Name: Hochdurchsatzfähiges dreidimensionales Gewebemodell zur Quantifizierung von Elektroporationsschwellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-19T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Erfahren Sie, wie computergestützte Modellierung reversible und irreversible Elektroporationsschwellen in dreidimensionalen Gewebemodellen quantifiziert. Diese Methode optimiert Transfektionsprotokolle für die Gewebeentwicklung.

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<table><tbody><tr><td>0,25 % Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>1000 μl Pipettenspitzen</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-811-164</td><td></td></tr><tr><td>Konisches 15-ml-Röhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-70C</td><td></td></tr><tr><td>200 μl Pipettenspitzen</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-811-139</td><td></td></tr><tr><td>304 Edelstahl Nadeln mit stumpfer Spitze</td><td>McMaster Carr</td><td>Artikel-Nr.: 75165A753</td><td></td></tr><tr><td>316 Edelstahlrohr</td><td>McMaster Carr</td><td>Artikel-Nr.: 89785K319</td><td></td></tr><tr><td>Acryl</td><td>McMaster Carr</td><td>Artikel-Nr.: 8505K754</td><td></td></tr><tr><td>Biosicherheitswerkbank</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-261-312</td><td></td></tr><tr><td>CAD-Software</td><td>Dassault Systems</td><td>SolidWorks</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Nuaire</td><td>NU-C200R</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporator</td><td>Hbio</td><td>45-0662</td><td>In dieser Studie wurden ein speziell angefertigtes Gerät und ein BTX ECM 830 System verwendet</td></tr><tr><td>EMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT10009CV</td><td>Dies kann variieren bei Verwendung einer anderen Zelllinie als HEK293</td></tr><tr><td>Falcon 12-Well-Multiwell-Zellkulturplatte mit klarem Flachboden, TC-behandelt, mit Deckel</td><td>Corning</td><td>353043</td><td>Jede 12-Well-Platte kann verwendet werden, stellen Sie einfach sicher, dass die Well-Abmessungen bei der Herstellung des Elektrodenhalters berücksichtigt werden.</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>A5670701</td><td></td></tr><tr><td>LWL-Temperaturfühler</td><td>Micronor Inc.</td><td>Artikel-Nr.: TS5-20MM-02</td><td></td></tr><tr><td>GFP-Plasmid</td><td>Aldeveron</td><td>gWiz-GFP</td><td></td></tr><tr><td>HEK293 Zellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td>Andere Zelllinien können verwendet werden, stellen Sie einfach sicher, dass das richtige Kulturmedium verwendet wird</td></tr><tr><td>Kochplatte</td><td>Thermoelectric Cooling America Corporation</td><td>AHP-301CPV</td><td></td></tr><tr><td>Eis- oder gekühltes Perlenbad</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-876-001</td><td></td></tr><tr><td>Bildanalyse-Software</td><td>Leica</td><td>LAS X</td><td></td></tr><tr><td>Brutkasten</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-015-2633</td><td></td></tr><tr><td>Inverses Fluoreszenzmikroskop</td><td>Leica</td><td>DMi8</td><td></td></tr><tr><td>Laserschneider</td><td>McMaster Carr</td><td>7344N11</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pipetten-Kit</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-388-100</td><td></td></tr><tr><td>Simulationssoftware</td><td>COMSOL</td><td>COMSOL Multiphysik 6.2</td><td></td></tr><tr><td>T75 Kolben</td><td>Fisher Scientific</td><td>156499</td><td></td></tr><tr><td>Typ I Rinderkollagenlösung</td><td>Fortschrittliche Biomatrix</td><td>5005</td><td>3 mg/ml</td></tr></tbody></table>

hochdurchsatzfähiges dreidimensionales gewebemodell zur quantifizierung von elektroporationsschwellen

High-Throughput Capable Three-Dimensional Tissue Model for Quantification of Electroporation Thresholds

Die Ring- und Pin-Elektrode lieferte erfolgreich ein DNA-Plasmid, das für ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) kodiert, in 3D-Kollagengewebe-Imitatik, die in HEK293-Zellen eingebettet ist. Die erfolgreiche Quantifizierung der RE-Schwelle wurde erreicht, indem der äußere Radius der transfizierten Region gemessen und die entsprechende Feldintensität aus dem Computermodell des Versuchsaufbaus abgeleitet wurde, wie in Abbildung 2 zu sehen ist. Die IRE-Schwelle...

Hochdurchsatzfähiges dreidimensionales Gewebemodell zur Quantifizierung von Elektroporationsschwellen

Electroporation is a promising technology utilizing electrical pulses for macromolecule delivery and soft-tissue ablation, with applications that include ...

Unsere Forschung konzentriert sich auf den Einsatz von Elektroporation, insbesondere bipolaren Mikrosekundenimpulsen, zur Behandlung von Krebs. Derzeit beschäftigen wir uns mit der Weichteilablation, aber wir werden auch zur In-vivo-Transfektion mit diesen Pulsen übergehen. Unser Protokoll ermöglicht Ihnen eine effizientere Anzeige der irreversiblen und reversiblen Elektroporationsschwellen.Es kann auch ein bisschen besser sein als ein würfelbasiertes System, da es uns ermöglicht, in 3D statt in einer 2D-Umgebung zu sehen. Und eine 3D-Umgebung wäre dem, was wir im Gewebe sehen würden, viel ähnlicher. In Zukunft werden wir versuchen, das, was wir in diesem Modell sehen, in vivo zu übersetzen, und was dieses Modell wirklich tut, ist die Parameterauswahl zu beeinflussen, die wir treffen werden, wenn wir versuchen, Dinge wie DNA-Impfstoffe, Chemotherapien sowie CRISPR-Cas9-Systeme zu liefern.Zu Beginn legen Sie die Zellsuspension und die erforderlichen Reagenzien in eine Biosicherheitswerkbank. Mischen Sie die vorbereitete Zellsuspension gründlich mit Rinderkollagenlösung Typ 1 im Verhältnis 1:1. Geben Sie die Mischung auf Eis oder in ein kaltes Perlbad, um eine vorzeitige Polymerisation zu verhindern.Pipettieren Sie dann 500 Mikroliter der kombinierten Lösung, um den Boden jeder Vertiefung einer 12-Well-Platte zu beschichten. Schwenken Sie die Platte vorsichtig, um sicherzustellen, dass das Gel die Wände jeder Vertiefung berührt. Inkubieren Sie die Gele in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid für 6 Stunden oder bis die Gele fest werden.Kippen Sie dann die Well-Platte und geben Sie vorsichtig 500 Mikroliter Kulturmedium in jede Well, wobei Sie es an der Wand der Platte hinuntergleiten lassen. Entfernen Sie die Kunststoffköderverbindung von zwei 1,64 Millimeter starken Spritzennadeln aus Edelstahl 304. Legen Sie eine Nadel beiseite, um als Stiftelektrode zu dienen.Für die andere Nadel die letzten 5 Millimeter eines Endes flach drücken. Schneiden Sie dann ein Stück eines Rohrs aus Edelstahl 316 mit einem Durchmesser von 19 Millimetern ab, das lang genug ist, um bündig mit dem Boden einer Well-Platte zu sitzen, um die Ringelektrode zu erstellen. Entwerfen Sie einen Elektrodenhalter mit CAD-Software, um die Elektrodenkomponenten anzupassen.Setzen Sie die Ring- und Stiftelektroden in den Elektrodenhalter ein, um die Elektrode zusammenzubauen, und drücken Sie die Nadel mit dem abgeflachten Ende in den Halter, um die Ringelektrode zu sichern. Kippen Sie in einer Biosicherheitswerkbank die vorbereitete Platte und aspirieren Sie 400 Mikroliter Kulturmedium aus jeder Vertiefung. Geben Sie 20 Mikroliter von 5 Mikrogramm pro Mikroliter grün fluoreszierender Proteinplasmidlösung in die aspirierten Vertiefungen.Schwenken Sie die Platte vorsichtig, um sicherzustellen, dass sich die Lösung gleichmäßig auf der Geloberfläche verteilt. Inkubieren Sie die Gele in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid für 10 Minuten. Führen Sie anschließend den faseroptischen Temperaturfühler in die Stiftelektrode ein und beginnen Sie mit der Aufzeichnung der Temperatur.Verbinden Sie die Plusleitung des Elektroporators mit der Stiftelektrode und die Minusleitung mit der Nadel und sichern Sie so die Ringelektrode. Schalten Sie nun die Heizplatte ein und erhitzen Sie die Gele, um eine Temperatur von 37 Grad Celsius zu halten. Führen Sie dann den zusammengebauten Ring und die Elektrode mit dem Temperaturfühler in die Vertiefung ein und stellen Sie sicher, dass das Gel eine Temperatur von 37 Grad Celsius erreicht hat.Aktivieren Sie den Elektroporator, um die Behandlung durchzuführen. Geben Sie dann 100 Mikroliter Nährmedium zu allen Gelen, die trocken erscheinen, und fahren Sie mit dem Elektrbetrieb aller unbehandelten Gele fort. Sobald alle Behandlungen abgeschlossen sind, inkubieren Sie die Gele in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für 10 Minuten.Geben Sie nach der Inkubation vorsichtig 500 Mikroliter Nährmedium in jede Vertiefung entlang der Wand der Platte. Inkubieren Sie die Gele erneut für 24 Stunden im befeuchteten Inkubator. Kippen Sie die Platte und saugen Sie das Nährmedium aus jeder Vertiefung ab.Geben Sie dann vorsichtig 500 Mikroliter PBS in jede Vertiefung entlang der Wände der Platte. Inkubieren Sie die Gele in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für 5 Minuten. Saugen Sie dann das PBS aus jeder Vertiefung an.Geben Sie vorsichtig 500 Mikroliter PBS in jede Vertiefung, indem Sie es an der Wand der Platte hinuntergleiten lassen. Schwenken Sie die Platte vorsichtig, kippen Sie sie dann und saugen Sie das PBS aus jeder Vertiefung an. Geben Sie nun 100 Mikroliter frisches PBS in jede Vertiefung, um die Gele für die Bildgebung mit Feuchtigkeit zu versorgen.Nehmen Sie dann die Platte mit Standard-Fluoreszenzmikroskopietechniken ab. Nach der Bildgebung 500 Mikroliter Nährmedium in jede Vertiefung der Platte geben und 24 Stunden lang inkubieren. Wiederholen Sie den vollständigen Imaging- und Wiederherstellungs-Workflow für jeden angegebenen Zeitpunkt.Nachdem Sie ein Berechnungsmodell erstellt haben, verwenden Sie die Mikroskopsoftware, um den Durchmesser sowohl der äußeren als auch der inneren Kanten des torusförmigen Bereichs entlang der vertikalen und horizontalen Achse zu messen. Mitteln Sie den Außen- bzw. Innendurchmesser und dividieren Sie durch 2, um die entsprechenden Radien zu berechnen. Leiten Sie abschließend mithilfe der zuvor erstellten Nachschlagetabelle die Intensität des elektrischen Feldes bei den gemessenen Radien ab.Der äußere Radius des transfizierten Bereichs wurde verwendet, um die reversible Elektroporations- oder RE-Schwelle zu quantifizieren, indem er mit elektrischen Feldstärken aus einem Computermodell korreliert wurde. Während der innere Radius zur Bestimmung der irreversiblen Elektroporations- oder IRE-Schwelle verwendet wurde. Alle drei bipolaren Mikrosekunden-Pulsprotokolle führten zu torusförmigen Transfektionsregionen mit deutlich sichtbaren RE- und IRE-Grenzen.Unter den getesteten Wellenformen erzeugte die symmetrische 2-1-1-Burst-Wellenform die höchste IRE-Schwelle, während die unsymmetrische 2-1-1-Wellenform die niedrigste aufwies. Ein standardmäßiges monopolares Elektroporationsprotokoll mit 420 Volt führte zu einem zirkulären Transfektionsbereich mit einer RE-Schwelle von 642 Volt pro Zentimeter, führte jedoch nicht zum Zelltod, was eine Bestimmung der IRE-Schwelle verhinderte. Die Verformung des Gewebes im Laufe der Zeit aufgrund des Gelabbaus führte dazu, dass die transfizierten Regionen ihre kreisförmige Form verloren, was eine genaue Quantifizierung von RE und IRE erschwerte.Die Fehlausrichtung der Ring- und Stiftelektroden mit dem Boden der Vertiefung führte auch zu asymmetrischen, nicht kreisförmigen Transfektionsmustern, die die Schwellenmessung erschwerten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Optimierte Transfektion Strategie für Expression und elektrophysiologische Ableitung von rekombinantem Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T-Zellen

Eine mikrofluidische Vortex Assisted Elektroporation Plattform wurde für die sequentielle Übertragung mehrerer Moleküle in Zellpopulationen identisch mit präzisen und unabhängigen Steuer Dosierung entwickelt. Größe basiert Zielzelle Reinigungsschritt voran Elektroporation des Systems geholfen, um molekulare Lieferung Effizienz und verarbeitet die Lebensfähigkeit der Zellen zu verbessern.

Microscale Vortex-unterstützte Electroporator für Sequential Molekulare Liefer

Dieses Protokoll beschreibt die Mikrofabrikationstechniken, die erforderlich sind, um ein mikrofluidisches Lab-on-a-Chip-Elektroporationsgerät zu bauen. Der Versuchsaufbau führt kontrollierte Transfektionen auf Einzelzellebene in einem kontinuierlichen Fluss durch und kann mit populationsbasierter Kontrolle auf höhere Durchsätze erweitert werden. Es wird eine Analyse bereitgestellt, die die Fähigkeit zeigt, den Grad der Permeabilisierung der Zellmembran in Echtzeit elektrisch zu überwachen.

Herstellung und Betrieb eines kontinuierlichen Durchfluss-Mikroelektroporationssystems mit Permeabilisierungsdetektion

Diese Arbeit beschreibt die Entwicklung flexibler interdigitalisierter Elektroden für die Implementierung in 3D-Hirntumormodellen, nämlich In-vitro-Kultur, In-ovo-Modell und In-vivo-Mausmodell.  Die vorgeschlagene Methode kann verwendet werden, um die Wirkungen von gepulsten elektrischen Feldern auf Tumore unterschiedlicher Komplexität zu bewerten.

Flexible organische elektronische Bauelemente für die gepulste elektrische Feldtherapie des Glioblastoms

Die Elektroporation mit porösen Substraten (PSEP) kombiniert eine konsistente Abgabe mit hohem Durchsatz und einer hohen Zellviabilität. Die Einführung von transepithelialen elektrischen Impedanzmessungen (TEEI) gibt Einblick in die Zwischenprozesse von PSEP und ermöglicht eine markierungsfreie Verabreichung. In diesem Artikel wird eine Methode zur gleichzeitigen Durchführung von PSEP-Verabreichungsexperimenten und TEEI-Messanalysen erläutert.

Poröse substratbasierte Elektroporation mit transepithelialer elektrischer Impedanzüberwachung

Zur Untersuchung der Reaktionen erregbarer Zellen in vitro beschreibt das Protokoll die optische Überwachung von Änderungen der Aktionspotentialerzeugung aufgrund der Elektroporation an einem einfachen erregbaren Zellmodell von gentechnisch veränderten Tet-on-Spiking-HEK-Zellen sowie von Änderungen der Transmembranspannung mit automatisierter Extraktion relevanter Parameter.

Überwachung von Elektroporations-induzierten Veränderungen der Aktionspotentialbildung in gentechnisch veränderten Tet-On-Spiking-HEK-Zellen

Hier stellen wir die akute genetische Manipulation von geschnittenen menschlichen kortikalen Organoiden durch Elektroporation vor. Diese kortikalen Organoidmodelle eignen sich besonders gut für die Injektion, da ventrikelähnliche Strukturen nach dem Schneiden leicht identifiziert werden können, was die funktionelle Untersuchung der kortikalen Entwicklung des Menschen, neurologischer Entwicklungsstörungen und der kortikalen Evolution ermöglicht.

Elektroporation von geschnittenen humanen kortikalen Organoiden zur Untersuchung der Genfunktion

Unter Elektroporation versteht man die Verwendung von gepulsten elektrischen Feldern (PEFs), um transiente Poren in Zellkulturen zu erzeugen und molekulare Fracht einzubringen. Diese Technik ist in letzter Zeit in der Forschung und im klinischen Umfeld weit verbreitet. Hier beschreiben wir Elektroporationstechniken unter Verwendung des kürzlich entwickelten "Electroporation Cytometry System" für die Durchführung von Fluoreszenzmikroskopie mit lebenden Zellen.

Ein Elektroporationszytometrie-Protokoll für die Fluoreszenzmikroskopie lebender Zellen unter Verwendung von U2 OS-Zellkulturen

Hier stellen wir ein Protokoll zur Herstellung eines einzigartigen zweischichtigen mikrofluidischen Geräts vor, um die elektromechanische Regulation der Homöostase des Epithelgewebes zu untersuchen. Das Gerät legt statische physiologische elektrische Ströme senkrecht zur Gewebeebene an, die die Zell-Zell-Adhäsion, Proliferation und Extrusion beeinflussen. Lebendzell-Imaging und mechanische Stressmessungen enthüllen die Mechanismen dieser Prozesse.

Aufschluss über die elektromechanische Steuerung der Gewebehomöostase mit einem zweischichtigen mikrofluidischen Gerät

Dieses Protokoll beschreibt einen vollständigen, reproduzierbaren Arbeitsablauf für patientenspezifische Elektrofeldsimulation und Validierung der Elektrochemotherapie (EKT) bei Spinalmetastasen. Der Workflow integriert multimodale Bildgebung, halbautomatische und manuelle Segmentierung, Modellierung der Gewebeleitfähigkeit, lineare Finite-Elemente-Elektrofeldsimulation sowie experimentelle Validierung mittels postprozedurbasierter MRT-basierter Nekrose-Überlappungsanalyse.

Patientenspezifische Elektrofeldsimulation bei Spinalmetastasen Elektrochemotherapie

Erfahren Sie, wie computergestützte Modellierung reversible und irreversible Elektroporationsschwellen in dreidimensionalen Gewebemodellen quantifiziert. Diese Methode optimiert Transfektionsprotokolle für die Gewebeentwicklung.

Hochdurchsatzfähiges dreidimensionales Gewebemodell zur Quantifizierung von Elektroporationsschwellen

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