Extraktion mykobakterieller DNA mittels Bead-Beating in kundenspezifischem Puffer, gefolgt von NGS-Workflow

Unsere diagnostische Forschung konzentriert sich auf die Verbesserung der Erkennung von Arzneimittelresistenzen bei Tuberkulose in einem Umfeld mit begrenzten Ressourcen, wobei der Schwerpunkt auf Schnelligkeit und Pragmatismus liegt. In der TB-Diagnostik gibt es umfassendere genotypische Assays und sogar eine Reihe neuer phänotypischer Schnelltests, und es gibt konsequente Bestrebungen, diese Tests näher an den Behandlungsort zu bringen. Aber es gibt eine Reihe von pragmatischen Hindernissen, die immer noch bestehen.

Ressourcenprobleme von Reagenzien über die Infrastruktur bis hin zur Logistik stellen nach wie vor erhebliche Hindernisse dar. Mit allem, was über die technische Raffinesse eines Cepheid Xpert Assays hinausgeht, ist die Standardisierung des Protokolls in verschiedenen Umgebungen schwierig. Die MTB-DNA-Extraktion, wie sie in dieser Arbeit hier beschrieben wird, ist ein Paradebeispiel dafür.

Es besteht ein dringender Bedarf, die sequenzierungsbasierte TB-Diagnostik auszubauen, aber vielen Laboren fehlt es immer noch an einer zuverlässigen Methode, um qualitativ hochwertige DNA zu extrahieren. Unser Ziel ist es, eine Methode zu teilen, die einfach, praktisch und für ressourcenarme Point-of-Care-Umgebungen geeignet ist. Hier stellen wir ein einfaches, kostengünstiges Protokoll vor, das für den Einsatz in ressourcenbegrenzten Umgebungen entwickelt wurde.

Es wurde für NGS-Anwendungen validiert und ist mit automatisierten Liquid-Handling-Systemen kompatibel. Kombinieren Sie zunächst Natriumchloridlösung, Trishydrochlorid-Puffer, Triton X 100 und EDTA, um den Triton-Puffer herzustellen. Unter Rühren mischen und Reinstwasser hinzufügen, bis ein Endvolumen von 100 Millilitern erreicht ist.

Filtern Sie den Puffer vor der Verwendung. Bereiten Sie als Nächstes 100 Milliliter Tris-EDTA-Puffer mit niedrigem EDTA-Gehalt vor, indem Sie einen Milliliter einmolaren Tris-HCl und 20 Mikroliter 0,5-molaren EDTA kombinieren. Mischen und mit Reinstwasser auffüllen, um ein Endvolumen von 100 Millilitern zu erreichen.

Sterilisieren Sie dann den Puffer mit dem Filter. Um die Lyseröhrchen vorzubereiten, schneiden Sie mit einer Skalpellklinge vorsichtig den Boden eines 1,5-Milliliter-Schraubverschlussröhrchens knapp unterhalb des Wendepunkts ab. Schneiden Sie die Spitze von einer P1000-Pipettenspitze ab und formen Sie am Ende einen V-förmigen Keil.

Klemmen Sie den abgeschnittenen Boden des Schraubverschlussröhrchens in die V-förmige Pipettenspitze, um eine Schaufel zu formen. Füllen Sie einen sterilen Behälter mit 0,1 Millimeter großen Zirkonoxid-Silikatkügelchen. Füllen Sie mit dem vorbereiteten Löffel etwa 200 Milligramm Kügelchen in 1,5-Milliliter-Schraubverschlussröhrchen um.

Für die Vorbereitung der Bakterienzellkultur werden fünf Milliliter Mycobacterium tuberculosis-Kultur in ein konisches 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt. Zentrifugieren Sie es 10 Minuten lang bei maximaler Drehzahl. Verwenden Sie nun eine serologische 10-Milliliter-Pipette, um vorsichtig alle bis auf etwa 500 Mikroliter des Überstands zu entfernen, ohne das Pellet zu stören.

Verwenden Sie eine P1000-Pipette, um den restlichen Überstand zu entfernen. Suspendieren Sie das Pellet in 350 Mikrolitern speziellem Triton-Puffer und mischen Sie es dann gut, indem Sie auf und ab pipettieren. Erhitzen Sie die Probe in einem trockenen Wärmebad 30 Minuten lang bei 95 Grad Celsius.

Zur Vorbereitung des Sputums werden ein bis fünf Milliliter Sputumprobe in ein steriles 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen gegeben. Um eine Dithiothreitol-Verflüssigung durchzuführen, geben Sie vier Volumen 10-millimolares Dithiothreitol in die Sputumprobe und wirbeln Sie sie dann 30 Sekunden lang gründlich auf. Zentrifugieren Sie die Probe 10 Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit.

Verwenden Sie dann eine serologische 10-Milliliter-Pipette, um alle bis auf 500 Mikroliter des Überstands zu verwerfen. Entfernen Sie den Rest des Überstands mit einer P1000-Pipette, ohne das Pellet zu stören. Resuspendieren Sie das Pellet in 350 Mikrolitern benutzerdefiniertem Triton-Puffer.

Um die NALC-Natriumhydroxid-Verflüssigung durchzuführen, geben Sie vier Volumen der NALC-Natriumhydroxidlösung in die Sputumprobe. Die Mischung 30 Sekunden lang aufreiben. Inkubieren Sie das Röhrchen dann sieben Minuten lang bei Raumtemperatur.

Geben Sie nun PBS bis zur 50-Milliliter-Marke hinzu. Den Inhalt des Röhrchens gut vermischen, dann das Röhrchen 10 Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugieren. Nach der Zentrifugation wird der Überstand mit einer serologischen 50-Milliliter-Pipette wie oben gezeigt verworfen.

Dann resuspendieren Sie das Pellet in 350 Mikrolitern benutzerdefiniertem Triton-Puffer. Zuerst werden 350 Mikroliter der inaktivierten Probe in ein beschriftetes 1,5-Milliliter-Schraubverschlussröhrchen mit 250 Mikrolitern 0,1 Millimeter Zirkonoxid-Silikatkügelchen überführt. Bead schlug das Lysat 45 Sekunden lang mit 6,5 Metern pro Sekunde mit zwei Minuten Pause zwischen den Zyklen.

Zentrifugieren Sie die Probe zwei Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit und überführen Sie dann 150 Mikroliter des Überstands in ein neues markiertes Röhrchen. Als nächstes werden magnetische Kügelchen, die 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gleichgesetzt wurden, mit einem Vortex gereinigt, um sie wieder aufzuwirbeln. Übertragen Sie 180 Mikroliter magnetische Kügelchen auf die DNA-Probe.

Zum Mischen 10 Mal auf und ab pipettieren. Nach einer zweiminütigen Inkubation bei Raumtemperatur stellen Sie das Röhrchen auf ein Magnetgestell und warten Sie zwei Minuten, bis die Lösung klar ist. Verwenden Sie dann eine 200-Mikroliter-Pipette, um den Überstand zu entsorgen.

Während sich das Röhrchen noch auf dem Magnetgestell befindet, fügen Sie 500 Mikroliter frisch zubereitetes 70%iges Ethanol entlang der gegenüberliegenden Wand hinzu und warten Sie 30 Sekunden lang. Entfernen Sie am Ende der letzten Wäsche Ethanolreste mit einer 10-Mikroliter-Pipette und trocknen Sie sie zwei Minuten lang an der Luft. Sobald die Perlen undurchsichtig werden, nehmen Sie die Tube aus dem Magnetgestell.

In 20 Mikrolitern Tris-Puffer mit niedrigem EDTA-Gehalt resuspendieren. Mischen Sie durch Pipettieren oder Vortexen, um sicherzustellen, dass alle Kügelchen in Lösung sind, bevor Sie eine fünfminütige Inkubation bei Raumtemperatur durchführen. Legen Sie dann das Röhrchen zwei Minuten lang auf ein Magnetgestell, bis es klar ist.

Übertragen Sie dann weniger als 20 Mikroliter der eluierten DNA in ein neues markiertes Röhrchen, um eine Verschleppung von Kügelchen zu vermeiden. Um die mykobakterielle DNA mit einer quantitativen PCR zu quantifizieren, die auf 99 Nukleotide des mykobakteriellen atpE abzielt, wird ein QPCR-Mastermix auf Eis zusammengebaut. Passen Sie den Mastermix basierend auf der Anzahl der Proben und Standards an, einschließlich einer Überschreitung von 10 %, um Pipettierverluste zu berücksichtigen.

Lassen Sie den Thermocycler 60 Sekunden lang bei 95 Grad Celsius laufen, gefolgt von 35 Zyklen mit 95 Grad Celsius für 10 Sekunden und 60 Grad Celsius für 30 Sekunden mit einer Rampenrate von 2,11 Grad Celsius pro Sekunde. Führen Sie alle Proben, Standards und Kontrollen in dreifacher Ausfertigung durch. Hier ergaben Mycobacterium tuberculosis-Kulturen die höchsten DNA-Konzentrationen unter allen getesteten Bedingungen.

Sputumproben zeigten zunehmend niedrigere DNA-Ausbeuten und eine zunehmende Variation mit abnehmendem Bakterieneintrag, insbesondere in der Gruppe mit 10.000 Bakterien.