CRISPR-Based Modular Assembly for High-Throughput Construction of a UAS-cDNA/ORF Plasmid Library

Si Xu; Mengyu Chen; Guang Chen; Si Luo; Wen Xue; Xuelian Liu; Jiwu Wang; Ping Wei

doi:10.3791/66581

CRISPR-basierter modularer Aufbau für den Hochdurchsatzaufbau einer UAS-cDNA/ORF-Plasmidbibliothek

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Genetics

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CRISPR-Based Modular Assembly for High-Throughput Construction of a UAS-cDNA/ORF Plasmid Library

CRISPR-basierter modularer Aufbau für den Hochdurchsatzaufbau einer UAS-cDNA/ORF-Plasmidbibliothek

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05:30 min

May 17, 2024

DOI: 10.3791/66581-v

Si Xu*^1,2, Mengyu Chen*^1,2, Guang Chen^1,3, Si Luo⁴, Wen Xue^1,2, Xuelian Liu^1,2, Jiwu Wang^1,2,3, Ping Wei⁴

¹Clinical Research Institute, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School,University of South China, ²Department of Neurology, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School,University of South China, ³Department of Clinical Laboratory, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School,University of South China, ⁴Shanghai Diabetes Institute, Shanghai Key Laboratory of Diabetes Mellitus, Shanghai Clinical Center for Diabetes,Shanghai Sixth People's Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

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Wir stellen ein Protokoll für die CRISPR-basierte modulare Assemblierung (CRISPRmass) vor, eine Methode zum Hochdurchsatzaufbau von UAS-cDNA/ORF-Plasmidbibliotheken in Drosophila unter Verwendung öffentlich verfügbarer cDNA/ORF-Ressourcen. CRISPRmass kann zur Bearbeitung verschiedener Plasmidbibliotheken eingesetzt werden.

Das funktionelle genomische Screening bietet einen leistungsstarken Ansatz zur Untersuchung der Genfunktion und beruht auf dem Aufbau genomweiter Plasmidbibliotheken. Herkömmliche Ansätze für den Aufbau von Plasmidbibliotheken sind zeitaufwändig und mühsam. Um diese Frage zu beantworten, entwickeln wir eine einfache und effiziente Methode, die CRISPR-basierte modulare Baugruppe, kurz CRISPRmass.

Durch die Spaltung gemeinsamer Vektorsequenzen von cDNA- oder ORF-Plasmid durch CRISPR/Cas9 und die anschließende Insertion von UAS-Modulen durch benachbarte Assemblierung wird das Verfahren zum Aufbau einer genomweiten Plasmidbibliothek mittels CRISPRmass als massiv parallele zweistufige Reagenzglasreaktionen vor der bakteriellen Transformation standardisiert. CRISPRmass ermöglicht den einfachen, schnellen, effizienten und kostengünstigen Aufbau verschiedener Plasmidbibliotheken. Es kann auch zur Bearbeitung verschiedener genomweiter Plasmidbibliotheken im Allgemeinen angewendet werden, und es ist eine Alternative zur Gateway-Technologie bei der Bearbeitung von Hochdurchsatz-Plasmidbibliotheken, die den Weg für die globale Erforschung biologischer Netzwerke ebnet.

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