Name: Optimierte Transfektion Strategie für Expression und elektrophysiologische Ableitung von rekombinantem Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T-Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-19T18:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: Lernen Sie eine optimierte Transfektionsstrategie für die Expression und elektrophysiologische Ableitung rekombinanter spannungsgesteuerter Ionenkanäle in HEK-293T-Zellen. Diese Methode verbessert Zelladhäsion und Membranstabilität.

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Diese Arbeit wurde durch ein Discovery Betriebskostenzuschuss zur JDS aus den Naturwissenschaften und unterstützten Engineering Research Council (NSERC) of Canada, ein NSERC Alexander Graham Bell Canada Graduate-Stipendien (Promotion) (zu A. Senatore) und die Heart and Stroke Foundation, Grant -In-Aid NA # 6284.

<ol><li>Thomas, P., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEK293+cell+line%3A+A+vehicle+for+the+expression+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins.</a> J. Pharmacological and Toxicological Methods. 51, 187-200 (2005).</li>
<li>Senatore, A., Spafford, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+and+big+are+key+features+of+an+invertebrate+T-type+channel+%28LCav3%29+from+the+central+nervous+system+of+Lymnaea+stagnalis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Transient and big are key features of an invertebrate T-type channel (LCav3) from the central nervous system of Lymnaea stagnalis.</a> Journal of Biological Chemistry. 285, 7447-7458 (2010).</li>
<li>Ogden, D., Stanfield, P. Patch clamp techniques for single channel and whole-cell recording. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOgden%2C+D+%22Microelectrode+techniques%3A+the+Plymouth+workshop+handbook%22">Microelectrode techniques: the Plymouth workshop handbook</a>. , The Company of Biologists. Cambridge. (1987).</li>
<li>Molleman, A. Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology. , John Wiley & Sons Ltd. England. (2003).</li>
<li>Peng, S. -Q., Hajela, R. K., Atchison, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+flow-induced+increase+in+inward+Ba2%2B+current+expressed+in+HEK293+cells+transiently+transfected+with+human+neuronal+L-type+Ca2%2Bchannels%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Fluid flow-induced increase in inward Ba2+ current expressed in HEK293 cells transiently transfected with human neuronal L-type Ca2+channels.</a> Brain Research. 1045, 116-123 (2005).</li>
</ol>

Die Möglichkeit, whole-cell Ströme unter Verwendung der beschriebenen Protokolle und Lösungen Datensatz zeigt, dass die Transfektion erfolgreich war und dass die gewünschte Spannung Ionenkanälen oder Ionenkanal-Komplexe vorhanden sind, mit erheblichen Mengen an der Zellmembran. Sollten die Zellen positiv transfiziert werden (dh grün fluoreszierend), aber nicht beschreibbare Strömungen, zusätzliche Zeit bei 28 ° C erforderlich, um für die Kanal-Protein richtig verpackt werden und in die Zellmembran ermöglichen kann. Beac...

<table border="1"><tr><td> Material </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentar </td></tr><tr><td> pIRES2-EGFP-Plasmid </td><td> Clontech </td><td> 6029-1 </td><td></td></tr><tr><td> Kreis Deckgläser </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-545-80 </td><td> Circles Nr. 1 bis 0,13 bis 0,17 mm dick, Größe: 12mm </td></tr><tr><td> Verstärker </td><td> Axon Instruments </td><td> Axopatch 200B oder 700B Multiclamp </td><td></td></tr><tr><td> Data Acquisition System </td><td> Axon Instruments </td><td> Digidata 1440A </td><td></td></tr><tr><td> Elektrophysiologie Software </td><td> Axon Instruments </td><td> pClamp10.1 </td><td></td></tr><tr><td> Pipette Manipulatoren </td><td> Sutter Instrument Co. </td><td> MPC-385-2 </td><td></td></tr><tr><td> Epifluoreszenz inversen Mikroskop </td><td> Zeiss Kanada </td><td> Axiovert 40 CFL </td><td></td></tr><tr><td> Headstage </td><td> Axon Instruments </td><td> CV-7B </td><td></td></tr><tr><td> Headstage Elektrodenhalter </td><td> Axon Instruments </td><td> 1-HL-U </td><td></td></tr><tr><td> Mikroelektroden-Halter für Masseelektrode </td><td> World Precision Instruments </td><td> MEH3RF 15 </td><td></td></tr><tr><td> Elektrophysiologie Kapillarrohre </td><td> Sutter Instrument Co. </td><td> BF-150-86 bis 15 </td><td> Borosilikatglas mit Filament, OD 1,5 mm, OD 0.86mm, 15cm lang </td></tr><tr><td> Flaming / Brown Micropipette Puller </td><td> Sutter Instrument Co. </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Micropipette Feuer Polierer </td><td> Narishige </td><td> Micro Forge MF-830 </td><td></td></tr><tr><td> Micro Medikament Perfusionssystem </td><td> AutoMate Scientific </td><td> SmartSquirt8 Valvelink8.2 </td><td></td></tr><tr><td> Drug Perfusionssystem </td><td> AutoMate Scientific </td><td> Valvelink8.2 mit Teflon-Ventile </td><td></td></tr></table>

optimierte transfektion strategie für expression und elektrophysiologische ableitung von rekombinantem voltage-gated ion channels in hek-293t-zellen

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

Die in vitro-Expression und elektrophysiologische Ableitung von rekombinanten Spannungs-gesteuerte Ionenkanäle in kultivierten menschlichen embryonalen Nierenzellen (HEK-293T) ist eine weit verbreitete Forschungsstrategie. HEK-293T-Zellen müssen auf Deckgläschen bei niedrig genug Dichte ausplattiert werden, so dass sie nicht in Kontakt miteinander sind, um für die elektrophysiologische Ableitung ohne verwirrende Effekte durch mit benachbarten Zellen wenden können. Transfizierte Kanäle müssen auch mit hoher Effizienz zum Ausdruck an der Plasmamembran für whole-cell Patch-Clamp-Aufzeichnung von nachweisbaren Ströme über Geräuschpegel. Heterologe Ionenkanäle benötigen oft lange Inkubationszeiten bei 28 ° C nach der Transfektion, um eine ausreichende Membran-Expression zu erreichen, aber es gibt immer mehr Verluste von Zell-Adhäsions-und Deckglas Membranstabilität bei dieser Temperatur. Um dieses Problem zu umgehen, entwickelten wir eine optimierte Strategie zur Transfektion und Platte HEK-293T-Zellen. Diese Methode erfordert, dass die Zellen auf einem relativ hohen Konfluenz transfiziert werden, und bei 28 ° C für unterschiedliche Inkubationszeiten nach der Transfektion für eine angemessene Ionenkanal-Protein-Expression zu ermöglichen. Die transfizierten Zellen werden dann auf Deckgläschen ausplattiert und bei 37 ° C für mehrere Stunden, die für starre Bindung an die Zelle Deckgläser und Membran Restabilisierung ermöglicht. Die Zellen können kurz nach der Beschichtung erfasst werden, oder kann bis 28 ° C für weitere Inkubation übertragen werden. Wir finden, dass die anfängliche Inkubation bei 28 ° C, nach der Transfektion, aber vor dem Ausplattieren Schlüssel für die effiziente Expression heterologer Ionenkanäle, die normalerweise nicht exprimieren auch an der Plasmamembran ist. Positiv transfiziert werden kultivierten Zellen durch Co-Ausdruck eGFP oder eGFP identifiziert ausgedrückt aus einer bicistronischen Vektor (zB pIRES2-EGFP) mit dem rekombinanten Ionenkanal cDNA kurz vor einer internen Ribosomeneintrittsstelle und eine eGFP kodierende Sequenz. Whole-cell Patch-Clamp-Aufzeichnung erfordert spezialisierte Einrichtungen, sowie die Crafting aus poliertem Aufnahme Elektroden und L-förmigen Masseelektroden aus Borosilikatglas. Drug-Delivery zur Pharmakologie von Ionenkanälen Studie kann direkt Mikropipettierung Drogen in die Aufnahme Gericht oder durch Verwendung Mikroperfusion oder Abflussrohre Systeme, die ununterbrochene Ströme von Drogen-Lösung produzieren über aufgezeichneten Zellen erreicht werden.

Zuverlässige Methode für hocheffiziente<em&gt; In-vitro-</em&gt; Ausdruck und die anschließende elektrophysiologische Ableitung von rekombinanten Spannungs-gesteuerte Ionenkanäle in kultivierten menschlichen embryonalen Nierenzellen (HEK-293T).

Optimierte Transfektion Strategie für Expression und elektrophysiologische Ableitung von rekombinantem Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T-Zellen

Die In-vitro-Expression und elektrophysiologische Aufzeichnung rekombinanter spannungsgesteuerter Ionenkanäle in kultivierten menschlichen embryonalen Nierenzellen (HEK-293T) ...

Die Elektrophysiologie wird häufig verwendet, um die Aktivität rekombinanter spannungsabhängiger Ionenkanäle in kultivierten humanen embryonalen Nierenzellen zu untersuchen. Für eine erfolgreiche Ableitung ist erforderlich, dass die Zellen Kanäle in ausreichender Menge an der Zellmembran exprimieren, um sie nachweisen zu können, und dass die Zellen in geringer genug Zelldichte ausgesät werden, um einzelne Zellen isolieren zu können. Die Durchführung von Zellableitungen wird häufig durch die langen Inkubationszeiten bei 28 Grad Celsius, die für eine solche Expression notwendig sind, erschwert, da dabei typischerweise ein Verlust der Zelladhäsion und Membranstabilität auftritt.Hier wird eine optimierte Methode für die Zellkultur und Transfektion vorgestellt, die diese Probleme umgeht. Die Zellen werden bei mäßiger Konfluenz transfiziert und anschließend bei 28 Grad Celsius inkubiert, bis eine ausreichende Expression der Ionenkanäle erreicht ist. Die transfizierten Zellen werden dann mit geringer Dichte auf Glasdeckenplättchen ausplattiert und für mehrere Stunden bei 37 Grad Celsius inkubiert, um die Zellanheftung und Membranstabilisierung zu ermöglichen.Einmal passend platzierte Zell

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir werden zeigen, wie man die Wirkung einer einzelnen Punktmutation auf die Funktion eines Ionenkanals zu studieren.

Mutagenese und funktionale Analyse von Ionenkanälen heterolog in Säugerzellen exprimierten

Beschrieben wird hier ein Verfahren zur Erlangung weite Strecken der aktuellen Aufnahme von einem Ionenkanal mit der Cell-Attached-Patch-Clamp-Technik. Diese Methode erlaubt die Beobachtung in Echtzeit, das Muster der Öffnungs-Schließ-Kanal-Konformationen, die die biologische Signal zugrunde liegen. Diese Daten informieren über Kanaleigenschaften in ungestörten biologischen Membranen.

Ein-Kanal-Cell-Attached-Patch-Clamp-Aufnahme

Die Expression rekombinanter Proteine durch Säugetiersysteme wird zu einer attraktiven Methode zur Herstellung von Proteinkomplexen für die Strukturbiologie. Hier stellen wir ein einfaches, aber hocheffizientes Expressionssystem vor, bei dem suspensionsgezüchtete Säugetierzellen zur Aufreinigung von Proteinkomplexen für Strukturstudien verwendet werden.

Expression rekombinanter Proteine ​​für Strukturbiologie in HEK 293F Suspensionszellen: eine neue und Barriere Ansatz

Es wird ein Verfahren zur Abbildung von Änderungen des Membranpotentials unter Verwendung genetisch kodierter Spannungsindikatoren beschrieben.

Imaging Membrane Potential mit zwei Arten von genetisch kodierten Fluorescent Spannungssensoren

Die Produktion von eukaryotischen Proteinen im Labormaßstab mit entsprechender posttranslationaler Modifikation stellt ein erhebliches Hindernis dar. Hier ist ein robustes Protokoll mit schneller Etablierung und Durchlaufzeit für die Proteinexpression unter Verwendung eines Säugetier-Expressionssystems. Dieses System unterstützt die selektive Aminosäuremarkierung, die selektive Markierung von Proteinen und die kleinmolekulare Modulatoren der Glykanzusammensetzung.

High Yield Expression von rekombinanten humanen Proteinen mit der transiente Transfektion von HEK293 Zellen in Suspension

Studieren Ionenkanäle durch ein heterolog exprimierenden System hat eine Kerntechnik in der biomedizinischen Forschung. In diesem Manuskript stellen wir eine zeiteffiziente Methode streng kontrollierten Ionenkanal-Expression durch Durchführung transienter Transfektion unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors zu erzielen.

Steuerbare Ionenkanal-Expression durch induzierbare Transiente Transfektion

Neue therapeutische Strategien in der kardialen regenerativen Medizin erfordern umfangreiche und detaillierte Studien in großen präklinischen Tiermodellen, bevor sie für den Einsatz beim Menschen betrachtet werden können. Hier zeigen wir eine perkutane Kontrast-Echokardiographie-geführte Intramyocardial-Injektionstechnik bei Kaninchen, die ist wertvoll für Hypothesentests die Wirksamkeit solcher neuartiger Therapien.

Perkutane Kontrast-Echokardiographie-geführte Intramyocardial-Injektion und Zelle-Lieferung in einem großen präklinischen Modell

Hier wird ein Protokoll für die Einzelzellelektroporation vorgestellt, das Gene sowohl in exzitatorischen als auch in inhibitorischen Neuronen über eine Reihe von In-vitro-Hippocampus-Schichtkulturaltern hinweg liefern kann. Unser Ansatz bietet eine präzise und effiziente Expression von Genen in einzelnen Zellen, mit denen zellautonome und interzelluläre Funktionen untersucht werden können.

Einzelzell-Elektroporation über verschiedene organotypische Slice-Kulturen von Hippocampus-Exzitatorischen und klassenspezifischen inhibitorischen Neuronen der Maus

Unter Verwendung des kostengünstigen kationischen Polymers Polyethylenimin (PEI) produzierten wir lentivirale Partikel für die stabile Expression von shRNAs in H9-humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) und transienten H9-abgeleiteten neuralen Vorläuferzellen (NPCs) mit hoher Effizienz.

Lentiviral vermittelte Abgabe von shRNAs an hESCs und NPCs unter Verwendung des kostengünstigen kationischen Polymers Polyethylenimin (PEI)

Das rekombinante Adeno-assoziierte Virus (rAAV) wird häufig für die klinische und präklinische Genverabreichung eingesetzt. Eine unterschätzte Anwendung für rAAVs ist die robuste Transduktion von kultivierten Zellen, ohne dass eine Aufreinigung erforderlich ist. Für Forscher, die neu in der rAAV sind, stellen wir ein Protokoll für das Klonen von Transgenkassetten, die Produktion von Rohvektoren und die Transduktion von Zellkulturen zur Verfügung.

Transgenexpression in kultivierten Zellen mit ungereinigten rekombinanten Adeno-assoziierten viralen Vektoren

Zur Untersuchung der Reaktionen erregbarer Zellen in vitro beschreibt das Protokoll die optische Überwachung von Änderungen der Aktionspotentialerzeugung aufgrund der Elektroporation an einem einfachen erregbaren Zellmodell von gentechnisch veränderten Tet-on-Spiking-HEK-Zellen sowie von Änderungen der Transmembranspannung mit automatisierter Extraktion relevanter Parameter.

Überwachung von Elektroporations-induzierten Veränderungen der Aktionspotentialbildung in gentechnisch veränderten Tet-On-Spiking-HEK-Zellen

Lernen Sie eine optimierte Transfektionsstrategie für die Expression und elektrophysiologische Ableitung rekombinanter spannungsgesteuerter Ionenkanäle in HEK-293T-Zellen. Diese Methode verbessert Zelladhäsion und Membranstabilität.

Optimierte Transfektion Strategie für Expression und elektrophysiologische Ableitung von rekombinantem Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T-Zellen (Video) | JoVE Journal

Optimierte Transfektion Strategie für Expression und elektrophysiologische Ableitung von rekombinantem Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T-Zellen

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