Optimierte Transfektion Strategie für Expression und elektrophysiologische Ableitung von rekombinantem Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T-Zellen

Die Elektrophysiologie wird häufig verwendet, um die Aktivität rekombinanter spannungsgesteuerter Ionenkanäle in kultivierten menschlichen embryonalen Nierenzellen zu untersuchen. Eine erfolgreiche Aufzeichnung setzt voraus, dass die Zellen Kanäle in ausreichender Menge an der Zellmembran exprimieren, um nachgewiesen zu werden, und dass die Zellen mit einer ausreichend geringen Zelldichte für die Isolierung einzelner Zellen plattiert werden. Die Durchführung von Zellaufzeichnungen wird häufig durch die langen Inkubationszeiten bei 28 Grad Celsius erschwert, die für eine solche Expression erforderlich sind und bei denen es typischerweise zu einem Verlust der Zelladhäsion und der Membranstabilität kommt.

Hier wird eine optimierte Methode zur Zellkultur und Transfektion demonstriert, die diese Probleme umgeht. Die Zellen werden bei moderater Kofluenz transfiziert und dann bei 28 Grad Celsius inkubiert, bis eine adäquate Ionenkanalexpression erreicht ist. Die transfizierten Zellen werden dann bei geringer Dichte auf Glasdeckgläser plattiert und mehrere Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubiert, um eine Zelladhäsion und Membranstabilisierung zu ermöglichen.

Sobald die Zellen entsprechend plattiert sind, werden sie durch co-exprimiertes EGFP und Ganzzell-Patch-Clamp identifiziert. Es kann eine Aufzeichnung durchgeführt werden oder die Zellen können erneut bei 28 Grad Celsius inkubiert werden. Um die Oberflächenexpression der Kanäle weiter zu erhöhen, deuten die Ergebnisse von Aufzeichnungsexperimenten an Zellen, die mit spannungsgesteuerten Kalziumkanälen transfiziert wurden, wie z. B. L CAV eins, L CAV zwei oder L cav drei darauf hin, dass die Kanäle erfolgreich transfiziert und von den Zellen exprimiert wurden.

Obwohl nur repräsentative Ergebnisse für L CAV drei gezeigt werden In unserem Labor haben wir eine Methode entwickelt, um die Expression von schlecht exprimierenden Ionenkanalgenen für die Patch-Clamp-Aufzeichnung in humanen Zelllinien zu verbessern. Der konventionelle Ansatz besteht nun darin, zunächst die Zellen auf den Deckgläsern zu spalten und mit Plasma-CDNAs zu transfizieren, die die Ionenkanalgene enthalten, und dann über viele Tage bei 28 Grad Celsius zu inkubieren, um eine hocheffiziente Ionenkanalexpression vor der elektrophysiologischen Aufzeichnung zu erreichen. Unser neuer Ansatz reduziert die erforderliche Inkubationszeit bei 28 Grad Celsius vor der Aufzeichnung erheblich.

Durch die Verkürzung der Inkubationszeit von 28 Grad stellen wir fest, dass die Zellmembranen viel stabiler sind und die transfizierten Zellen viel stärker an den Deckgläsern haften. Dies erhöht die Anzahl der beschreibbaren Zellen und macht das Experimentieren deutlich effizienter. Vor der Transfektion wird ein vollständig konfluenter Kolben mit HEK 2 9 3 T-Zellen von einer bis vier in einen neuen 25 Zentimeter großen Kolben aufgeteilt und die Zellen in einen 37 Grad Celsius heißen 5%igen Kohlendioxid-Inkubator gegeben.

Lassen Sie die Zellen drei bis vier Stunden lang anheften, nach vier Stunden untersuchen Sie die Zellen durch differentiellen Interferenzkontrast, um die Anheftung zu überprüfen. Beachten Sie, dass die Zellen nicht mehr rund aussehen und abgeflacht werden. Fortsätze oder Pseudopodien sind sichtbar.

Weniger Konfluenzzellen würden gleich aussehen, aber weiter voneinander entfernt sein. Sobald sich die Zellen anheftet haben, kombinieren Sie die notwendigen Reagenzien, um eine Standard-Calciumphosphat-Transfektion durchzuführen. Bereiten Sie insgesamt 12 Mikrogramm DNA in 600 Mikrolitern Transfektionslösung pro Kolben vor.

Hier werden CDNAs aus verschiedenen Ionenkanälen in das P-I-R-E-S zwei EGFP-Plasmid kloniert. Transfektion dieses Expressionsvektors in eine Säugetierzelllinie. Führt zur Herstellung eines verstärkten grün fluoreszierenden Proteins aus derselben mRNA wie das klonierte Insert durch Translation, die an einer internen Ribosomeneintrittsstelle direkt stromabwärts der Ionenkanal-Beschichtungssequenz und stromaufwärts der EGFP-Beschichtungssequenz initiiert wird. Dies ermöglicht die Identifizierung positiv transfizierter Zellen ohne mögliche Beeinträchtigung der Proteinfunktion, die durch die direkte Fusion des EGFP-Proteins mit dem interessierenden Protein verursacht werden kann.

Pipettieren Sie die Transfektionslösung tropfenweise über die Zellen, schwenken Sie den Kolben vorsichtig und stellen Sie ihn am nächsten Tag über Nacht in den 37 Grad Celsius heißen Inkubator. Überprüfen Sie die Transfektionseffizienz, indem Sie die Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop betrachten. Positiv transfizierte Zellen sollten in der gesamten Zelle grün erscheinen.

Sobald die Transfektion verifiziert ist, werden vorsichtig vier bis fünf Milliliter warmes Medium in den umgedrehten Kolben pipettiert. Waschen Sie die Zellen, indem Sie den Kolben langsam umdrehen, so dass die Zelloberfläche nach unten zeigt, und den Kolben so wiegen, dass sich die Waschlösung sanft über sie bewegt. Entfernen Sie das Medium und wiederholen Sie diese Wäsche.

Treten Sie noch zwei weitere Male auf. Dann gibst du sechs Milliliter Medium in den Kolben und inkubierst zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Die Expression von wirbellosen Ionenkanälen stellt einige Herausforderungen dar.

Erstens sind sie oft von großer Größe und können daher lange brauchen, um am endoplasmatischen Retikulum zu translatieren. Außerdem sind sie möglicherweise nicht effizient auf die Zellmembran in einer Säugetierzelllinie ausgerichtet. Da verschiedene Spezies unterschiedliche Codon-Nutzungshäufigkeiten aufweisen, können heterologe CDNAs hohe Häufigkeiten von Codons aufweisen, die in Säugetierzellen wie HEK 2 9 3 T ungewöhnlich sind, um einige dieser Schwierigkeiten zu überwinden.

Nach der zweistündigen Inkubation bei 37 Grad Celsius nach dem Waschen transfect werden die Kolben für zwei bis sechs Tage in einen 28 Grad Celsius Inkubator überführt, um die Expressionszeit zu verlängern. Die Inkubationszeit muss für jede Art von Ionenkanal, der exprimiert wird, empirisch bestimmt werden. Denn eine Inkubation bei 28 Grad Celsius über längere Zeiträume führt zu Zellablösung und schlechter Membranstabilität.

Vor der Durchführung elektrophysiologischer Studien ist eine weitere Zellvorbereitung erforderlich. Zuerst wird das Medium aus den transfizierten Zellen entfernt, indem man einen Milliliter 37 Grad Celsius heiße Trypsinlösung in einen umgedrehten Kolben pipetiert. Bringen Sie dann den Kolben vorsichtig wieder in die Position der Zelloberfläche nach unten, damit das Trypsin sanft über die Zellen laufen kann.

Drehen Sie den Kolben wieder um und entfernen Sie das Trypsin. Geben Sie dann 250 Mikroliter warmes Trypsin direkt über die Zellen und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius drei bis fünf Minuten, bis sich die Zellen lösen. In der Zwischenzeit werden drei bis acht mit Poly-L-Lysin beschichtete Decktöpfe in eine 60-Millimeter-Kulturschale gegeben und fünf Milliliter warmes Kulturmedium hinzugefügt.

Sobald die Zellen die Reanimation abgelöst haben, suspendieren Sie sie in vier Millilitern warmem Medium, indem Sie sie etwa sechsmal auf und ab pipettieren, indem Sie mit der Spitze der Mikropipette auf die Deckgläser drücken, um sicherzustellen, dass sie sich am Boden der Schale befinden. Fügen Sie dann 250 bis 500 Mikroliter resuspendierte Zellen hinzu. Inkubieren Sie die Zellen drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius, damit sie an den Deckgläsern haften können.

Wenn die Zellen zu lange bei 37 Grad belassen werden, führt dies zu einer Zellteilung und Verdünnung der transfizierten Plasmide. Die transfizierten Zellen sollten mit einer ausreichend niedrigen Dichte plattiert werden, so dass sie voneinander isoliert sind, wie hier gezeigt. Dies wird die elektrophysiologische Aufzeichnung erleichtern.

Bei Zellen, die akzessorische Untereinheiten benötigen, ist es oft notwendig, die Zellen auf 28 Grad Celsius zu versetzen und sie vor der elektrophysiologischen Untersuchung weitere drei bis vier Tage zu inkubieren. Die Aufzeichnung erfolgt für Zellen, die keine akzessorischen Untereinheiten benötigen. Die Aufzeichnung kann unmittelbar nach dieser Inkubation durchgeführt werden.

Das hier verwendete Elektrophysiologie-Rig umfasst einen Verstärker, motorisierte Doppelpipettenmanipulatoren, ein Epifluoreszenzmikroskop und Perfusionssysteme. Das Gerät wurde auf einem Schwingungsisolationstisch montiert und verirrt. Das elektrische Rauschen wird durch einen 40 Zoll hohen elektronischen Steuerkäfig vom Typ zwei begrenzt, einschließlich eines PCs, der mit einer Zifferndaten 1440 ausgestattet ist, einer Analog-Digital-Wandler-Schnittstelle in Verbindung mit der Software P clamp 10.1.

Der Computermonitor-Verstärker, der motorisierte Manipulator und ein Ventilverbindungs-Profusionssteuerungssystem sind alle außerhalb des Faradayschen Käfigs montiert. Auf einem freistehenden 19-Zoll-Metall-Schaltschrank werden alle elektrischen Geräte an einen Kupferverteiler geerdet und an einen medizinischen Trenntransformator angeschlossen, der eine Leitungsisolierung, eine gleichmäßige Erdung und einen Überspannungsschutz bietet. Bereiten Sie sich auf Experimente vor, indem Sie feuerpolierte Mikropipetten mit einem Widerstand von zwei bis fünf Megaohm auf den Mikropipettenhalter am Kopftisch montieren.

Die Patch-Pipetten werden mit einem internen Lösungsschnippen gefüllt, um Luftblasen zu entfernen, und schließlich auf dem Kopftisch montiert. Anschließend wird mit einer Pinzette ein Deckglas mit plattierten Zellen in eine 35 Millimeter große Petrischale aus Kunststoff übertragen, in der sich drei Milliliter externe Aufzeichnungslösung bei Raumtemperatur befinden. Das Volumen der Aufzeichnungslösung muss genau gemessen werden, wenn Arzneimittelexperimente durchgeführt werden, bei denen bekannte Mengen des Arzneimittels mit einer Mikropipette in die Schale gegeben werden. Stellen Sie die Schale auf den Mikroskoptisch.

Befüllen Sie dann eine Mikroelektrodenhalter-Halbzelle mit drei molaren Cäsiumchlorid. Führen Sie dann die Referenzelektrode in die Halbzelle ein und platzieren Sie die Masseelektrode mit dem Mikrom-Manipulator in das Bad, senken Sie die Patch-Pipette in die Badlösung ab. Visualisieren Sie die Zellen im Fluoreszenzmodus und zentrieren Sie eine isolierte positiv transfizierte adhärente grüne Zelle in der Mitte des Sichtfeldes.

Bringen Sie die Patch-Pipette im Badmodus in die Nähe der Zelle. Nullen Sie die auf dem Computerbildschirm beobachtete Rechteckwellenspur. Stellen Sie die Position der Patch-Pipette so ein, dass sie nur die Zelle berührt und die quadratische Stromspur auf dem Bildschirm zu schwanken beginnt.

Saugen Sie sanft mit einer aufgesetzten Spritze, bis sich eine Giga-Ohm-Dichtung bildet. Sobald eine Giga-Ohm-Dichtung erreicht ist, schalten Sie das Programm in den Patch-Modus. Üben Sie mit der Spritze einen schnellen Saugimpuls aus, um die Zellmembran zu durchbrechen.

Wechseln Sie dann in den Zellmodus und verwenden Sie die Ganzzellenparameter am Verstärker. Um kapazitive Transienten zu kompensieren, ist es notwendig, das Pflaster so zu äquilibrieren, dass die intrazelluläre Aufzeichnungslösung in die gepflasterte Zelle dialysiert. Geben Sie hier die für dieses Experiment geschriebenen Voltage-Clamp-Protokolle ein.

Der Experimentator hat ein Protokoll entwickelt, um Ionenströme durch spannungsgesteuerte Ionenkanäle zu messen, die entstehen, wenn die Spannung über der Zellmembran moduliert wird. In diesem Fall haben wir es mit einem IV-Protokoll zu tun, das angibt, dass die Software die Zelle bei minus 110 Millivolt hält und dann SEP für 250 Millisekunden auf minus 70 Millivolt bringt. Dann wieder hinunter auf minus 110 Millivolt, wobei das Haltepotential jedes Mal um 10 Millivolt ansteigt, so dass die Schritte auf minus 70 Millivolt, minus 60 Millivolt usw. gehen, bis der letzte Schritt bei plus 20 Millivolt liegt.

Filtern Sie die aufgezeichneten Ströme bei 10 Kilohertz mit einem Tiefpass-Bessel-Filter am Verstärker und digitalisieren Sie sie mit einer Abtastfrequenz von zwei Kilohertz mit der Software clamp X 10.1. Verwenden Sie nur Aufzeichnungen mit minimalem Leck von weniger als 10 %Für die Analyse wurden HEK 2 93 T-Zellen kultiviert und mit L Cav transfiziert. Drei Kalziumkanäle wie hier gezeigt. Die erfolgreiche Transfektion von heterologen Ionenkanal-CDNAs wurde durch Fluoreszenz angezeigt, die aus dem P-I-R-E-S two eeg FP-Vektor erzeugt wurde.

Hier zeigen wir die erfolgreiche Expression eines wirbellosen Cav-Kalziumkanals mit drei Spannungen. Wenn Zellen nicht transfiziert werden, können keine Kalziumströme ausgelöst werden. Transfizierte Zellen hingegen erzeugen große Ströme, wenn Ganzzellen-Voltage-Clamp-Protokolle auf die Zellen angewendet werden.

Experimentatoren können je nach Bedarf verschiedene elektrophysiologische Bedingungen und Datenanalyseverfahren anwenden. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, daran zu denken, dass Sie den Zeitpunkt der Experimente selbst beurteilen können. Da verschiedene Kanäle mit unterschiedlicher Effizienz an der Zellmembran exprimiert werden, liegt es an Ihnen, die optimale Strategie zu bestimmen, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhöhen und die Oberflächenexpression der Kanäle zu maximieren, an denen Sie interessiert sind.

Wir hoffen, dass Sie nach dem Anschauen dieses Videos ein gutes Verständnis dafür erlangt haben, wie man eine menschliche Zelllinie kultiviert und pflegt und wie man heterologe Ionenkanal-CDNAs und CDNAs der Untereinheit in diese Zellen transfiziert. Für elektrophysiologische Aufzeichnungen.