Transmissionselektronenmikroskopie als Visualisierungstechnik zur Analyse der zirkadianen synaptischen Plastizität im Fasskortex der Maus

Das vorgestellte Protokoll beschreibt den Einsatz der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) zur Quantifizierung zirkadianer Veränderungen im Zylinderkortex der Maus, wobei der Schwerpunkt auf der Synapsenzahl und der Morphologie der dendritischen Wirbelsäule liegt.

Wir interessieren uns für die neuronale Plastizität, insbesondere für zirkadiane Veränderungen der Plastizität von Synapsen, Neuronen und Gliazellen. Wir versuchen die Frage zu beantworten, wie Synapsen am Tag und in der Nacht und unter pathologischen Bedingungen transformiert werden. Die neuesten Entwicklungen in unserem Studienbereich sind die Verwendung verschiedener genetischer Werkzeuge zur Manipulation der Genexpression, auch die Verwendung von Methoden zur Visualisierung von Veränderungen im Gehirn, sowie die Verwendung einer wachsenden Anzahl von Tiermodellen zur Untersuchung neurodegenerativer Erkrankungen. Wir haben mit Hilfe des Elektronentransmissionsmikroskops herausgefunden, dass sich die Anzahl der Synapsen in der Röhrenrinde von Mäusen im Laufe des Tages und der Nacht ändert. Und dieser Rhythmus ist auch zirkadian, zumindest bei hemmenden Synapsen. Da es sich um hemmende Synapsen handelt, nimmt die Anzahl während der Nacht zu, während die erregenden Synapsen im Laufe des Tages zunehmen. Ähnliche Veränderungen haben wir im Gehirn der Fruchtfliege gefunden. Bei dieser Art ändert sich auch die Anzahl der Synapsen im Laufe des Tages und der Nacht. Darüber hinaus haben wir strukturelle Veränderungen in der Form von Neuronen und Gliazellen festgestellt.

[Erzähler] Nehmen Sie zunächst das Kleinhirn der Maus und teilen Sie das Gehirn in zwei Hemisphären. Wählen Sie eine Hemisphäre und richten Sie sie so aus, dass die Abschnitte tangential zum Zylinderkortex geschnitten werden können. Schneiden Sie dann die Abschnitte mit einer Dicke von 60 Mikrometern und überführen Sie sie in eine Lösung, die 0,1-molaren Phosphatpuffer und Fixiermittel im Verhältnis eins zu fünf enthält. Untersuchen Sie die Schnitte unter einem Lichtmikroskop und sammeln Sie nur die Schnitte, die den Fassfeldkortex deutlich zeigen. Übertragen Sie die Abschnitte mit einem Pinsel vorsichtig in eine kleine Petrischale aus Glas. Spülen Sie die Gehirnabschnitte mit 0,1-molarem Cacodylat aus. Fixieren Sie dann die Abschnitte in 1 % Osmiumtetroxid in 0,1 molaren Cacodylatpuffer mit 1,5 % Kaliumferricyanid. Sobald die Schnitte in destilliertem Wasser gespült sind, verwenden Sie eine Spritze mit einem 25-Millimeter-Filter, um 70 % Ethanol mit 1 % Uranylacetat langsam in jede Petrischale mit Taschentüchern zu geben. Nach der Inkubation über Nacht in 70 % Ethanol bei vier Grad Celsius waschen Sie das Taschentuch mit 80 %, 90 % und 100 % Ethanol. Waschen Sie dann die Taschentücher zweimal für jeweils 10 Minuten in Propylenoxid. Ersetzen Sie anschließend Propylenoxid durch zwei Milliliter einer Eins-zu-Eins-Mischung aus Poly/Bed-Harz und Propylenoxid. Mit einem Deckel abdecken und 40 Minuten inkubieren. Betten Sie die Gehirnabschnitte in zwei Milliliter einer Drei-zu-Eins-Mischung aus Poly/Bed-Harz und Propylenoxid ein. Zugedeckt 1,5 Stunden ziehen lassen. Schneiden Sie dann die ACLAR-Folie in Stücke in der Größe eines Standard-Objektträgers. Tragen Sie mit einer Kunststoffpipette eine kleine Menge Harz auf jedes ACLAR-Folienstück auf. Übertragen Sie mit einem Pinsel die Gehirnabschnitte aus der Petrischale auf das Harz auf der ACLAR-Folie. Betten Sie jeden Abschnitt zwischen zwei ACLAR-Filmen ein und inkubieren Sie, um zu polymerisieren. Fotografieren Sie mit einem Lichtmikroskop mit einem zweifachen Objektiv die eingebetteten Hirnabschnitte. Um die Bilder zu öffnen, klicken Sie auf Datei und Öffnen, wählen Sie die Bilder aus, während Sie die Umschalttaste gedrückt halten, und klicken Sie auf Öffnen. Beginnen Sie mit dem Stapeln von Bildern aus dem Kortex. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf Ebene 1 in jedem Bild, wählen Sie Ebene duplizieren und geben Sie die Bildnummer als Namen in das Dialogfeld ein. Wählen Sie ein Bild als Zieldatei aus und klicken Sie auf OK. Verwenden Sie als Nächstes das Verschieben-Werkzeug, um die Bilder manuell auszurichten, und passen Sie die Ausrichtung nach Bedarf mit Bearbeiten, Transformieren, Drehen oder Spiegeln an. Für feinere Anpassungen verwenden Sie die Optionen "Bearbeiten", "Transformieren", "Verzerren" und verschieben Sie die Ecken einzeln, um sie an anatomische Orientierungspunkte anzupassen. Legen Sie im Ebenenbedienfeld den Füllmodus der obersten Ebene auf Überlagerung fest, um die Ausrichtung zu erleichtern. Verwenden Sie in jedem Abschnitt, in dem der Zylinderkortex angezeigt wird, ein Stereomikroskop, um den ausgewählten Zylinder zu identifizieren, und schneiden Sie ihn zusammen mit dem angrenzenden Zylinder mit einer Rasierklinge aus. Nachdem Sie den Abschnitt in einen Harzblock eingebettet haben, sammeln Sie die ultradünnen Abschnitte auf Formvar-beschichteten Einschlitz-Nickelgittern. Nachdem Sie den TEM-Bildstapel wie zuvor gezeigt ausgerichtet haben, definieren Sie den Analysebereich. Klicken Sie auf "Ebene", dann auf "Neu" und "Ebene" und dann auf "OK". Wählen Sie das Rechteck-Werkzeug aus und gehen Sie zu "Ebene", "Ebenenstil", "Kontur". Legen Sie die Farbe, die Dicke und die Position der Kontur auf "innen" fest und klicken Sie dann auf "OK". Zeichnen Sie nun ein Rechteck, um die Analysegrenze zu definieren, und wählen Sie 0 % füllen. Um eine neue Ebene für Anmerkungen hinzuzufügen, wählen Sie "Ebene", "Neu", "Ebene" und klicken Sie dann auf "OK". Verwenden Sie das Pinselwerkzeug, um Synapsen auf dieser Ebene zu markieren. Verwenden Sie das Zoom-Werkzeug und das Hand-Werkzeug, um Präzision beim Kommentieren zu gewährleisten. Öffnen Sie nun den Bildstapel, der für die 3D-Rekonstruktion vorgesehen ist. Wählen Sie das Freistellungswerkzeug aus, markieren Sie den Bereich mit dem dendritischen Rücken auf dem Stapel und drücken Sie die Eingabetaste, um diesen Bereich in allen sichtbaren Ebenen zuzuschneiden. Wenn Sie jeweils nur eine Ebene sichtbar machen möchten, schalten Sie das Augensymbol im Ebenenbedienfeld um. Klicken Sie auf Datei, Speichern unter, benennen Sie die Datei, wählen Sie das JPG-Format aus und klicken Sie auf OK, um jedes zugeschnittene Bild separat zu speichern. Öffnen Sie die 3D-Rekonstruktionssoftware. Klicken Sie vor dem Hochladen auf dem Navigationsgizmo auf Z oder drücken Sie Ziffernblock 7, um die Perspektive des Ansichtsfensters auszurichten. Um die Bilder hochzuladen, klicken Sie auf Hinzufügen, Bild, Referenz, wählen Sie dann das erste Bild aus und doppelklicken Sie zur Bestätigung. Um das endgültige TEM-Bild entlang der z-Achse zu positionieren, klicken Sie auf das Bild. Geben Sie im Bedienfeld "Objekteigenschaften" in der rechten Seitenleiste den entsprechenden Wert in das Feld "Position Z" ein. Um alle Bilder gleichmäßig entlang der Z-Achse zu verteilen, wählen Sie alle Bildobjekte aus. Drücken Sie Ende, um das Endfenster zu öffnen. Navigieren Sie zur Registerkarte Bearbeiten, und klicken Sie auf Z verteilen, um sie automatisch basierend auf der Schnittstärke zu platzieren. Um die Form des dendritischen Rückens in jedem TEM-Bild manuell mit einer einzelnen Kurve pro Bild zu umreißen, klicken Sie auf Hinzufügen, Kurve und Kreis. Um den Kreis zu verschieben, halten Sie g gedrückt, ziehen Sie die Maus, und klicken Sie dann, um die Platzierung zu bestätigen. Halten Sie s gedrückt, um die Größe anzupassen, und klicken Sie dann zur Bestätigung. Skalieren Sie als Nächstes das Objekt so, dass es an der Form des dendritischen Stachels ausgerichtet ist. Ändern Sie nun die gekrümmte Form so, dass sie an die Wirbelsäulenbegrenzung passt. Wählen Sie einen Kontrollpunkt aus, drücken Sie g, verschieben Sie den Punkt und klicken Sie zur Bestätigung. Verwenden Sie je nach Bedarf die Tasten g oder s, um die Griffpunkte anzupassen und die Richtung und Intensität der Kurve zu verfeinern. Um weitere Details hinzuzufügen, halten Sie die Umschalttaste gedrückt und wählen Sie zwei benachbarte Steuerpunkte aus. Klicken Sie dann mit der rechten Maustaste, und wählen Sie Unterteilen, um einen neuen Punkt zwischen ihnen einzufügen. Sobald die Kurve die Wirbelsäule genau umrandet, rufen Sie die Registerkarte Layout auf, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Bézier-Kreisobjekt und wählen Sie Objekt duplizieren, ohne die Maus zu bewegen. Um die Kanten des verbundenen Objekts zu verbinden und ein geschlossenes Netz zu bilden, rufen Sie die Registerkarte Modellierung auf. Drücken Sie 2, um in den Edge-Auswahlmodus zu wechseln. Klicken Sie auf Auswählen, Alle, klicken Sie mit der rechten Maustaste, und wählen Sie Kantenschleifen überbrücken, um die Kantenringe miteinander zu verknüpfen. Um die Lücke am oberen Rand des Objekts zu füllen, heben Sie die Auswahl aller Objekte auf, indem Sie auf daneben klicken. Halten Sie die Alt-Taste gedrückt und klicken Sie auf eine Kante der oberen Kante, um die gesamte Schleife auszuwählen. Klicken Sie mit der rechten Maustaste, wählen Sie Kanten extrudieren, und ziehen Sie den Mauszeiger entlang der Z-Achse nach oben. Drücken Sie nun s, bewegen Sie die Maus nach innen, um die neue Schleife zu verkleinern, und klicken Sie zur Bestätigung. Wenn die Schleife noch ausgewählt ist, klicken Sie mit der rechten Maustaste, und wählen Sie Neue Fläche aus Kanten. Um die endgültige Struktur zu glätten, gehen Sie auf die Registerkarte Modifikatoren in der rechten Seitenleiste. Klicken Sie auf Modifikator hinzufügen, navigieren Sie zu Generieren, und wählen Sie Unterteilungsfläche aus. Legen Sie die Ebenen für das Ansichtsfenster und die Renderebenen auf eins fest, um eine konsistente Glättung zu erzielen. Um einzelnen Strukturen Farbe zuzuweisen, wählen Sie das gewünschte Objekt aus. Öffnen Sie die Registerkarte Material in der rechten Seitenleiste, klicken Sie auf Neu und legen Sie die Grundfarbe fest. Wählen Sie das Lichtobjekt aus, um die Szenenbeleuchtung anzupassen. Halten Sie g gedrückt, bewegen Sie die Maus, um die Lichtquelle neu zu positionieren, und klicken Sie, um die neue Position zu bestätigen. Um die Kamera für das Rendern zu positionieren, richten Sie das Ansichtsfenster so aus, dass es auf die dendritische Wirbelsäule zeigt, wie sie in der endgültigen Ausgabe angezeigt werden sollte. Drücken Sie Strg + Alt + Ziffernblock 0, um die Kamera in der aktuellen Ansicht auszurichten. Passen Sie den Kamerarahmen an, indem Sie ihn auswählen, g gedrückt halten und verschieben, um den Bildausschnitt zu verfeinern. Der somatosensorische Kortex der Maus war auch in ungefärbten Hirnschnitten identifizierbar, und das gesamte Fassfeld konnte trotz der Verteilung der einzelnen Zylinder über mehrere Schnitte mit digitalen Werkzeugen rekonstruiert werden. Konsekutive ultradünne TEM-Bilder ermöglichten die zuverlässige Klassifizierung von Synapsen in exzitatorische oder inhibitorische Typen auf der Grundlage serieller visueller Beweise. Die dreidimensionale Rekonstruktion dendritischer Stacheln aus seriellen Schnitten ermöglichte die Visualisierung der Morphologie der Wirbelsäule und zeigte verschiedene Formen, wie dünne, pilzförmige, stumpfe Stacheln und intermediäre. Die Wirbelsäulenformen wurden auf der Grundlage von Messungen quantifiziert, einschließlich der Länge der Wirbelsäule, der Halslänge und der Durchmesser der Wirbelsäule, des Kopfes und des Halses.