen der Probe stecken Sie eine Glaspipette mit einer kleinen Menge Glaswolle ein. Gib 1,5 Milliliter der Harzsuspension von oben zur Glaspipette hinzu, lasse sie dann absinken und ablaufen.

Waschen Sie das Harz nun mit zwei Millilitern 5 % Essigsäure und entsorgen Sie den Durchfluss. Anschließend wird die Schleimprobe in die Entsalzsäule gegeben und der Durchfluss in einem Fünf-Milliliter-Rohr gesammelt. Waschen Sie die Säule zweimal mit einem Milliliter 5%-Essigsäure, um den Durchfluss aufzufangen.

Dann entfernt man mit einem Zentrifugalverdampfer die Essigsäure und konzentriert die Probe bei fünf Millibar und 30 Grad Celsius für zwei Stunden. Lösen Sie die Probe in 0,5 Millilitern Methanolessigsäure auf und trocknen Sie sie unter einem Stickstoffstrahl. Mit einer Glasspritze geben Sie vier Milliliter DMSO in das Fläschchen, das eine Mischung aus Natriumhydroxid und Methanol enthält.

Nach dem Vortexen wird die Lösung bei 2.000 g für zwei Minuten zentrifugiert. Geben Sie das Überlagermittel vorsichtig ab und entfernen Sie die Salze, ohne das Gel zu stören. Nachdem keine weiteren Salze gebildet sind, wird das Gel in vier Millilitern wasserfreiem DMSO neu suspendiert, um die Permethylierungsbasissuspension herzustellen.

Als Nächstes fügen Sie der getrockneten Schleimprobe anhydriertes DMSO und Permethylierungsbase hinzu, gefolgt von Iodomethan. Inkubieren Sie die Permethylierungsreaktion 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit kräftigem Schütteln. Dann fügen Sie 0,5 Milliliter Wasser hinzu, um die Reaktion zu beenden.

Nachdem die Probe trüb geworden ist, spülen Sie sie mit Stickstoff, bis sie klar wird. Laden Sie die Probe auf eine hydrophile lipophile 96-Well-Extraktionsplatte. Üben Sie Überdruck aus, um die Proben mit einer Durchflussrate von etwa einem Milliliter pro Minute durch die Festphase zu schieben.

Nach dem Ablegen des Durchflusses werden die Brunnen zweimal mit einem Milliliter Wasser gewaschen. Elutieren Sie die Glykane zweimal von der Platte mit einem Milliliter Methanol. Druck nur so lange ausüben, bis Methanol die Platte zu verlassen beginnt, und dann den Schwerkraftfluss aufrechterhalten zu lassen.

Trocknen Sie die Probe mit einem Zentrifugalverdampfer und lösen Sie sie in 10 Mikrolitern TA50 auf. Nachdem Sie einen Mikroliter Probe und die Matrix gemischt haben, laden Sie diese auf eine Stahl-MALDI-Zielplatte und lassen Sie sie trocknen. Für die Datenanalyse laden Sie die exportierte ASCII-Datei des Massenspektrums in GlycoWorkbench.

Nach der Baseline-Korrektur werden die Spitzenschwerpunkte berechnet und im Pop-up-Fenster der passende Massenbereich, das minimale Signal-Rausch-Verhältnis und die minimale Massenspektrometrie-Spitzenintensität ausgewählt. Verwenden Sie dann das Glyco-Peakfinder-Tool, um die Strukturzusammensetzungen zu identifizieren, die zur Peak-Liste passen. Wählen Sie perMe als Derivitisierung, redEnd als reduzierendes Ende und setzen Sie die Mindest- und Maximalzahl der erwarteten Rückstände fest.

Für Mucine wählen Sie Hexose, N-Acetylhexosamin, Deoxyhexose und N-Acetylneuraminsäure. Für sulfatierte Glykane verwenden Sie die Option Andere Rückstände mit einer Masse von 87,9. Für MALDI-TOF-Daten stellen Sie die maximale Anzahl der Natriumionen und -ladungen auf jeweils eins und setzen Sie die Genauigkeit auf 0,5 Dalton.

Wählen Sie alle korrekten Anmerkungen mit der Control-Taste aus und klicken Sie auf jede davon. Rechtsklick auf die ausgewählten Anmerkungen und wähle "Zur annotierten Gipfelliste hinzufügen". Um einen Bericht zu erstellen, der mehrere annotierte Spektren vergleicht, gehe zu Tools und dann zu Reporting und erstelle einen Bericht, der verschiedene Profile vergleicht.

Drucken Sie den Bericht als PDF aus, um ihn zu speichern. Für die Analyse der Fragmentationsspektren laden Sie die Spektren auf GlycoWorkbench und erstellen die zuvor gezeigte Peak-Liste. Zeichnen Sie mutmaßliche Glykanstrukturen, die den annotierten Glykan-Zusammensetzungen entsprechen.

Um Fragmente für jede Struktur zu generieren, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf Fragmente kopieren und wählen Sie unter dem Werkzeug Fragmente berechnen. Für weitere Fragmentierungsanalysen klicken Sie auf einen Interessenpunkt im Spektrumviewer. Klicken Sie mit der rechten Maustaste und wählen Finden Sie alle Strukturen, die den Spitzen entsprechen, um das Master-Charge-Verhältnis des ausgewählten Spitzenwerts mit Online-Datenbanken abzufragen.

Wählen Sie vermutete Strukturen von Interesse aus und klicken Sie mit Rechtsklick, um sie mit der entsprechenden Option ins Leinwandfenster zu kopieren. Um mögliche Fragmente aus jeder glykanischen Struktur zu berechnen, wählen Sie die Struktur auf der Leinwand aus. Wählen Sie dann unter Werkzeugen und Fragmenten die Compute-Fragmente für die aktuelle Struktur aus.

Wenn Fragmente für mehr als eine Glykan-Struktur berechnet wurden, gehen Sie zur Ansicht der Fragmente-Tabelle unter dem Reiter Zusammenfassung, um die Vergleichstabelle anzusehen. Wählen Sie die Fragmente aus, die zur Peak-Liste für jede potenzielle Glykanstruktur passen. Rechtsklick und wähle im Dropdown-Menü Fragmente auf Leinwand kopieren.

Zum Schluss gehe im Reiter Tools zu Profiler und dann Annotiere Peaks mit allen Strukturen. Dann wählen Sie Werkzeuge, Berichterstattung und Erstellen Sie einen Bericht der Anmerkungen. Das Entsalzen durch Ionenaustausch führte zu einer besseren Rückgewinnung größerer Glykane, wobei diese größeren Strukturen 31 % der Gesamtglykane ausmachen, verglichen mit 21 % bei der PGC-Extraktion.

Unter den identifizierten Glykanstrukturen wurde ein Glykan nur durch die Ionenaustausch-Entsalzprobe identifiziert. Darüber hinaus führte das Entsalzen durch Ionenaustausch und Boratentfernung zu Spektren mit erhöhten Signal-Rauschverhältnissen im Vergleich zu denen, die nach der Entsalzung durch Festphasenextraktion mit PGC erzeugt wurden. Permethylierungsreaktionszeiten von 30 und 90 Minuten führten zur Identifizierung von 33 Glykan-Peaks, während eine fünfminütige Reaktion nur 31 Peaks identifizierte.