Name: Ein effizientes Protokoll zur Beurteilung der Modulation der ERK-Aktivität in frühen Modellen des Zebrafisch-Noonan-Syndroms mittels Live-FRET-Mikroskopie und Immunfluoreszenz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T13:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Erfahren Sie die Live-FRET-Mikroskopie zur Bewertung der ERK-Aktivität in Zebrafisch-Noonan-Syndrom-Modellen. Diese Methode ermöglicht die Validierung pathogener Varianten und die Testung von MEK-Inhibitoren.

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<ol><li>Iroegbu, J. D., Ijomone, O. K., Femi-Akinlosotu, O. M., Ijomone, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERK%2FMAPK+signalling+in+the+developing+brain%3A+Perturbations+and+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Biobehav+Rev%22%5BJournal%5D)">ERK/MAPK signalling in the developing brain: Perturbations and consequences.</a> Neurosci Biobehav Rev. 131, 792-805 (2021).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td><stark>Kunststoffwaren</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,7-Liter-Zuchtbecken – Strandstil-Design</td><td>Tecniplast</td><td>1,7L SLOPED</td><td>Brutbecken</td></tr><tr><td>Kapillaren GC100F-10</td><td>Harvard-Apparat</td><td>30-0019</td><td>Mikroinjektion im Embryo im Ein-Zellstadium</td></tr><tr><td>Zell- und Gewebekulturplatten – 12 Brunnen</td><td>BIOFIL</td><td>TCP011012</td><td>Embryonensammlung und Behandlung</td></tr><tr><td>Zell- und Gewebekulturplatten – 6 Brunnen</td><td>BIOFIL</td><td>TCP011006</td><td>Embryonensammlung und Behandlung</td></tr><tr><td>Zellkulturschale</td><td>SPL Life Sciences</td><td>20100</td><td>Embryoentnahme &nbsp;</td></tr><tr><td>Unnic-Glasschalen 12 mm</td><td>Thermo Fisher</td><td>150680</td><td>Spektralbildgebung des Embryo-FRET</td></tr><tr><td>Pipette Pasteur</td><td>Corning</td><td>357524</td><td>Embryotransfer</td></tr><tr><td>Protein-Lobindröhren 2 ml</td><td>Eppendorf</td><td>30108450</td><td>IHC-Prüfung</td></tr><tr><td><stark>Reagenzien und andere</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaviar 500-800 & Mikro; m</td><td>Rettenmaier Italia</td><td>BE2269 (500-800)</td><td>Trockenfischfutter</td></tr><tr><td>Great Salt Lake Blue Artemia Zysten</td><td>Sanders</td><td>00004727</td><td>Lebendfischfutter</td></tr><tr><td>Sofortiges Ozeansalz</td><td>Tecniplast</td><td>XPSIO25R</td><td>Getrocknetes Meersalz zur Zubereitung von lebendem Essen</td></tr><tr><td>Tg(EF1a:ERK Biosensor-nes) (Teenager)</td><td>Ansprechpartner zur Bestellung*: National BioResource Project Zebrafish, Support Unit for Animal Resources Development, RRD, RIKEN Center for Brain Science, Japan. https://shigen.nig.ac.jp/zebra/index_en.html *bei MTA-Unterschrift.&nbsp; </td><td>-</td><td>Lieferant der ERK Reporter Zebrafischschnur. Fischembryonen können mit MTA-Unterschrift des National BioResource Project of Japan für Zebrafish (RIKEN, Japan) gewonnen werden. Die Zebrafischlinie wird vom Nara Institute of Science and Technology (Takaaki Matsui) und dem National Institute of Genetics (NIG/ROIS) (Koichi Kawakami, Patent für das Tol2-System) (Wong et al., 2018, Urasaki et al., 2006, Okamoto und Ishioka, 2010) deponiert.</td></tr><tr><td>6x Ladefarbe</td><td>Zellsignalübertragung</td><td>B7024S</td><td>Gel-Elekrophorose</td></tr><tr><td>100 bp DNA-Leiter</td><td>NEB</td><td>N3231S</td><td>Gel-Elekrophorose</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1,01,236</td><td>Gel-Elekrophorose</td></tr><tr><td>Agarose, niedrige Geling-Temperatur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414-10G</td><td>Embryo-Montage für FRET-Spektralbildgebung und IHC-Assay</td></tr><tr><td>Rinderserum-Albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8022</td><td>IHC-Prüfung</td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223506</td><td>E3-Medium-Komponente</td></tr><tr><td>Calciumnitrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>237124</td><td>Danieau-Stocklösungskomponente</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418-100ML</td><td>IHC-Prüfung</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td>TBE-Pufferkomponente für die Gelpräparation</td></tr><tr><td>Ethanol 99%+</td><td>Fisher Scientific</td><td>10048291</td><td>In-vitro-RNA-Reinigung</td></tr><tr><td>Formaldeide 16 %</td><td>Thermo Fisher</td><td>28908</td><td>Embryofixierung</td></tr><tr><td>Formamid&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9037</td><td>Gel-Elekrophorose</td></tr><tr><td>Gel-Ladepuffer II (Denaturierender PAGE)</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM8546G</td><td>In-vitro-RNA-Transkription</td></tr><tr><td>Gletscheressigsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695092</td><td>TBE-Pufferkomponente für die Gelpräparation</td></tr><tr><td>Glycerol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6279-1L</td><td>IHC-Prüfung</td></tr><tr><td>Ziegen-Maus-Anti-Maus Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11001</td><td>IHC-Prüfung</td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Kaninchen-Alexa Fluor 633</td><td>Thermo Fisher</td><td>A21070</td><td>IHC-Prüfung</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Danieau-Stocklösungskomponente</td></tr><tr><td>KpnI - HF (Enzyme + rCutSmart Buffer)</td><td>NEB</td><td>R3142</td><td>Plasmidlinearisierung&nbsp;</td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td>E3 Medium-Komponente/Danieau-Stocklösungskomponente</td></tr><tr><td>Millennium-RNA-Marker</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM7150</td><td>Gel-Elekrophorose</td></tr><tr><td>Monarchgenomisches DNA-Reinigungskit</td><td>NEB</td><td>T3010L</td><td>Plasmidlinearisierung&nbsp;</td></tr><tr><td>Maus monoklonale P44/42 MAPK</td><td>Zellsignalübertragung</td><td>4696S</td><td>IHC-Prüfung</td></tr><tr><td>mMACHINE SP6 Transkriptionskit&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM1340</td><td>In-vitro-RNA-Transkription</td></tr><tr><td>Normales Ziegenserum (NGS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td>IHC-Prüfung</td></tr><tr><td>Nukleasefreies Wasser-Ambion</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9937</td><td>In-vitro-RNA-Transkription</td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PZ0162</td><td>MEK-Inhibitor</td></tr><tr><td>Phenol-Rot-Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td>Mikroinjektionsmischungskomponente&nbsp;</td></tr><tr><td>Poly A Tailing Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM1350</td><td>In-vitro-RNA-Transkription</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid-Bioxtra&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>E3 mittlere Komponente/Danieau Stock Solution Komponente/PBS Stock Solution Component</td></tr><tr><td>Kaliumdihydrogenphosphat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td>PBS-Stocklösungskomponente</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2308</td><td>IHC-Prüfung</td></tr><tr><td>Kaninchenpolyklonales Phospho-p44/42 MAPK&nbsp;</td><td>Zellsignalübertragung</td><td>4695S</td><td>IHC-Prüfung</td></tr><tr><td>SYBR-sichere DNA-Gel-Färbung</td><td>Thermo Fisher</td><td>S33102</td><td>Gel-Elekrophorose</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31434-M</td><td>E3 mittlere Komponente/Danieau Stock Solution Komponente/PBS Stock Solution Component</td></tr><tr><td>Natriumphosphat-dibasisch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71643</td><td>PBS-Stocklösungskomponente</td></tr><tr><td>Trizma-Basis</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>TBE-Pufferkomponente für die Gelpräparation</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>PBSTr-Pufferkomponente</td></tr><tr><td><stark>Ausrüstung</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alliance Mini HD9&nbsp;</td><td>Uvitec</td><td>-</td><td>Bildgebungssystem</td></tr><tr><td>Zentrifuge 5430 R</td><td>Eppendorf</td><td>5428000205</td><td>Mikrozentrifuge</td></tr><tr><td>Eppendorf ThermoMixer C</td><td>Eppendorf</td><td>-</td><td>Embryo-Montage&nbsp;</td></tr><tr><td>FemtoJet 4x</td><td>Eppendorf</td><td>-</td><td>Mikroinjektionssystem</td></tr><tr><td>Infinite M Plex&nbsp;</td><td>Tecan</td><td>-</td><td>Multimode-Kennzeichenleser</td></tr><tr><td>Leica M205FA</td><td>Leica Microsystems</td><td>-</td><td>Fluoreszenz-Stereomikroskop</td></tr><tr><td>Leica TCS-SP8X ausgestattet mit Inkubator (OkoLab)</td><td>Leica Microsystems</td><td>-</td><td>Konfokalmikroskop</td></tr><tr><td>Mini-subzell GT Horiziontale Elektrophorese System&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1704406</td><td>Gel-Elekrophorose</td></tr><tr><td>PC-100 Vertikalzieher</td><td>Narishige</td><td>-</td><td>Nadelzieher</td></tr><tr><td>PowerPac Universalstromversorgung</td><td>Bio-Rad</td><td>1645070</td><td>Gel-Elekrophorose</td></tr><tr><td>Stellaris 5&nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td>-</td><td>Konfokalmikroskop</td></tr><tr><td>Vortex MiniStar Silberlinie</td><td>VWR</td><td>-</td><td>Plasmidpräparation</td></tr><tr><td><stark>Software</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biorender</td><td>Biorender</td><td>CC-BY 4.0-Lizenz</td><td>Cartoon-Ausarbeitung für Figures</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft Office Professional Plus 2019</td><td>-</td><td>Datenanalysen</td></tr><tr><td>Fidschi-Software</td><td>ImageJ</td><td>15,3t</td><td>Bildgebende Rendering und quantitative Analysen (RET-Signalmessungen, ERK-Fluoreszenzintensität im IHC-Assay, Länge der Embryoachsen)</td></tr><tr><td>GraphPad Prism&nbsp;</td><td>GraphPad Software LLC</td><td>Bd. 9</td><td>Statistische Datenanalysen</td></tr><tr><td>iControl-Spektrophotometer-Software</td><td>Tecan</td><td>v. 2.0</td><td>RNA-Quantifizierung</td></tr><tr><td>Illustrator</td><td>Adobe</td><td>26.0.3 (64-Bit)</td><td>Figurenzusammenstellung</td></tr><tr><td>LASX-Software</td><td>Leica Microsystems</td><td>V. 4.5 (Stellaris 5), V. 3.0 (M205FA), V. 3.5 (TCS-SP8X)</td><td>Bildaufnahme für spektrale FRET-Experimente und Embryobildgebung für Messungen der Achsenlänge</td></tr><tr><td>Q9 Mini 18.02-SN Software</td><td>Uvitec</td><td>-</td><td>Gel-Bildaufnahme</td></tr></tbody></table>

ein effizientes protokoll zur beurteilung der modulation der erk-aktivität in frühen modellen des zebrafisch-noonan-syndroms mittels live-fret-mikroskopie und immunfluoreszenz

An Efficient Protocol to Assess ERK Activity Modulation in Early Zebrafish Noonan Syndrome Models via Live FRET Microscopy and Immunofluorescence

Ein effizientes Protokoll zur Beurteilung der Modulation der ERK-Aktivität in frühen Modellen des Zebrafisch-Noonan-Syndroms mittels Live-FRET-Mikroskopie und Immunfluoreszenz

RASopathies are genetic syndromes caused by ERK hyperactivation and resulting in multisystemic diseases that can also lead to cancer predisposition. ...

an-efficient-protocol-to-assess-erk-activity-modulation-early

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Dieses Video zeigt einen nicht-invasiven Assay zur Untersuchung der Elektrophysiologie von Motoneuronen in Zebrafischembryonen. Bei der Messung des Schwanzcoilings in den Embryonen als Folge der spontanen Depolarisation der Motoneuronen des Rückenmarks wird ein Natriumkanalblocker angewendet, um die Windungsfrequenz zu reduzieren. Anschließend werden die Embryonen in Agarose immobilisiert und unter ein Fluoreszenzmikroskop gelegt. Die gentechnisch veränderten Motoneuronen exprimieren einen...

Ein nicht-invasiver Ansatz zur Untersuchung der Elektrophysiologie von Motoneuronen in Zebrafischembryonen

Der Zebrafisch ist mittlerweile ein etabliertes und leistungsfähiges Werkzeug zur Modellierung von Muskeldystrophien, angeborenen Myopathien und verwandten neuromuskulären Erkrankungen. Doppelbrechung und berührungsevoziertes Fluchtverhalten sind zwei gängige nicht-invasive Assays, die verwendet werden, um den Grad der Muskeldesorganisation und der Beeinträchtigung des Bewegungsapparates von Zebrafischembryonen während der frühen Entwicklung zu bestimmen.

Analyse von Skelettmuskeldefekten bei Zebrafischlarven mittels Doppelbrechung und berührungsempfindlichen Escape-Response-Assays

Hier beschrieben ist ein Protokoll zur halbautomatischen Bilderzeugungsgewebespezifischer Fluoreszenz in Zebrafischembryos.

Semi-Automated Imaging von Gewebespezifische Fluoreszenz-in Zebrafischembryonen

Wir präsentieren eine Methode zur elektroretinographischen (ERG) Analyse von Zebrafischlarven unter Verwendung von Mikromanipulations- und Elektroretinographie-Techniken. Dies ist eine einfache und unkomplizierte Methode, um die Sehfunktion von Zebrafischlarven in vivo zu bestimmen.

Elektroretinogramm Analyse der Sicht Antwort in Zebrafisch-Larven

Die hier beschriebenen Protokolle ermöglichen die Untersuchung der elektrischen Eigenschaften erregbarer Zellen unter den meisten nicht-invasiven physiologischen Bedingungen, indem Zebrafischembryonen in einem in vivo-System zusammen mit einem auf Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) basierenden genetisch kodierten Spannungsindikator (GEVI) verwendet werden, der selektiv in dem interessierenden Zelltyp exprimiert wird.

Biosensing Motor Neuron Membran Potenzial in Live Zebrafisch Embryos

Hier stellen wir ein Protokoll für die Entwicklung und Charakterisierung eines Zebrafischmodells der Epilepsie vor, das aus der vorübergehenden Hemmung des DEPDC5-Gens resultieren.

Verhaltens- und physiologische Analyse in einem Zebrafischmodell der Epilepsie

Dieses Manuskript beschreibt eine einfache Methode, um Stress verhaltensverhaltensverhaltensverhaltensverhaltensverhaltensfrei bei erwachsenen Zebrafischen zu messen. Der Ansatz nutzt die angeborene Tendenz, dass Zebrafische die untere Hälfte eines Tanks bevorzugen, wenn sie sich in einem stressigen Zustand befinden. Wir beschreiben auch Methoden zur Kopplung des Assays mit der Pharmakologie.

Verhaltensweisen für den Studierenz-Stress in Zebrafischen

Optische Klarheit ist ein großer Vorteil für die zellbiologische und physiologische Arbeit im Zebrafisch. Es werden robuste Methoden zur Messung des Zellwachstums in einzelnen Tieren beschrieben, die neue Einblicke in die Integration des Wachstums von Skelettmuskeln und benachbarten Geweben in das Wachstum des gesamten Körpers ermöglichen.

Echtzeit- und wiederholte Messung des Skelettmuskelwachstums bei einzelnen lebenden Zebrafischen, die einer veränderten elektrischen Aktivität ausgesetzt sind

Zebrafish targeting reactive electrophiles and oxidants (Z-REX) ist eine auf chemischer Biologie basierende Methode zur Untersuchung reaktiver niedermolekularer Signalwege. Diese Technik kann auf lebende Fische in verschiedenen Entwicklungsstadien angewendet werden. Hier koppeln wir Standard-Assays im Zebrafisch mit Z-REX für die Analyse des Signalwegs.

Überwachung von On-Target-Signalantworten in Zebrafischlarven - Z-REX entschlüsselt präzise Mechanismen elektrophiler Wirkstoffe und Metaboliten

Die optogenetische Manipulation von Signalwegen kann eine leistungsfähige Strategie sein, um zu untersuchen, wie Signale in der Entwicklung, Regeneration, Homöostase und Krankheit entschlüsselt werden. Dieses Protokoll enthält praktische Richtlinien für die Verwendung von Licht-Sauerstoff-Spannungs-Sensordomänen-basierten Knoten- und knochenmorphogenen Protein-Signalaktivatoren (BMP) im frühen Zebrafischembryo.

Optogenetische Signalaktivierung in Zebrafischembryonen

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll vor, um die neuronale Aktivität in Gehirnregionen transgener Zebrafische, die GCaMP-Kalziumindikatoren exprimieren, mittels konfokaler Mikroskopie zu untersuchen.

Im lebenden Organismus Konfokale Fluoreszenzbildgebung der durch sensorische Stimulation induzierten neuronalen Aktivität bei teilweise gefesselten Zebrafischlarven

Erfahren Sie die Live-FRET-Mikroskopie zur Bewertung der ERK-Aktivität in Zebrafisch-Noonan-Syndrom-Modellen. Diese Methode ermöglicht die Validierung pathogener Varianten und die Testung von MEK-Inhibitoren.

Ein effizientes Protokoll zur Beurteilung der Modulation der ERK-Aktivität in frühen Modellen des Zebrafisch-Noonan-Syndroms mittels Live-FRET-Mikroskopie und Immunfluoreszenz (Video) | JoVE Journal

Ein effizientes Protokoll zur Beurteilung der Modulation der ERK-Aktivität in frühen Modellen des Zebrafisch-Noonan-Syndroms mittels Live-FRET-Mikroskopie und Immunfluoreszenz

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