Ein effizientes Protokoll zur Beurteilung der Modulation der ERK-Aktivität in frühen Modellen des Zebrafisch-Noonan-Syndroms mittels Live-FRET-Mikroskopie und Immunfluoreszenz

Wir erstellen Zebrafischmodelle komplexer Entwicklungserkrankungen, die Patientensequenzierung mit funktioneller Genomik verknüpfen, um die Varianteninterpretation und auch präklinische Medikamententests zu unterstützen. Trotz verbesserter FRET-Sensoren fehlen robuste in-vivo-Tests, die subtile pathogene Veränderungen der Ras-MAPK-Signalübertragung mit ausreichender räumlich-zeitlicher Empfindlichkeit nachweisen. Zunächst wird die individuelle Mikroinjektionsplatte mit gegossenem 2%-Agarose in E3-Medium auf eine Arbeitsplattform gelegt.

Richten Sie befruchtete Zebrafisch-Eier im Teller auf geeignete Bahnen an, um die Eibewegung während der Mikroinjektion zu begrenzen. Laden Sie die Nadel mit zwei Mikrolitern Injektionsmaterial mit einer Mikrolader-Pipette nach. Passen Sie Druck- und Zeiteinstellungen an, um jede Injektion basierend auf der Nadel- und Embryoqualität des Mikroinjektionsgeräts zu kalibrieren.

Injizieren Sie die Lösung in das Einzellstadium von jugendlichen Zebrafisch-Embryonen. Mikroinjizierte Teenager-Embryonen unter kontrollierten Haltungsbedingungen aufziehen. Entfernen Sie alle Eier, die trüb oder degeneriert erscheinen, innerhalb von drei Stunden nach der Ablagerung.

Etwa vier Stunden nach der Befruchtung, mit einem Standard-Fluoreszenz-Stereomikroskop, eingestellt auf einen Wellenlängenbereich von 465 bis 500 Nanometern. Screenen Sie die Embryonen auf die Expression des Fluoreszenzreporters. Wählen Sie jugendliche positive Fische für die FRET-Bildgebung aus und reservieren Sie negative Geschwister für immunhistochemische Untersuchungen.

Platziere Embryopools gleicher Anzahl in verschiedene Brunnen einer sechs-Well-Platte. Um die Behandlung zu beginnen, tauchen Sie die Embryonen in drei Milliliter E3-Medium ein, das Vehikelkontrolle als DMSO oder verdünntes MEK in der gewünschten Konzentration enthält. Schmelzen Sie zunächst den 1,5 % bis 2 % niedrig schmelzenden Agarose Aliquot in einem ThermoMixer bei 50 Grad Celsius.

Nach dem Auflösen wird die Temperatur auf etwa 30 Grad Celsius reduziert. Positioniere einen einzelnen, injizierten Teenager-positiven Embryo in der Mitte einer 35-Millimeter-Glasbodenschüssel für Live-Imaging. Entferne überschüssiges E3-Medium und gib einen Tropfen niedrigschmelzender Agarose hinzu, um den Embryo zu immobilisieren.

Lassen Sie die Agarose bei Raumtemperatur polymerisieren. Schalten Sie den Inkubatorcontroller mindestens eine Stunde vor der Aufnahme ein und stellen Sie die Temperatur auf 28 Grad Celsius ein, um die Gesundheit des Embryos zu erhalten. Sobald sich der Inkubator stabilisiert hat, platziere die Bildgebende Schale mit dem Embryo auf den Probenhalter und verwende ein 10x trockenes Ziel, um die Probe zu visualisieren.

Schalten Sie den Argon-Ionen-Laser ein und stellen Sie die Laserleistung auf 50 % ein. In den Hardwareeinstellungen wählen Sie eine Acht-Bit-Tiefenauflösung, um Bilder aufzunehmen. Anschließend wählen Sie im Erfassungsfeld den Scanmodus der spektralen Erkennung xy, Gamma, Lambda, z aus und stellen Sie das Bildformat auf 512 mal 512 Pixel ein, eine Scangeschwindigkeit von 400 Hertz und einen optischen Zoom von 0,75. Aktivieren Sie die 458-Nanometer-Laserlinie des Argon-Ionenlasers und stellen Sie ihren Intensitätswert auf 8,5 %. Wählen Sie dann einen Hybriddetektor und stellen Sie die Empfindlichkeit auf einen Verstärkungswert von 500 ein.

Öffnen Sie das Dropdown-Menü in der Detektorleiste, um das cyanfarbene Fluoreszenzprotein oder die ECFP-Emissionskurve auszuwählen. Um die YPET-Emissionskurve anzuzeigen, aktivieren Sie einen zweiten Detektor. Wählen Sie dann die gelbe Fluoreszenzprotein-YFP-Emissionskurve aus.

Um Live-Aufnahmen zu beginnen, positionieren Sie den Detektionscursor im Bereich des stärksten YFP-Signals, um die Probe zu visualisieren. Stellen Sie die Start- und Endpositionen der Probendicke im Z-Stack LASX-Fenster ein. Stellen Sie die Eigenschaften des Gammascan-Bereichs so ein, dass sie bei 460 Nanometern beginnen und bei 570 Nanometern der Detektionsreichweite enden.

Definieren Sie die Detektionsbandbreite als fünf Nanometer und die Scan-Schrittgröße als fünf Nanometer. Beginnen Sie mit der Z-Stack-Übernahme. Fügen Sie zwei angepasste Referenzemissionsspektren für CFP und YFP in die im Konfigurationsfenster verfügbare Farbstoffdatenbank ein und speichern Sie, um spektrale Durchlaufzeiten auszuschließen.

Wählen Sie die resultierende spektrale Bilddatei aus der Bildaufnahmesitzung aus und öffnen Sie das Prozessfenster. Als Nächstes wählen Sie im Farbstofftrennungswerkzeug Spektrale Farbabtrennung und konfigurieren Sie die Einstellungen für die Farbabtrennung. In den Dropdown-Listen auf der linken Seite des Dialogs wählen Sie das neue CFP-Emissionsspektrum an erster Stelle und das neue YFP-Emissionsspektrum aus der Spektrumdatenbank.

Im Gamma-Scan der Bilder wird das Bild mit der größten Signalintensität identifiziert. Dann bewegen Sie sich entlang des Z-Scans, um den optischen Abschnitt auszuwählen, der den interessanten Bereich in der Randzone hervorhebt. Aktivieren Sie den ROI-Auswahlmodus in der Randzone des Tierstabs, um den Bereich mit dem besten Spektrum zu definieren.

Klicken Sie im Anzeigefenster auf ROI-Fadenkreuz und passen Sie die Größe des Referenz-ROI im Maßbereich auf 40 Voxel an. Öffne die neu generierte Datei mit den beiden getrennten Kanälen. Erzeugen Sie ein zweidimensionales Projektionsbild aus der dreidimensionalen Bildreihe mit der maximalen Intensitätsprojektion.

Im Prozessfenster wählen Sie 'Schnitt' aus, um Kanäle in zwei separate Dateien zu trennen, den Kanal eins und den Kanal zwei. Im Prozessfenster wählen Sie Bilder kombinieren, wählen Sie dann die Kanal-zwei-Datei und fügen Sie sie in die erste Option ein. Dann wähle ich die Channel-One-Datei aus und füge sie in die zweite Option ein.

Setzen Sie eine Neuskalierung mit dem Faktor fünf ein und wählen Sie die Verhältnis-Operation. Klicken Sie auf Anwenden, um die neue Datei mit dem Ratio-Metrikbild zu generieren. Speichere die Datei für die Datenanalyse.

Importiere die Spektralbild- und Farbstofftrennungsdateien zur Analyse in die Open-Source-Fiji-Software. Konfigurieren Sie Parameter für Auslesemessungen in Fidschi mit Analyze and Set Measurements. Wählen Sie Flächen, integrierte Dichte und mittleren Grauwerte als interessierende Parameter aus.

Mit dem Polygon-Auswahlwerkzeug aus der Werkzeugleiste wählen Sie den Bereich von Interesse aus, der dem Rand der Gastrula entspricht. Klicken Sie fortlaufend auf Analysieren, Tools und ROI Manager, um die ROI xy-Spezifikationen zu speichern. Um Messungen in einem ausgewählten ROI durchzuführen, klicken Sie auf Analysieren und Messen.

Organisieren Sie FRET nach CFP-Verhältniswerte für jeden ROI in einem Arbeitsblatt mit experimentellen Gruppen in Spalten und Rohwerten in Zeilen. Für eine einzelne biologische Replikation erstellen Sie eine Spaltentabelle mit einer Gruppierungsvariable, wobei jede Gruppe durch eine Spalte definiert ist. Am Ende der Gastrulation fixieren Sie die Embryonen durch Immersion in 4%-Paraldehyd, das in PBS für 20 Minuten bei Zimmertemperatur hergestellt wird.

Nach der Fixierung werden die Embryonen mehrmals mit PBS gewaschen. Mit einer Pastorpipette werden die Embryonen seitlich in einem einzigen Brunnen einer 12-Well-Platte mit frischem PBS ausgerichtet. Mit einem Stereomikroskop mit einem 2,7-fachen Vergrößerungsobjektiv, 0,63-fachem Rasterobjektiv und 8,6-fachem Zoomfaktor wird die Bilder im Hellfeldmodus aufgenommen, um das Vorhandensein einer ovalen Form zu bewerten.

Importiere das aufgenommene Embryobild in die Fiji-Software. Um die Achsenlänge des Embryos zu messen, wählen Sie das gerade Werkzeug in der Werkzeugleiste und klicken Sie auf Analysieren, gefolgt von Messung. Nachdem Sie ausgewählte Messungen durchgeführt haben, fügen Sie diese der ROI-Managerliste hinzu und speichern Sie die ROI-Datei.

Exportiere die Daten in ein Arbeitsblatt. Berechnen Sie das Achsenverhältnis, indem Sie die Länge der Hauptachse durch die Länge der kleinen Achse teilen. Berechnen Sie den Mittelwert, die Standardabweichung des Mittelwerts oder den Standardfehler des Mittelwerts verschiedener Replikate.

Unsere Live-FRET-Pipeline im Zebrafisch ermöglicht eine frühzeitig sensible Erkennung pathogener ERK-Signalaktivierung, unterstützt die Varianteninterpretation und die Effizienz von MEK-Inhibitoren.