Hochdurchsatzfähiges dreidimensionales Gewebemodell zur Quantifizierung von Elektroporationsschwellen

Unsere Forschung konzentriert sich auf den Einsatz von Elektroporation, insbesondere bipolaren Mikrosekundenimpulsen, zur Behandlung von Krebs. Derzeit beschäftigen wir uns mit der Weichteilablation, aber wir werden auch zur In-vivo-Transfektion mit diesen Pulsen übergehen. Unser Protokoll ermöglicht Ihnen eine effizientere Anzeige der irreversiblen und reversiblen Elektroporationsschwellen.

Es kann auch ein bisschen besser sein als ein würfelbasiertes System, da es uns ermöglicht, in 3D statt in einer 2D-Umgebung zu sehen. Und eine 3D-Umgebung wäre dem, was wir im Gewebe sehen würden, viel ähnlicher. In Zukunft werden wir versuchen, das, was wir in diesem Modell sehen, in vivo zu übersetzen, und was dieses Modell wirklich tut, ist die Parameterauswahl zu beeinflussen, die wir treffen werden, wenn wir versuchen, Dinge wie DNA-Impfstoffe, Chemotherapien sowie CRISPR-Cas9-Systeme zu liefern.

Zu Beginn legen Sie die Zellsuspension und die erforderlichen Reagenzien in eine Biosicherheitswerkbank. Mischen Sie die vorbereitete Zellsuspension gründlich mit Rinderkollagenlösung Typ 1 im Verhältnis 1:1. Geben Sie die Mischung auf Eis oder in ein kaltes Perlbad, um eine vorzeitige Polymerisation zu verhindern.

Pipettieren Sie dann 500 Mikroliter der kombinierten Lösung, um den Boden jeder Vertiefung einer 12-Well-Platte zu beschichten. Schwenken Sie die Platte vorsichtig, um sicherzustellen, dass das Gel die Wände jeder Vertiefung berührt. Inkubieren Sie die Gele in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid für 6 Stunden oder bis die Gele fest werden.

Kippen Sie dann die Well-Platte und geben Sie vorsichtig 500 Mikroliter Kulturmedium in jede Well, wobei Sie es an der Wand der Platte hinuntergleiten lassen. Entfernen Sie die Kunststoffköderverbindung von zwei 1,64 Millimeter starken Spritzennadeln aus Edelstahl 304. Legen Sie eine Nadel beiseite, um als Stiftelektrode zu dienen.

Für die andere Nadel die letzten 5 Millimeter eines Endes flach drücken. Schneiden Sie dann ein Stück eines Rohrs aus Edelstahl 316 mit einem Durchmesser von 19 Millimetern ab, das lang genug ist, um bündig mit dem Boden einer Well-Platte zu sitzen, um die Ringelektrode zu erstellen. Entwerfen Sie einen Elektrodenhalter mit CAD-Software, um die Elektrodenkomponenten anzupassen.

Setzen Sie die Ring- und Stiftelektroden in den Elektrodenhalter ein, um die Elektrode zusammenzubauen, und drücken Sie die Nadel mit dem abgeflachten Ende in den Halter, um die Ringelektrode zu sichern. Kippen Sie in einer Biosicherheitswerkbank die vorbereitete Platte und aspirieren Sie 400 Mikroliter Kulturmedium aus jeder Vertiefung. Geben Sie 20 Mikroliter von 5 Mikrogramm pro Mikroliter grün fluoreszierender Proteinplasmidlösung in die aspirierten Vertiefungen.

Schwenken Sie die Platte vorsichtig, um sicherzustellen, dass sich die Lösung gleichmäßig auf der Geloberfläche verteilt. Inkubieren Sie die Gele in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid für 10 Minuten. Führen Sie anschließend den faseroptischen Temperaturfühler in die Stiftelektrode ein und beginnen Sie mit der Aufzeichnung der Temperatur.

Verbinden Sie die Plusleitung des Elektroporators mit der Stiftelektrode und die Minusleitung mit der Nadel und sichern Sie so die Ringelektrode. Schalten Sie nun die Heizplatte ein und erhitzen Sie die Gele, um eine Temperatur von 37 Grad Celsius zu halten. Führen Sie dann den zusammengebauten Ring und die Elektrode mit dem Temperaturfühler in die Vertiefung ein und stellen Sie sicher, dass das Gel eine Temperatur von 37 Grad Celsius erreicht hat.

Aktivieren Sie den Elektroporator, um die Behandlung durchzuführen. Geben Sie dann 100 Mikroliter Nährmedium zu allen Gelen, die trocken erscheinen, und fahren Sie mit dem Elektrbetrieb aller unbehandelten Gele fort. Sobald alle Behandlungen abgeschlossen sind, inkubieren Sie die Gele in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für 10 Minuten.

Geben Sie nach der Inkubation vorsichtig 500 Mikroliter Nährmedium in jede Vertiefung entlang der Wand der Platte. Inkubieren Sie die Gele erneut für 24 Stunden im befeuchteten Inkubator. Kippen Sie die Platte und saugen Sie das Nährmedium aus jeder Vertiefung ab.

Geben Sie dann vorsichtig 500 Mikroliter PBS in jede Vertiefung entlang der Wände der Platte. Inkubieren Sie die Gele in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für 5 Minuten. Saugen Sie dann das PBS aus jeder Vertiefung an.

Geben Sie vorsichtig 500 Mikroliter PBS in jede Vertiefung, indem Sie es an der Wand der Platte hinuntergleiten lassen. Schwenken Sie die Platte vorsichtig, kippen Sie sie dann und saugen Sie das PBS aus jeder Vertiefung an. Geben Sie nun 100 Mikroliter frisches PBS in jede Vertiefung, um die Gele für die Bildgebung mit Feuchtigkeit zu versorgen.

Nehmen Sie dann die Platte mit Standard-Fluoreszenzmikroskopietechniken ab. Nach der Bildgebung 500 Mikroliter Nährmedium in jede Vertiefung der Platte geben und 24 Stunden lang inkubieren. Wiederholen Sie den vollständigen Imaging- und Wiederherstellungs-Workflow für jeden angegebenen Zeitpunkt.

Nachdem Sie ein Berechnungsmodell erstellt haben, verwenden Sie die Mikroskopsoftware, um den Durchmesser sowohl der äußeren als auch der inneren Kanten des torusförmigen Bereichs entlang der vertikalen und horizontalen Achse zu messen. Mitteln Sie den Außen- bzw. Innendurchmesser und dividieren Sie durch 2, um die entsprechenden Radien zu berechnen. Leiten Sie abschließend mithilfe der zuvor erstellten Nachschlagetabelle die Intensität des elektrischen Feldes bei den gemessenen Radien ab.

Der äußere Radius des transfizierten Bereichs wurde verwendet, um die reversible Elektroporations- oder RE-Schwelle zu quantifizieren, indem er mit elektrischen Feldstärken aus einem Computermodell korreliert wurde. Während der innere Radius zur Bestimmung der irreversiblen Elektroporations- oder IRE-Schwelle verwendet wurde. Alle drei bipolaren Mikrosekunden-Pulsprotokolle führten zu torusförmigen Transfektionsregionen mit deutlich sichtbaren RE- und IRE-Grenzen.

Unter den getesteten Wellenformen erzeugte die symmetrische 2-1-1-Burst-Wellenform die höchste IRE-Schwelle, während die unsymmetrische 2-1-1-Wellenform die niedrigste aufwies. Ein standardmäßiges monopolares Elektroporationsprotokoll mit 420 Volt führte zu einem zirkulären Transfektionsbereich mit einer RE-Schwelle von 642 Volt pro Zentimeter, führte jedoch nicht zum Zelltod, was eine Bestimmung der IRE-Schwelle verhinderte. Die Verformung des Gewebes im Laufe der Zeit aufgrund des Gelabbaus führte dazu, dass die transfizierten Regionen ihre kreisförmige Form verloren, was eine genaue Quantifizierung von RE und IRE erschwerte.

Die Fehlausrichtung der Ring- und Stiftelektroden mit dem Boden der Vertiefung führte auch zu asymmetrischen, nicht kreisförmigen Transfektionsmustern, die die Schwellenmessung erschwerten.