In vitro Rekonstitution von Zytoskelett-Netzwerken in phasengetrennten riesigen unilamellären Vesikeln (GUVs)

Unsere Forschung untersucht, ob eine minimalsynthetische Zelle wichtige biologische Funktionen replizieren kann, wobei wir uns auf die Gestaltung von Membranen konzentrieren, die die Struktur und das Verhalten natürlicher Zellmembranen genau nachahmen.

Verschiedene Technologien werden eingesetzt, um phasengetrennte Vesikel herzustellen und diese Mikrocarrier für eine Vielzahl von Anwendungen zu verwenden. Bei den Technologien handelt es sich zum Beispiel um Doppelschicht-cDICE und Elektroformation. Eine große Herausforderung besteht darin, die Funktionalität des Proteins aufrechtzuerhalten und gleichzeitig eine Phasentrennung auf dem Membranvesikel zu erzeugen. Eine Erhöhung der Temperatur kann die Proteine und andere Biomoleküle destabilisieren.

[Erzähler] Besorgen Sie sich zunächst Fläschchen mit biotinylierten und nicht-biotinylierten Lipidmischungen. Lösen Sie 50 Mikroliter jeder 32-Millimolaren Lipidmischung in Chloroform. Trocknen Sie sie dann in zwei Glasfläschchen unter Stickstoffgasfluss etwa 15 Minuten lang. Stellen Sie die Glasfläschchen in einen Exsikkator. Lagern Sie sie etwa 30 Minuten lang unter Vakuum, um Chloroformreste zu entfernen. Dispergieren Sie nun die getrockneten Lipidfilme in einer Mischung aus 20 Mikrolitern Decan und 500 Mikrolitern Mineralöl in denselben Fläschchen, um eine endgültige Lipidkonzentration von 3,2 Millimolar zu erreichen. Mit einem Bad-Ultraschallgerät werden die beiden Mischungen 30 Minuten lang bei ca. 50 Grad Celsius beschallt. Übertragen Sie dann die Lipid- und Ölgemische in zwei Röhrchen. Während die Mischungen inkubieren, bereiten Sie die innere Verkapselungsmischung für Proteine vor. Zur Herstellung der FtsZ-Proteinmischung geben Sie die aufgeführten Reagenzien bis zu einem Endvolumen von 10 Mikrolitern in ein Röhrchen. Bewahren Sie die Mischung bis zur Verwendung auf Eis auf. Für die Verkapselung von Aktinbündeln bereiten Sie zunächst 10 Mikroliter des Aktin-Mastermix, der 86 % G-Aktin, 10 % ATTO 488 Aktin und 4 % biotinyliertes Aktin enthält, in Wasser vor. Bewahren Sie die Mischung auf Eis auf und schützen Sie sie vor Licht. Bereiten Sie kurz vor Gebrauch die endgültige Aktinlösung vor, indem Sie der Reihe nach Iodixanol, Wasser, NeutrAvidin, BSA, Ficoll 70, 10x Aktinpolymerisationspuffer, A-Mix, Fascin und ATP hinzufügen. Gut mischen und fünf Mikroliter zur Verkapselung verwenden. Um FtsZ zu verkapseln, pipettieren Sie 500 Mikroliter FtsZ-Reaktionspuffer in ein 1,5-Milliliter-Kunststoffröhrchen. Fügen Sie vorsichtig 200 Mikroliter Lipid-Öl-Mischung hinzu, um eine Öl-Wasser-Grenzfläche zu bilden. In eine zweite Tube 200 Mikroliter Lipid-Öl-Mischung geben. Inkubieren Sie dieses Röhrchen bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten. Pipettieren Sie anschließend fünf Mikroliter des FtsZ-Proteinmixes in das inkubierte Lipid-Öl-Röhrchen und lassen es als Tröpfchen absinken. Klopfen Sie vorsichtig fünf- bis sechsmal vorsichtig auf die Tube, bis die Lösung trüb wird, um eine Emulsion zu bilden. Pipettieren Sie diese Emulsion vorsichtig auf die zuvor vorbereitete Öl-Wasser-Grenzfläche. Zentrifugieren Sie die Probe dann bei 6.000 g für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Die Probe 30 Minuten lang auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Entfernen Sie nun mit einer Pipette vorsichtig die obere Ölschicht und lassen Sie 100 bis 200 Mikroliter Lösung für die Bildgebung übrig. Schneide eine Pipettenspitze schräg ab. Verwenden Sie es, um 50 bis 100 Mikroliter GUV-Lösung aus dem Boden des Röhrchens zu entnehmen. Um Aktin direkt in einer 96-Well-Platte einzukapseln, kombinieren Sie 198 Mikroliter von zwei molaren Glukose mit 802 Mikrolitern Wasser, um eine äußere Glukoselösung herzustellen, die der Osmolarität der inneren Aktinmischung entspricht. Passivieren Sie eine Vertiefung mit einer 96-Well-Platte, indem Sie 100 Mikroliter BSA mit 10 Gramm pro Liter in eine Vertiefung geben. Waschen Sie die Vertiefung nach einer 10- bis 15-minütigen Inkubation fünfmal mit 100 Mikrolitern äußerer Lösung. Lassen Sie 100 Mikroliter der letzten Wäsche übrig. Geben Sie nun vorsichtig 50 Mikroliter Lipid-Öl-Mischung in die Vertiefung, indem Sie die Pipette auf die Seitenwand legen, um eine korrekte Schichtung auf der äußeren Lösung zu gewährleisten. In einem separaten Röhrchen 100 Mikroliter Lipid in Öl geben und inkubieren. Geben Sie 2,5 Mikroliter endgültige Aktinlösung in das inkubierte Lipid-Öl-Röhrchen, damit es als Tröpfchen absinkt. Klopfen Sie vorsichtig 10 bis 20 Mal auf den Boden der Tube, bis die Mischung trüb wird. Pipettieren Sie die Emulsion vorsichtig in der Mitte der Öl-Monoschicht in der Vertiefung, ohne die Grenzfläche zu beschädigen. Zentrifugieren Sie dann die 96-Well-Platte bei 200 g für 20 Minuten bei 37 Grad Celsius. Lassen Sie die Platte vor der Bildgebung 30 Minuten lang auf Raumtemperatur abkühlen. Es wurden riesige unilamellare Vesikel (GUVs) mit Membranen, die in flüssigkeitsungeordnete und flüssigkeitsgeordnete Domänen degemischt wurden, und eine hohe Ausbeute an Vesikeln mit einer Größe zwischen fünf und 30 Mikrometern erzielt. FtsZ-Netzwerke wurden innerhalb der GUVs rekapituliert und bevorzugt in Gegenwart von GTP und Ficoll 70 an den flüssigkeitsungeordneten Membrandomänen lokalisiert. Aktinnetzwerke erschienen nach der Rekonstitution als dünne Bündel, die an der Membran hafteten und spärliche, netzartige Strukturen bildeten. Ohne biotinylierte Lipide hafteten die Aktinbündel nicht an der Membran und blieben stattdessen starr und gerade im Vesikellumen. Unter höheren Zentrifugationsbedingungen aggregierten Vesikel, die Aktin-Myosin enthielten, in der Produktionsvertiefung zu einer gepackten gewebeähnlichen Architektur.