Verständnis der Veränderungen in der mitochondrialen Morphologie durch dynamische und dreidimensionale Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen
August 15th, 2025
Hier beschreiben wir den mitochondrial event localizer (MEL), ein ImageJ-Plugin, das bei der Quantifizierung der 3-dimensionalen Veränderungen der mitochondrialen Spaltung und Fusionsaktivität im Laufe der Zeit nützlich ist. Wir beschreiben auch eine Bildverarbeitungspipeline, die für die Bereinigung von Schliffbildern vor der Analyse in ImageJ nützlich ist.
Ziel unserer Forschung ist es, Veränderungen in mitochondrialen Netzwerken zu beobachten und zu untersuchen, wie sich diese mitochondrialen Netzwerke als Reaktion auf zelluläre Bedingungen verändern. Wir verwenden Open-Source-Tools wie Fiji und Python und kombinieren vorhandene Bibliotheken mit benutzerdefinierten Makros und Skripten, um die Analyse der mitochondrialen Morphologie aus komplexen Fluoreszenzmikroskopiedaten zu automatisieren. Es bleibt eine Herausforderung, zuverlässige quantitative Daten und Metriken zu erhalten, die die Dynamik der mitochondrialen Spaltung und Fusion mit ihrer Lokalisierung in 3D beschreiben.
Eine Standardisierung für eine solche Datengenerierung ist nicht allgemein verfügbar. Daher gibt es nur begrenzte Kenntnisse über die zellspezifische Spaltungs- und Fusionsfrequenz und die intrazelluläre Lokalisation. Wir fügten den verfügbaren Forschungsmetriken die Lebensdetektion der mitochondrialen Spaltung und Fusion hinzu.
Und durch die Kombination dieser mit der Anzahl der mitochondrialen Strukturen konnten wir eine neue Metrik zum Verständnis der Dynamik des mitochondrialen Netzwerks definieren. Unsere Erkenntnisse ermöglichen es uns, zellspezifische Spaltungs- und Fusionsparameter zu charakterisieren und zum ersten Mal festzustellen, ob sich das mitochondriale System im Gleichgewicht befindet oder sich verschiebt. Dies verhindert schwerwiegende Fehlinterpretationen von Phänotypen in den Bereichen Gesundheit und Krankheit und bietet einen klaren Rahmen für eine genaue Berichterstattung.
Öffnen Sie zunächst die Rohdatei in ImageJ. Passen Sie die Farbeinstellungen an, um die Sichtbarkeit des interessierenden Bereichs zu verbessern, aber legen Sie nichts fest. Duplizieren Sie das Bild entsprechend der Anzahl der einzelnen Zellen, die analysiert werden müssen.
Wenn mehrere Zellen in einem Sichtfeld vorhanden sind, navigieren Sie zu Analyse, Werkzeuge, und verwenden Sie das Werkzeug Synchronisierte Fenster und das Freihandzeichen-Werkzeug, um einen Interessenbereich um eine Interessenzelle zu zeichnen, wählen Sie dann Bearbeiten und dann Außen löschen aus, um die ausgewählte Zelle zu isolieren. Trennen Sie den roten und den blauen Kanal voneinander und speichern Sie den mitochondrialen Kanal als tif-Datei. Um eine Punktverteilungsfunktion oder PSF zu generieren, öffnen Sie das Rohbild erneut.
Öffnen Sie dann das PSF-Generator-Plugin, indem Sie Plugins auswählen, dann PSF-Generator auswählen und das optische 3D-Modell des geborenen Wolfs auswählen. Öffnen Sie die Bildinformationen des Rohbilds, indem Sie Bild auswählen, dann Informationen anzeigen auswählen oder indem Sie I auf der Tastatur drücken. Scrollen Sie zum unteren Rand des Bildinformationsfensters.
Wählen Sie die Option Voxelgröße und -tiefe und ändern Sie die Wellenlänge auf 568 Nanometer. Stellen Sie die Pixelgröße XY auf 166,1 Nanometer ein, den Z-Schritt auf 200 Nanometer. Legen Sie die Größe XYZ auf eine Bildauflösung von 512 x 512 fest, und konfigurieren Sie den Z-Stapel so, dass er 10 Z-Scheiben enthält.
Klicken Sie auf Ausführen. Speichern Sie die PSF-Datei als tif-Datei in einem eigenen Ordner. Navigieren Sie zu Plugins, wählen Sie Makros und dann Edit (Bearbeiten) und dann Deconvolution_time_lapse_mine aus.
ijm, um auf das Dekonvolutionsmakro zuzugreifen. Bearbeiten Sie die Ein- und Ausgabezeilen nach Bedarf, und drücken Sie Ausführen, um das Makro auszuführen. Um den Bildkontrast zu verbessern und unscharf zu machen, navigieren Sie zu Plugins, wählen Sie Makros, wählen Sie Edit (Bearbeiten) und öffnen Sie die Vorverarbeitung.
ijm, um auf das Vorverarbeitungsmakro zuzugreifen. Führen Sie eine Hintergrundsubtraktion durch, indem Sie den Radius der rollenden Kugel auf 6 festlegen. Stellen Sie den Sigma Filter Plus so ein, dass der Radius auf das 1-fache des Skalierungsfaktors eingestellt ist.
Die Anzahl der verwendeten Pixel beträgt 2 und der minimale Pixelanteil beträgt 0,2, um sicherzustellen, dass das Plugin so eingestellt ist, dass es Ausreißer erkennt. Passen Sie die CLAHE-Einstellungen an, indem Sie die Blockgröße auf 64, die Histogramm-Bins auf 256, die maximale Steigung auf 2,5 und das Gamma auf 0,8 konfigurieren und dann auf Ausführen klicken. Öffnen Sie eine relevante Datei, die mit dem Vorprozess geändert wurde.
ijm-Makros in ImageJ. Navigieren Sie zu Plugins und wählen Sie Adaptiver Schwellenwert aus. Legen Sie den lokalen Schwellenwert auf den gewichteten Mittelwert fest, und passen Sie die Pixelblockgröße nach Bedarf an.
Klicken Sie auf Vorschau und passen Sie die Blockgröße an, um so viele Mitochondrien wie möglich eindeutig einzubeziehen. Ändern Sie den Subtraktionswert für jede Zelle, um den unnötigen Hintergrund zu entfernen, und notieren Sie sich das resultierende Mikrofoto. Um die Zeit zu optimieren, sortieren Sie Bilder entsprechend dem angewendeten Subtraktionswert in Dateien.
Navigieren Sie nun zu Plugins, wählen Sie Makros, wählen Sie Edit (Bearbeiten) und öffnen Sie Threshold. ijm, um auf das Schwellenwertmakro zuzugreifen. Bearbeiten Sie das Makroskript, um die korrekten Eingabe- und Ausgabepfade, die Blockgröße und die Subtrahierwerte zu definieren.
Klicken Sie auf Ausführen, um das Makro auszuführen. Öffnen Sie bis zu 10 Mikroskopische Aufnahmen mit Schwellenwerten, die zur gleichen Behandlungsbedingung gehören. Navigieren Sie zu Bild, Stapel, Tools, und wählen Sie Verketten aus, drücken Sie dann OK.To entfernen Sie verbleibende kleine Punkte, die durch Schwellenwerte zurückbleiben, wechseln Sie zu Plugins, gefolgt von Integrale Bildfilter, und wählen Sie dann Ausreißer entfernen aus.
Verwenden Sie die Vorschau, um die X- und Y-Größen zu optimieren und Fragmente zu entfernen. Speichern Sie die verkettete Datei als TIF-Datei. Navigieren Sie abschließend zu Plugins, Makros, Bearbeiten QuickTest_new.ijm.
Bearbeiten Sie die Eingabe- und Ausgabepfadzeilen so, dass sie auf die entsprechenden Verzeichnisse verweisen, klicken Sie auf Ausführen und visualisieren Sie den mitochondrialen Ereignislokalisierer oder die MEL-Ergebnisse. Die mitochondriale Dynamik wurde im Laufe der Zeit verfolgt, wobei rote Punkte Spaltungsereignisse und grüne Punkte Fusionsereignisse sowohl in 3D- als auch in 2D-Ansichten markieren. Mitochondriale Netzwerke zeigten im Laufe der Zeit behandlungsspezifische Unterschiede in der Struktur mit länglicheren und miteinander verbundenen Formen in Metformin-behandelten Zellen und stark fragmentierten Netzwerken in Metformin-CCCP-Baf-behandelten Zellen.
Die Metformin-CCCP-Baf-Gruppe zeigte eine signifikant höhere Spaltungs- und Fusionsaktivität als die Kontroll- oder reine Metformin-Gruppe, was auf einen erhöhten mitochondrialen Umbau hindeutet. Diese Gruppe hatte auch eine signifikant höhere Mitochondrienzahl, was mit einer verstärkten Fragmentierung übereinstimmt. Das mitochondriale Volumen war in der gleichen Gruppe signifikant reduziert, was eine Verschiebung in Richtung Spaltung weiter unterstützt.
Bei der Normalisierung auf die mitochondriale Zahl zeigte die reine Metformin-Gruppe jedoch die höchste relative dynamische Aktivität, was darauf hindeutet, dass Metformin allein ein aktiveres und effizienteres Umbaunetzwerk fördert, während die Co-Behandlung zu einem umfangreichen, aber weniger effizienten strukturellen Umsatz führt.
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Übersicht
Diese Studie stellt den mitochondrialen Ereignislokalisator (MEL) vor, ein ImageJ-Plugin, das für die Quantifizierung von 3D-Veränderungen in der mitochondrialen Spaltung und Fusion über die Zeit konzipiert wurde. Die Forschung beschreibt auch eine Bildverarbeitungspipeline zur Verbesserung von Mikrographen vor der Analyse.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Bildverarbeitung
Hintergrund
- Mitochondriale Netzwerke sind entscheidend für die Zellfunktion.
- Das Verständnis der Dynamik von Spaltung und Fusion ist wesentlich für Erkenntnisse über die zelluläre Gesundheit.
- Standardisierte Metriken für diese Prozesse fehlen.
- Bestehende Werkzeuge für die Analyse erfordern oft Anpassungen.
Ziel der Studie
- Beobachtung von Veränderungen in mitochondrialen Netzwerken unter verschiedenen zellulären Bedingungen.
- Automatisierung der Analyse der mitochondrialen Morphologie aus Fluoreszenzmikroskopie-Daten.
- Verbesserung des Verständnisses von zellspezifisch bedingten Spaltungs- und Fusionsfrequenzen.
Verwendete Methoden
- Nutzung von Open-Source-Tools wie Fiji und Python.
- Entwicklung benutzerdefinierter Makros und Skripte zur Automatisierung.
- Implementierung einer neuen Bildverarbeitungspipeline.
- Lebensdetektion von mitochondrialer Spaltung und Fusion als Ergänzung zu Forschungsmetriken.
Hauptergebnisse
- Es wurden zuverlässige quantitative Daten über mitochondriale Dynamik erzielt.
- Standardisierung der Datengenerierung wurde vorgeschlagen.
- Einblicke in die mitochondriale Lokalisierung in 3D wurden bereitgestellt.
- Neue Metriken für Spaltungs- und Fusionsfrequenz wurden etabliert.
Schlussfolgerungen
- Das MEL-Plugin unterstützt die Analyse mitochondrialer Dynamik erheblich.
- Standardisierte Methoden können die Reproduzierbarkeit in der Forschung verbessern.
- Weitere Studien sind erforderlich, um zellspezifisch bedingtes mitochondriales Verhalten zu erforschen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Quantitative, three-dimensional analysis of mitochondrial fission and fusion dynamics is critical for de-risking early discovery hypotheses related to cellular stress and drug response. The described pipeline and MEL plugin enable standardized, reproducible measurement of mitochondrial network remodeling, directly supporting predictive confidence in target validation and mechanistic studies. This capability enhances portfolio decision-making by clarifying cellular phenotypes in response to pharmaceutical intervention.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of mitochondrial remodeling under compound treatment or stress conditions.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing between equilibrium and shifting mitochondrial states.
- Provides standardized metrics for functional target validation in cell-specific contexts.
- Facilitates predictive confidence in linking mitochondrial dynamics to disease-relevant phenotypes.
Screening & Assay Development
- Prepares validated 3D biological imaging data for downstream screening workflows.
- Standardizes image processing and event detection for reproducible assay outputs.
- Enables high-content screening of mitochondrial morphology changes across treatment groups.
- Supports reliable compound evaluation by quantifying fission, fusion, and network structure metrics.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mitochondrial dynamic metrics with disease-relevant cellular models when supported by data.
- Provides continuity from discovery imaging to preclinical phenotypic validation.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative mitochondrial remodeling data.
- Supports mechanistic de-risking in translational research pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
This pipeline integrates from early discovery imaging through lead identification and preclinical model validation, supporting hypothesis testing and mechanistic clarity at each stage.
- Discovery Biology: Quantifies mitochondrial fission and fusion events to clarify pathway responses to interventions.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for assay development and compound triage.
- Analytics: Provides standardized readouts for comparing treatment conditions and cellular phenotypes.
- Translational Research: Bridges discovery imaging with preclinical model assessment when disease relevance is established.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, open-source workflow adaptable across cell types and experimental conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in mitochondrial biology studies.
- Operational Value: Standardizes image analysis, improving reproducibility and scalability across teams.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk by clarifying cellular responses.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery programs targeting mitochondrial function.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy and image analysis.
- Depends on access to open-source tools (ImageJ/Fiji, Python) and compatible computational infrastructure.
- Demands cross-team standardization of imaging and analysis protocols for reproducibility.
- Adaptable to various cell types and experimental models with appropriate parameter tuning.
- Limited by the need for high-quality 3D time-lapse imaging and careful threshold optimization.
