Verständnis der Veränderungen in der mitochondrialen Morphologie durch dynamische und dreidimensionale Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen

Ziel unserer Forschung ist es, Veränderungen in mitochondrialen Netzwerken zu beobachten und zu untersuchen, wie sich diese mitochondrialen Netzwerke als Reaktion auf zelluläre Bedingungen verändern. Wir verwenden Open-Source-Tools wie Fiji und Python und kombinieren vorhandene Bibliotheken mit benutzerdefinierten Makros und Skripten, um die Analyse der mitochondrialen Morphologie aus komplexen Fluoreszenzmikroskopiedaten zu automatisieren. Es bleibt eine Herausforderung, zuverlässige quantitative Daten und Metriken zu erhalten, die die Dynamik der mitochondrialen Spaltung und Fusion mit ihrer Lokalisierung in 3D beschreiben.

Eine Standardisierung für eine solche Datengenerierung ist nicht allgemein verfügbar. Daher gibt es nur begrenzte Kenntnisse über die zellspezifische Spaltungs- und Fusionsfrequenz und die intrazelluläre Lokalisation. Wir fügten den verfügbaren Forschungsmetriken die Lebensdetektion der mitochondrialen Spaltung und Fusion hinzu.

Und durch die Kombination dieser mit der Anzahl der mitochondrialen Strukturen konnten wir eine neue Metrik zum Verständnis der Dynamik des mitochondrialen Netzwerks definieren. Unsere Erkenntnisse ermöglichen es uns, zellspezifische Spaltungs- und Fusionsparameter zu charakterisieren und zum ersten Mal festzustellen, ob sich das mitochondriale System im Gleichgewicht befindet oder sich verschiebt. Dies verhindert schwerwiegende Fehlinterpretationen von Phänotypen in den Bereichen Gesundheit und Krankheit und bietet einen klaren Rahmen für eine genaue Berichterstattung.

Öffnen Sie zunächst die Rohdatei in ImageJ. Passen Sie die Farbeinstellungen an, um die Sichtbarkeit des interessierenden Bereichs zu verbessern, aber legen Sie nichts fest. Duplizieren Sie das Bild entsprechend der Anzahl der einzelnen Zellen, die analysiert werden müssen.

Wenn mehrere Zellen in einem Sichtfeld vorhanden sind, navigieren Sie zu Analyse, Werkzeuge, und verwenden Sie das Werkzeug Synchronisierte Fenster und das Freihandzeichen-Werkzeug, um einen Interessenbereich um eine Interessenzelle zu zeichnen, wählen Sie dann Bearbeiten und dann Außen löschen aus, um die ausgewählte Zelle zu isolieren. Trennen Sie den roten und den blauen Kanal voneinander und speichern Sie den mitochondrialen Kanal als tif-Datei. Um eine Punktverteilungsfunktion oder PSF zu generieren, öffnen Sie das Rohbild erneut.

Öffnen Sie dann das PSF-Generator-Plugin, indem Sie Plugins auswählen, dann PSF-Generator auswählen und das optische 3D-Modell des geborenen Wolfs auswählen. Öffnen Sie die Bildinformationen des Rohbilds, indem Sie Bild auswählen, dann Informationen anzeigen auswählen oder indem Sie I auf der Tastatur drücken. Scrollen Sie zum unteren Rand des Bildinformationsfensters.

Wählen Sie die Option Voxelgröße und -tiefe und ändern Sie die Wellenlänge auf 568 Nanometer. Stellen Sie die Pixelgröße XY auf 166,1 Nanometer ein, den Z-Schritt auf 200 Nanometer. Legen Sie die Größe XYZ auf eine Bildauflösung von 512 x 512 fest, und konfigurieren Sie den Z-Stapel so, dass er 10 Z-Scheiben enthält.

Klicken Sie auf Ausführen. Speichern Sie die PSF-Datei als tif-Datei in einem eigenen Ordner. Navigieren Sie zu Plugins, wählen Sie Makros und dann Edit (Bearbeiten) und dann Deconvolution_time_lapse_mine aus.

ijm, um auf das Dekonvolutionsmakro zuzugreifen. Bearbeiten Sie die Ein- und Ausgabezeilen nach Bedarf, und drücken Sie Ausführen, um das Makro auszuführen. Um den Bildkontrast zu verbessern und unscharf zu machen, navigieren Sie zu Plugins, wählen Sie Makros, wählen Sie Edit (Bearbeiten) und öffnen Sie die Vorverarbeitung.

ijm, um auf das Vorverarbeitungsmakro zuzugreifen. Führen Sie eine Hintergrundsubtraktion durch, indem Sie den Radius der rollenden Kugel auf 6 festlegen. Stellen Sie den Sigma Filter Plus so ein, dass der Radius auf das 1-fache des Skalierungsfaktors eingestellt ist.

Die Anzahl der verwendeten Pixel beträgt 2 und der minimale Pixelanteil beträgt 0,2, um sicherzustellen, dass das Plugin so eingestellt ist, dass es Ausreißer erkennt. Passen Sie die CLAHE-Einstellungen an, indem Sie die Blockgröße auf 64, die Histogramm-Bins auf 256, die maximale Steigung auf 2,5 und das Gamma auf 0,8 konfigurieren und dann auf Ausführen klicken. Öffnen Sie eine relevante Datei, die mit dem Vorprozess geändert wurde.

ijm-Makros in ImageJ. Navigieren Sie zu Plugins und wählen Sie Adaptiver Schwellenwert aus. Legen Sie den lokalen Schwellenwert auf den gewichteten Mittelwert fest, und passen Sie die Pixelblockgröße nach Bedarf an.

Klicken Sie auf Vorschau und passen Sie die Blockgröße an, um so viele Mitochondrien wie möglich eindeutig einzubeziehen. Ändern Sie den Subtraktionswert für jede Zelle, um den unnötigen Hintergrund zu entfernen, und notieren Sie sich das resultierende Mikrofoto. Um die Zeit zu optimieren, sortieren Sie Bilder entsprechend dem angewendeten Subtraktionswert in Dateien.

Navigieren Sie nun zu Plugins, wählen Sie Makros, wählen Sie Edit (Bearbeiten) und öffnen Sie Threshold. ijm, um auf das Schwellenwertmakro zuzugreifen. Bearbeiten Sie das Makroskript, um die korrekten Eingabe- und Ausgabepfade, die Blockgröße und die Subtrahierwerte zu definieren.

Klicken Sie auf Ausführen, um das Makro auszuführen. Öffnen Sie bis zu 10 Mikroskopische Aufnahmen mit Schwellenwerten, die zur gleichen Behandlungsbedingung gehören. Navigieren Sie zu Bild, Stapel, Tools, und wählen Sie Verketten aus, drücken Sie dann OK.To entfernen Sie verbleibende kleine Punkte, die durch Schwellenwerte zurückbleiben, wechseln Sie zu Plugins, gefolgt von Integrale Bildfilter, und wählen Sie dann Ausreißer entfernen aus.

Verwenden Sie die Vorschau, um die X- und Y-Größen zu optimieren und Fragmente zu entfernen. Speichern Sie die verkettete Datei als TIF-Datei. Navigieren Sie abschließend zu Plugins, Makros, Bearbeiten QuickTest_new.ijm.

Bearbeiten Sie die Eingabe- und Ausgabepfadzeilen so, dass sie auf die entsprechenden Verzeichnisse verweisen, klicken Sie auf Ausführen und visualisieren Sie den mitochondrialen Ereignislokalisierer oder die MEL-Ergebnisse. Die mitochondriale Dynamik wurde im Laufe der Zeit verfolgt, wobei rote Punkte Spaltungsereignisse und grüne Punkte Fusionsereignisse sowohl in 3D- als auch in 2D-Ansichten markieren. Mitochondriale Netzwerke zeigten im Laufe der Zeit behandlungsspezifische Unterschiede in der Struktur mit länglicheren und miteinander verbundenen Formen in Metformin-behandelten Zellen und stark fragmentierten Netzwerken in Metformin-CCCP-Baf-behandelten Zellen.

Die Metformin-CCCP-Baf-Gruppe zeigte eine signifikant höhere Spaltungs- und Fusionsaktivität als die Kontroll- oder reine Metformin-Gruppe, was auf einen erhöhten mitochondrialen Umbau hindeutet. Diese Gruppe hatte auch eine signifikant höhere Mitochondrienzahl, was mit einer verstärkten Fragmentierung übereinstimmt. Das mitochondriale Volumen war in der gleichen Gruppe signifikant reduziert, was eine Verschiebung in Richtung Spaltung weiter unterstützt.

Bei der Normalisierung auf die mitochondriale Zahl zeigte die reine Metformin-Gruppe jedoch die höchste relative dynamische Aktivität, was darauf hindeutet, dass Metformin allein ein aktiveres und effizienteres Umbaunetzwerk fördert, während die Co-Behandlung zu einem umfangreichen, aber weniger effizienten strukturellen Umsatz führt.