Name: Extraktion mykobakterieller DNA mittels Bead-Beating in kundenspezifischem Puffer, gefolgt von NGS-Workflow (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-13T14:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Lernen Sie eine schnelle DNA-Extraktion aus Mycobacterium tuberculosis mittels Bead-Beating und magnetischer Bead-Reinigung. Diese Methode eignet sich für NGS-Workflows und ressourcenarme Labore.

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Diese Studie wurde an der University of California San Francisco (UCSF) mit Genehmigung des Institutional Biosafety Committee (BUA #BU198320-01GBUA/BABB) durchgeführt und folgt den Forschungsethikrichtlinien der UCSF. Wir erhielten Sputumreste, die von Discovery Life Sciences im Rahmen eines vom IRB genehmigten Waiver of Consent-Protokolls von Personen mit Atemwegserkrankungen ohne TB entnommen wurden.
1. Vorbereitung der Puffer
<ol>
	<li>Benutzerdefinierter Triton-Puffer (Tabelle 1): Um 100 ml benutzerdefinierten Triton-Puffer herzustellen, beginnen Sie mit der Kombination von 2 ml 5 M NaCl, 1 ml 1 m Tris-HCl (pH 8), 1 ml Triton X-100 und 0,2 ml 0,5 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA). Fügen Sie Reinstwasser hinzu, um das Gesamtvolumen auf 100 mL zu bringen. Filter vor Gebrauch sterilisieren. Der letzte Puffer enthält 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA und 1 % Triton X-100.</li>
	<li>Niedriger EDTA-TE-Gehalt (Tabelle 2): Zur Herstellung von 100 ml Puffer mit niedrigem EDTA-Gehalt kombinieren Sie 1 ml 1 M Tris-HCl (pH 8) und 0,02 ml 0,5 M EDTA. Fügen Sie Reinstwasser hinzu, um das Gesamtvolumen auf 100 mL zu bringen. Der letzte Puffer enthält 10 mM Tris-HCl und 0,1 mM EDTA.</li>
</ol>
2. Vorbereitung der Lyseröhrchen
<ol>
	<li>Schneiden Sie mit einer Skalpellklinge vorsichtig den Boden eines 1,5-ml-Schraubverschlussröhrchens direkt unterhalb des Wendepunkts ab.</li>
	<li>Schneide die Spitze von einer P1000-Spitze ab, schneide einen V-förmigen Keil am Ende ab und klemme den vorbereiteten Boden des Schraubverschlussrohrs darin ein. In Abbildung 1 finden Sie ein Diagramm des Scoops.</li>
	<li>Füllen Sie einen sterilen Behälter (z. B. ein Reservoir oder eine Petrischale) mit 0,1 mm Zirkonoxid-Silikat-Kügelchen und verteilen Sie mit dem vorbereiteten Löffel einen Löffel voller Kügelchen (~200 mg) in 1,5-ml-Schraubverschlussröhrchen.</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68037/68037fig1.jpg"> 
Abbildung 1: Interne Raupenverteilung. Die Schaufel wurde für den einfachen Transfer von ~200 mg 0,1 mm Zirkoniumkügelchen in Verarbeitungsröhrchen entwickelt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68037/68037fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
3. Vorbereitung der Eingabe
HINWEIS: Die gesamte Probenvorbereitung sollte gemäß den Biosicherheitsprotokollen Ihrer Einrichtung durchgeführt werden. Wir empfehlen dringend, infektiöse Materialien in einer Biosicherheitswerkbank der Klasse II (BSC) zu handhaben, um das Risiko einer Aerosolexposition zu minimieren.
<ol>
	<li>Bakterielle Zellkultur<ol>
		<li>Zentrifugieren Sie ~ 5 mL M. tuberculosis-Kultur (entweder MGIT oder trübe Flüssigkultur) in einem konischen 15-ml-Zentrifugenröhrchen bei maximaler Geschwindigkeit (≥ 3.000 x g) für 10 Minuten.</li>
		<li>Entfernen Sie mit einer serologischen 10-ml-Pipette vorsichtig alle bis auf ~ 500 μl des Überstands, ohne das Pellet zu beschädigen. Entfernen Sie den restlichen Überstand mit einer P1000-Pipette, ohne das Pellet zu stören.</li>
		<li>Resuspendieren Sie das Pellet in 350 μl speziellem Triton-Puffer, indem Sie es auf und ab pipettieren. Falls erforderlich (d. h. um Proben für die Verarbeitung außerhalb einer BSL-3 zu entnehmen), inaktivieren Sie die Probe gemäß den Standardarbeitsanweisungen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Vorbereitung des Auswurfs<ol>
		<li>1-5 ml Sputumprobe (spontan oder induziert) in ein steriles 50-ml-Zentrifugenröhrchen überführen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DVB-T-Verflüssigung<ol>
		<li>Geben Sie vier Volumina mit 100 mM Dithiothreitol in die Sputumprobe (Volumen kann variieren). Wenn Sie ein handelsübliches Reagenz verwenden, befolgen Sie die Verdünnungsanweisungen des Herstellers.</li>
		<li>30 s lang gründlich vortexen. Bei Raumtemperatur (20-25 °C) 7 Min. inkubieren. Erneut für 30 s wirbeln.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 3.3.1. und 3.3.2. 1x, für sehr viskose Proben, führen Sie bis zu 5 Inkubations-Wirbelzyklen durch.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie bei maximaler Drehzahl (≥ 3.000 x g) für 10 min. Entsorgen Sie mit einer serologischen 10-ml-Pipette vorsichtig alle bis auf ~ 500 μl des Überstands. Entfernen Sie den restlichen Überstand mit einer P1000-Pipette, ohne das Pellet zu stören.</li>
		<li>Resuspendieren Sie das Pellet in 350 μl speziellem Triton-Puffer.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>NALC-NaOH-Verflüssigung<ol>
		<li>Befolgen Sie zur Herstellung der NALC-NaOH-Lösung die Anweisungen des Herstellers zur Vorbereitung und Verdünnung.</li>
		<li>Geben Sie vier Volumina NALC-NaOH-Lösung in die Sputumprobe (spontan oder induziert, das Volumen kann variieren).</li>
		<li>30 s lang wirbeln. Bei Raumtemperatur (20-25 °C) 7 Min. inkubieren. Wiederholen Sie die Schritte 3.4.1 und 3.4.2. 1x. Bei sehr viskosen Proben können bis zu 5 Inkubations-Vortex-Zyklen durchgeführt werden.</li>
		<li>Geben Sie PBS bis zur 50-ml-Markierung. Zum Mischen kurz vorziehen. Zentrifugieren Sie bei maximaler Drehzahl (≥ 3.000 x g) für 10 min.</li>
		<li>Entsorgen Sie mit einer serologischen 50-ml-Pipette vorsichtig alle bis auf ~ 500 μl des Überstands. Entfernen Sie den restlichen Überstand mit einer P1000-Pipette, ohne das Pellet zu stören.</li>
		<li>Resuspendieren Sie das Pellet in 350 μl speziellem Triton-Puffer. Falls erforderlich (d. h. um Proben für die Verarbeitung außerhalb einer BSL-3 zu entnehmen), inaktivieren Sie die Probe gemäß den Standardarbeitsanweisungen.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Extraktion von DNA
<ol>
	<li>Übertragen Sie die inaktivierte Bakteriensuspension (350 μl aus Schritt 3) in ein neues, gut markiertes 1,5-ml-Schraubverschlussröhrchen mit ~250 μl 0,1 mm Zirkonoxid-Silikat-Kügelchen.</li>
	<li>Die Wulst schlug das Lysat bei 6,5 m/s für 45 s mit 2 min Pause zwischen den Läufen. Wiederholen Sie den Vorgang für insgesamt drei Bead-Beat-Zyklen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie 2 Minuten lang bei maximaler Drehzahl (≥ 12.000 x g) und überführen Sie 150 μl des Überstands in ein neues, gut markiertes Röhrchen. Achten Sie darauf, keine Kügelchen oder Zellreste zu übertragen.</li>
	<li>Lassen Sie die Reinigungsmagnetbeads 30 Minuten lang auf Raumtemperatur ausgleichen und wirbeln Sie sie gründlich auf, um eine vollständige Resuspension vor der Verwendung zu gewährleisten.</li>
	<li>Fügen Sie 180 μl (1,2-faches Volumen) der magnetischen Reinigungskügelchen hinzu und mischen Sie, indem Sie 10x auf und ab pipettieren. 2 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Auf ein Magnetgestell legen und ~ 2 Minuten warten, bis die Lösung klar ist. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig mit einer P200-Pipette, ohne die Magnetkügelchen zu stören.</li>
	<li>Während sich das Röhrchen noch auf dem Magnetgestell befindet, fügen Sie 500 μl frisch zubereitetes Ethanol mit 70 % (v/v) hinzu und geben Sie es entlang der gegenüberliegenden Röhrchenwand auf die Magnetkügelchen. Warten Sie 30 s.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 4.5. - 4.7. für insgesamt zwei Wäschen. Entfernen Sie am Ende des letzten Waschgangs Ethanolreste mit einer P10-Pipette. Die Kügelchen ~ 2 min kurz trocknen lassen.</li>
	<li>Unmittelbar nachdem das Bead-Pellet undurchsichtig geworden ist, nehmen Sie das Röhrchen aus dem Magnetgestell und suspendieren Sie es erneut in 20 μl Low EDTA Tris Buffer. Lassen Sie die Kügelchen nicht trocken und rissig werden.</li>
	<li>Mischen Sie durch Pipettieren oder Vortexen, um sicherzustellen, dass alle Kügelchen in Lösung sind. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Auf ein Magnetgestell legen und ~ 2 Minuten warten, bis die Lösung klar wird. Übertragen Sie die eluierte DNA in ein neues, gut markiertes Röhrchen für die nachgelagerte Analyse. Aspirieren Sie &lt;20 μl extrahierte DNA, um eine Verschleppung durch magnetische Beads zu vermeiden.</li>
</ol>
5. qPCR-Zählung von mykobakterieller DNA
<ol>
	<li>Zur Quantifizierung der mykobakteriellen DNA mittels einer quantitativen PCR, die auf 99 Nukleotide des mykobakteriellen atpE (Rv1305) abzielt, wird ein 10-μl-Reaktionsgemisch pro Probe auf Eis zusammengestellt, das 5 μl Universalsonden-Mastermix (2x), je 0,4 μl Forward-Primer (5'-AATTCCTGGTGTAGCGGTGG-3', 10 μM) und Reverse-Primer (5'-GTTTACGGCGTGGACTACCA-3', 10 μM), 0,2 μL TaqMan-Sonde (5'-VIC-AGGAGGAACACCGGTGGCGA-MGB-3', 10 μM), 2 μl DNA-Template und 2 μl nukleasefreies Wasser (Tabelle 3).</li>
	<li>Die Reaktion wird unter den folgenden Bedingungen des Temperaturwechsels durchgeführt: anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 60 s, gefolgt von 35 Zyklen von 95 °C für 10 s und 60 °C für 30 s (mit einer Erfassung hier mit einer Rampenrate von 2,11 °C/s; Tabelle 4). HINWEIS: In diesem Fall wurde die qPCR unter Verwendung eines TaqMan-Assays mit VIC-markierter Sonde auf einem QuantStudio 3 Real-Time PCR-System durchgeführt.</li>
	<li>Führen Sie alle Stichproben, Standards und Kontrollen in technischen Tripplikaten aus. Erstellung von Standardkurven unter Verwendung serieller Verdünnungen von gereinigter M. tuberculosis-DNA . Führen Sie eine relative Quantifizierungsanalyse mit Hilfe einer Analysesoftware durch.</li>
	<li>Exportieren Sie die resultierenden relativen Quantifizierungswerte in das CSV-Format und visualisieren Sie sie mit R Studio (Version 2024.09.1+394), um Boxplots zu erstellen, in denen DNA-Ausbeuten über verschiedene Extraktionsmethoden hinweg verglichen werden.</li>
</ol>

<ol><li>Jouet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+amplicon+sequencing+for+culture-free+prediction+of+susceptibility+or+resistance+to+13+anti-tuberculous+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">Deep amplicon sequencing for culture-free prediction of susceptibility or resistance to 13 anti-tuberculous drugs.</a> Eur Respir J. 57 (3), 2002338(2021).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>0,1 mm Zirkonoxid-Silikat-Perlen</td><td>Biospec-Produkte</td><td>Artikel-Nr.: 11079101z</td><td>Kügelchen, die für den Bead-Beating-Schritt zur Lyse von Mykobakterienzellen verwendet werden</td></tr><tr><td>AMPure XP Perlen</td><td>Beckman Coulter</td><td>Nr. A63880</td><td>Magnetische Kügelchen für die DNA-Aufreinigung nach der Lyse</td></tr><tr><td>EDTA (0,5 M, pH 8,0) &nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9260G</td><td>Kundenspezifische Triton/Low-EDTA-Pufferkomponenten</td></tr><tr><td>Fastprep 24</td><td>MPbio, Vereinigte Staaten von Amerika</td><td>116004500</td><td>Ausrüstung für das Wulstschlagen mit 6,5 m/s</td></tr><tr><td>Vorwärts-Grundierung</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Kundenspezifische Synthese</td><td>Primer-Sequenz: AATTCCTGGTGTAGCGGTGG</td></tr><tr><td>H2O (Wasser, molekularbiologische Qualität)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Artikel-Nr.: BP2819-1</td><td>Kundenspezifische Triton/Low-EDTA-Pufferkomponenten</td></tr><tr><td>Luna Universalsonde</td><td>Neuengland Biolabore</td><td>M3004</td><td>qPCR-Reagenz für die Zählung mykobakterieller DNA</td></tr><tr><td>MycoPrep Kit</td><td>BD</td><td>SKU/REF-240863</td><td>BD MycoPrep Probenaufschluss für die NALC-NaOH-Sputumverarbeitung</td></tr><tr><td>NaCl (Natriumchlorid, 5M-Lösung)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9759</td><td>Kundenspezifische Triton/Low-EDTA-Pufferkomponenten</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Millipore Sigma</td><td>Nr. P2272</td><td>Sputum-Verarbeitung</td></tr><tr><td>Umgekehrte Grundierung</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Kundenspezifische Synthese</td><td>Primer-Sequenz: GTTTACGGCGTGGACTACCA</td></tr><tr><td>TaqMan Sonde</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Kundenspezifische Synthese</td><td>Sondensequenz: AGGAGGAACACCGGTGGCGA</td></tr><tr><td>Tris-HCl (1M, pH 8,0)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9855G</td><td>Kundenspezifische Triton/Low-EDTA-Pufferkomponenten</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28314</td><td>Kundenspezifische Triton/Low-EDTA-Pufferkomponenten</td></tr></tbody></table>

extraktion mykobakterieller dna mittels bead-beating in kundenspezifischem puffer, gefolgt von ngs-workflow

Mycobacterial DNA Extraction using Bead Beating in Custom Buffer Followed by NGS Workflow

Wir testeten das DNA-Extraktionsprotokoll sowohl an kultivierten M. tuberculosis - als auch an M . tuberculosis-Sdot-Sputumproben (n = 3 für jede Bedingung). Unter Verwendung von kultiviertem M. tuberculosis H37Rv mc² 7901 standardisierten wir den Input auf 8,4 x 106 Zellen pro 50 μL, was 1 mL einer MGIT-Kultur bei 200 GU entspricht. Für Sputum-Experimente haben wir 1 ml Sputum von Personen mit Nicht-TB-Atemwegserkrankungen (kommerziell erhältlich) mit zwei verschiedenen Bakterienkon...

Extraktion mykobakterieller DNA mittels Bead-Beating in kundenspezifischem Puffer, gefolgt von NGS-Workflow

Tuberculosis is a deadly disease, and the emergence of antibiotic drug resistance in the causative agent bacterium, Mycobacterium tuberculosis, worsens ...

mycobacterial-dna-extraction-using-bead-beating-custom-buffer

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Der Vergleich und die Optimierung zweier pflanzenorganischer DNA-Anreicherungsmethoden werden vorgestellt: traditionelle Differentialzentrifugation und Fraktionierung der gesamten gDNA auf Basis des Methylierungsstatus. Wir beurteilen die resultierende DNA-Quantität und -Qualität, zeigen die Leistung in der Kurzzeit-Sequenzierung der nächsten Generation und diskutieren das Potenzial für den Einsatz in der Langzeit-Einzelmolekül-Sequenzierung.

Optimierung und Vergleichsanalyse von pflanzlichen organellaren DNA-Anreicherungsmethoden Geeignet für die Sequenzierung der nächsten Generation

Nanopore Technologie für Sequenzierung Biomoleküle hat breite Anwendungen in den Lebenswissenschaften einschließlich der Identifizierung von Krankheitserregern, Lebensmittelüberwachung Sicherheit, Genomanalyse, metagenomic Umweltüberwachung und Charakterisierung von bakteriellen Antibiotika-Resistenz. In diesem Artikel wird das Verfahren für die metagenomische Boden DNA-Sequenzierung zur Speziesidentifizierung mit Nanopore Sequenzierung Technik demonstriert.

Nanopore DNA-Sequenzierung für metagenomische Bodenanalyse

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Amplikons Sequenzdaten von Boden, Rhizosphäre und Wurzel Endosphere mikrobiome zu erhalten. Diese Informationen kann verwendet werden, um die Zusammensetzung und Vielfalt der Anlage verbundenen mikrobieller Gemeinschaften zu untersuchen, und eignet sich für den Einsatz mit einer Vielzahl von Pflanzenarten.

Die Wurzel Mikrobiom zu erkunden: Extrahieren von Bakteriengemeinschaft Daten aus dem Boden, die Rhizosphäre und die Wurzel Endosphere

Long-Read Sequenzen erleichtern erheblich die Montage komplexer Genome und Charakterisierung von strukturellen Variation. Wir beschreiben eine Methode um ultra-lange Sequenzen durch Sequenzierung Nanopore-basierte Plattformen zu generieren. Das Konzept nimmt eine optimierte DNA-Extraktion, gefolgt von modifizierten Bibliothek Vorbereitungen, Hunderte von Kilobase liest mit moderaten Abdeckung aus menschlichen Zellen zu generieren.

Ultra-lange lesen Sequenzierung für ganze genomische DNA-Analysen

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Mikrobiota-Analyse mit zweistufiger PCR- und 16S-rRNA-Gensequenzierung der nächsten Generation

Hier wird ein DNA-Extraktionsprotokoll mit magnetischen Perlen beschrieben, um qualitativ hochwertige DNA-Extraktionen aus Moskitos herzustellen. Diese Extraktionen eignen sich für einen nachgelagerten Next-Generation-Sequencing-Ansatz.

Ein magnetperlenbasiertes Moskito-DNA-Extraktionsprotokoll für die Sequenzierung der nächsten Generation

Die Genexpression wird durch Wechselwirkungen von Genpromotoren mit distalen regulatorischen Elementen reguliert. In dieser Arbeit beschreiben wir, wie Low Input Capture Hi-C (liCHi-C) die Identifizierung dieser Interaktionen in seltenen Zelltypen ermöglicht, die bisher nicht messbar waren.

Ein integrierter Workflow zur Untersuchung der Promotor-zentrierten raum-zeitlichen Genomarchitektur in seltenen Zellpopulationen

Wir stellen eine optimierte Methode zur DNA-Extraktion aus dekontaminiertem Sputum vor, bei der eine matrixbasierte Extraktionsmethode in Kombination mit einer magnetischen Bead-Aufreinigung für die nachgelagerte gezielte Next-Generation-Sequenzierung von Mycobacterium tuberculosis verwendet wird.

Matrixbasierte DNA-Extraktion für gezieltes Next-Generation-Sequencing an dekontaminierten Sputumproben

Dieses Protokoll beschreibt die CTAB-Methode zur Gewinnung hochwertiger DNA aus Mykobakterien und überwindet Herausforderungen durch ihre robusten, mykolsäurereichen Zellwände. Der Prozess umfasst enzymatische Verdauung, Zelllyse mit CTAB und DNA-Reinigung durch organische Extraktion und Ethanol-Fällung. Diese Methode erzeugt DNA, die für molekulare Studien geeignet ist und für mykobakterielle Forschung zuverlässig ist.

Ganzgenom-Deoxyribonukleinsäureextraktion aus Mycobacterium-Arten mittels der Cetyltrimethylammoniumbromid-Technik

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Sequenzierung des gesamten Genoms von bakteriellen sexuell übertragbaren Infektionen aus klinischen Proben mittels Zielanreicherung ermöglicht. Diese neuartige, syndromische Panel-basierte Methode überwindet die Herausforderungen des reichlich vorhandenen menschlichen DNA-Spektrums und der geringen bakteriellen Belastung und erleichtert die genomische Überwachung von Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum und Mycoplasma...

Generierung ganzer bakterieller Genome aus klinischen Proben unter Verwendung eines Target Enrichment-Workflows

Die aktuelle Studie beschreibt einen Workflow für die Nanoporensequenzierung von Plasmiden, wenn die chromosomale Sequenz bereits bekannt oder von Interesse ist. Ein anfänglicher Plasmid-DNA-Anreicherungsschritt sorgt für eine optimale Plasmidsequenztiefe und maximiert die Anzahl der pro Flusszelle sequenzierbaren Proben.

Langlesen-Plasmid-Sequenzierung und -Montage mit Workflows auf Basis von Nanoporensequenzierungen

Lernen Sie eine schnelle DNA-Extraktion aus Mycobacterium tuberculosis mittels Bead-Beating und magnetischer Bead-Reinigung. Diese Methode eignet sich für NGS-Workflows und ressourcenarme Labore.

Extraktion mykobakterieller DNA mittels Bead-Beating in kundenspezifischem Puffer, gefolgt von NGS-Workflow

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