Microscale Vortex-unterstützte Electroporator für Sequential Molekulare Liefer

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, verschiedene Arten von biologisch bedeutsamen Molekülen sequentiell und dosierbar mit hoher Effizienz unter Verwendung des Vortex-unterstützten mikrofluidischen Porers zu verabreichen, dies wird erreicht, indem zunächst vier 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen einzeln vorbereitet werden, die DPBS-Lösungen mit Zellen und Biomolekülen enthalten, und jedes Röhrchen an seinem jeweiligen Fläschchenhalter befestigt wird, der mit dem pneumatischen Durchflussregelungssystem verbunden ist. Der zweite Schritt besteht darin, die Einlassschläuche aus dem jeweiligen Fläschchen mit den eingebetteten 15-poligen Elektroden in das mikrofluidische Gerät einzuführen. Als nächstes werden die Zellen in das Gerät gepumpt, wo sie in mikroskaligen Wirbeln gefangen werden, die sich in den Elektroporationskammern bilden.

Der letzte Schritt besteht darin, kurze elektrische Impulse auf die gefangenen Zellen anzuwenden und anschließend die Lösungen mit den zu verabreichenden Biomolekülen in das Zytosol zu injizieren. Letztendlich können die aus diesem Prozess gewonnenen Zellen freigegeben und für die nachgelagerte Analyse gesammelt werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass die vorgeschlagene Technik in der Lage ist, sequenziell eine kontrollierte Menge mehrerer Moleküle in eine vorausgewählte identische Zellpopulation mit hoher Effizienz und Lebensfähigkeit zu liefern.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte des Flüssigkeitsaustauschs aufgrund des Timings des Kaltflussschritts bei jeder Lösung schwer zu erlernen sind. Der Schaltschritt bestimmt die Stabilität des Zelleinfangs. Eine metastasierte Brustkrebszelllinie M-D-A-M-B 2 31 wird in dieser Versuchsplatte einmal 10 bis 10 Zellen pro Milliliter in einem Volumen von 10 Millilitern pro T 75 Gewebekulturkolben in Leibovitz' L 15 Medium, ergänzt mit 10 Vol.-%, fötalem Rinderserum und 1 %Penicillin, verwendet.

Streptomycin inkubiert die Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius mit einer Umgebung von 0 % Kohlendioxid. Ernten Sie die Zellen zwei Tage nach der Aussaat für Experimente. Nach dem Waschen der Zellen mit Bukosphosphat, gepufferter Kochsalzlösung oder DPBS behandeln Sie die Zellen zwei Minuten lang mit 0,25%igen Tripsin EDTA.

Es werden acht Milliliter Wachstumsmedien zugegeben, um die enzymatische Aktivität zu inaktivieren: Pelletzellen durch Zentrifusion für fünf Minuten bei 200 mal G und resuspendierte Medien bis zu einer Endkonzentration von fünfmal 10 bis zu den fünften Zellen pro Milliliter. Der Aufbau und die Herstellung des mikrofluidischen Elektroporationsgeräts wird in diesem Video nicht gezeigt, sondern im begleitenden Manuskript beschrieben. Das System besteht aus Einlässen für Zellen, Molekülen und einer Spüllösung.

Zwei gerade Kanäle, in denen die Trägheitsfokussierung stattfindet. 10 Elektroporationskammern mit Elektroden und einem Ausgang für die Strömungsexperimente. Führen Sie eine Steckdose, einen Polyether-, Etherketon- oder Peak-Schlauch und die 15-polige Aluminiumelektrode für Kurzpuls- und Hochspannungsanwendungen über die Löcher im Mikrokanal an die dafür vorgesehenen Stellen ein.

Die 15-polige Elektrode besteht aus 10 positiven und fünf negativen Elektroden. Jede positive Elektrode hat einen Abstand von 1,5 Millimetern zu einer negativen Elektrode, und jede Elektrode mit der gleichen Polarität hat einen Abstand von 1,35 Millimetern. Schließen Sie die elektrische Ausrüstung zur Erzeugung kurzer Rechteckimpulse mit hoher Spannung an die Aluminiumelektroden an, die mit fließenden Lösungen in Kontakt kommen.

Bei der PDMS-Form sollte die Anlage aus einem Impulsgeber und einem eigens gebauten Hochspannungsverstärker bestehen. Bereiten Sie vier 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen einzeln vor, die DPBS und Lösungen mit Zellen und Molekülen enthalten. Befestigen Sie jedes Röhrchen an seinem jeweiligen Fläschchenhalter, der mit dem pneumatischen Durchflussregelungssystem verbunden ist.

Verbinden Sie den Einlassspitzenschlauch von den Fläschchenhaltern mit den entsprechenden Einlasslöchern im mikrofluidischen Gerät. Als nächstes setzen. Die Größe der Rechteckwelle pulsiert Volt bis 100 Volt.

Um die elektrische Feldstärke über die Elektroporationskammer zu haben, muss sie 0,7 Kilovolt pro Zentimeter betragen. Stellen Sie den Druckregler auf 40 PSIA ein, eine einzige, manuell einstellbare Stickstoffquelle wird verwendet, um alle Probengefäße gleichmäßig unter Druck zu setzen, und verwendet einen Hochgeschwindigkeitsverteiler, um einzelne Lösungsanschlüsse rechtzeitig zu aktivieren. Mit der speziell entwickelten Laboransichtssoftware für die Ventilsteuerung.

Öffnen Sie die Lab-View-Software mit der Bezeichnung Valve Runner und klicken Sie im Dropdown-Menü mit dem Titel Operate auf Run. Klicken Sie auf das entsprechende Ventilsymbol Ventil eins, um das Ventil für das DPBS-Reservoir zu öffnen und die für die Erzeugung eines stabilen Zellfangwirbels erforderliche Durchflussgeschwindigkeit für 1,5 Minuten zu aktivieren. Das Ventilsymbol sollte von grau auf grün wechseln, wenn der Durchfluss aktiviert wird, wobei sowohl Wasch- als auch Zelllösungen gleichzeitig 10 Sekunden lang durch das Gerät fließen, bevor der Zellfangschritt beginnt.

Um einen ungestörten Fluss während des Lösungswechsels zu gewährleisten, sollte dieser kurze Co-Flow-Schritt bei jedem Lösungswechselschritt wiederholt werden. Schalten Sie den aktiven Lösungsanschluss von der Waschlösung auf die Zelllösung um, um die Zellen 30 Sekunden lang in der Elektroporationskammer einzufangen. In diesem Film stellen die blau fluoreszierenden Signale brauchbare Hooks dar.

3, 3, 3, 4, 5 Stufen Zellen. Schalten Sie den Waschanschluss ein und spülen Sie das Gerät 20 Sekunden lang. Um nicht eingeschlossene kontaminierende Zellen zu entfernen, fließt die Lösung, die das erste Molekül von Interesse enthält.

Propidiumiodid zu Visualisierungszwecken in das Gerät einbringen. In dieser Demonstration werden Nukleinsäurefarbstoffe anstelle von fluoreszenzmarkierten DExT-Strängen verwendet, da die Farbstoffe ein hervorragendes Rausch-Signal-Verhältnis aufweisen. Unmittelbar nach der Injektion der molekularen Lösung werden fünf kurze Pulse angewendet. Überwachen Sie die Größe und Anzahl der angelegten elektrischen Pulse in Echtzeit mit einem Oszilloskop, die Fluoreszenzsignale der Moleküle können unter dem Mikroskop sichtbar gemacht werden. Inkubieren Sie die Zellen für 100 Sekunden in der molekularen Lösung. Als nächstes fließt die Lösung, die das zweite Molekül, den Nukleinsäurefarbstoff Jo-Jo, enthält, in das Gerät.

In dieser Demonstration wird das zweite Molekül ohne zusätzliche elektrische Impulsanwendungen abgegeben. Dieser Film bestätigt, dass die Zellen nun alle drei Fluoreszenzsignale exprimieren. Grün für Jo-Jo, eins, Rot für Propidium, Jodid und Blau für Haken.

3, 3, 3, 4, 5. Geben Sie die Zellen für die nachgelagerte Analyse in eine 96-Well-Platte frei, indem Sie den Betriebsdruck auf unter fünf PSI senken. Aus jeder Freisetzung werden ca. 100 Mikroliter Lösung mit 100 Zellen gesammelt.

Der Elektroporationsvorgang muss mindestens dreimal wiederholt werden, um genügend Zellen für die Durchflusszytometrie-Zentrifuge zu sammeln. Die 96-Well-Platte enthält die prozessierten Zellen bei 228-fachem G für fünf Minuten. Entfernen Sie bei Raumtemperatur den Überstand, der überschüssige fluoreszierende Moleküle enthält, und resuspendieren Sie die Zellen in DPBS.

Wurden fluoreszenzmarkierte DExT-Stränge abgegeben, werden die Zellen anschließend auf molekulare Aufnahme hin analysiert. Effizienz durch Durchflusszytometrie. Die erfolgreiche molekulare Verabreichung wurde qualitativ durch die Überwachung von Änderungen der Fluoreszenzintensität von elektroporierten umlaufenden Zellen in C zwei bestimmt, was bestätigte, dass 90% der behandelten Zellen das 70.000 Dalton, ein ionisches DExT-Strangmolekül, aufnehmen.

Der Wirkungsgrad für jedes übertragene Dextranmolekül, definiert als das Verhältnis der Anzahl der Zellen, die das interessierende Molekül erfolgreich aufnehmen, zur Gesamtzahl der verarbeiteten Zellen variierte nicht wesentlich in Abhängigkeit vom Molekulargewicht oder den elektrischen Ladungen. Alle getesteten Dextran-Moleküle wurden mit einem Wirkungsgrad von mehr als 70 % in das Zytosol eingebracht. Hier sehen Sie unsere repräsentativen Durchflusszytometrie-Profile für Zellen, die nicht mit Elektroporation behandelt wurden. Die Fluoreszenzschwelle, die eine erfolgreiche molekulare Abgabe anzeigt, wird aus den Daten so eingestellt, dass die Signale von Kontrollproben unterhalb der Schwelle zu finden sind.

Diese repräsentativen Durchflusszytometrie-Daten für sequentiell elektroporierte Zellen zeigen das Durchflusszytometrie-Diagramm neben den Fluoreszenzstreifenbildern, die grünen Felder stellen Signale von Zellen dar, die 3000 aufnehmen, Dalton neutrales Dextran nur und die roten Felder stellen Signale von Zellen dar. Die Aufnahme von 3000 Dalton, einem ionischen DExT-Strang, fluoresziert nur Signale von Zellen, die aufnehmen, zeigen beide gelb dargestellten DExT-Strangmoleküle eine duale Molekülabgabeeffizienz von 56% nach seiner Entwicklung an. Diese Technik wird für Forscher auf dem Gebiet der Medizin, Biotechnologie und Pharmakologie nützlich sein, um die Kombination von therapeutischen Reagenzien zu erforschen, um synergetische Effekte bei der Behandlung komplexer Krankheiten zu erzielen.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit elektrischen Hochspannungsimpulsen äußerst gefährlich sein kann, und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, wie z. B. die Sicherstellung, dass Sie geerdet sind.