Name: In vitro Rekonstitution von Zytoskelett-Netzwerken in phasengetrennten riesigen unilamellären Vesikeln (GUVs) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 34 s
Description: Lernen Sie die Rekonstitution von Zytoskelett-Netzwerken in phasengetrennten riesigen unilamellären Vesikeln (GUVs). Diese Methode ermöglicht die vielseitige Einkapselung von Biomolekülen für synthetische Zellforschung.

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<table><tbody><tr><td>1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (Natriumsalz) (DOPG)</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>840475</td><td>In Chloroform</td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC)</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>850375</td><td>In Chloroform</td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-(cap biotinyl) (Natriumsalz) (18:1 Biotinyl Cap PE)</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>870273</td><td>In Chloroform</td></tr><tr><td>1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (Natriumsalz) (DPPG)</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>840455</td><td>In Chloroform</td></tr><tr><td>1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DPPC)</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>850355</td><td>In Chloroform</td></tr><tr><td>96-Well Flat-Bottom Microplate (SensoPlate)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aktin (Alpha-Aktin, Skelettmuskel, Kaninchen)</td><td>HYPERMOL</td><td>8101-01</td><td></td></tr><tr><td>Atto488-Aktin (Alpha-Aktin, Skelettmuskel, Kaninchen)</td><td>HYPERMOL</td><td>8153-01</td><td></td></tr><tr><td>Atto655-DOPE</td><td>ATTO-TEC</td><td>AD 655-16</td><td></td></tr><tr><td>Pulverbad-Ultraschallgerät</td><td>Branson&nbsp;</td><td>1510R-MTH</td><td>Bransonic Ultraschallreiniger</td></tr><tr><td>Biotin-Aktin (Alpha-Aktin Skelettmuskel, Kaninchen)</td><td>HYPERMOL</td><td>8109-01</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6003</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5804 R</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma Aldrich</td><td>67-66-3</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterin (Schaf)</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>700000</td><td>In Chloroform</td></tr><tr><td>Decane</td><td>TCI Deutschland GmbH</td><td>D0011</td><td></td></tr><tr><td>Fascin (Mensch, rekombinant)</td><td>Cytoskeleton Inc (Tebubio GmbH)</td><td>CS-FSC01-A</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll70</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2878</td><td></td></tr><tr><td>Jodixanol (OptiPrep)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>LSM800 konfokaler Laser Rastermikroskop</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>C-Apochromat 40&thinsp; &mal; &thinsp;/1.2 Objektiv zum Eintauchen in Wasser. Diodengepumpte Festkörperlaser: 488&dünnsp; nm und 640&thinsp; Nm.</td></tr><tr><td>Mineralöl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>8042-47-5</td><td></td></tr><tr><td>Myosin II (Skelettmuskel des Kaninchens)</td><td>Cytoskeleton Inc (Tebubio GmbH)</td><td>MY02-A</td><td></td></tr><tr><td>Neutravidin</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Osmometer</td><td>Fiske Associates</td><td></td><td>Fiske Mikro-Osmometer Modell 120</td></tr><tr><td>Greiner Bio-One</td><td> GmbH</td><td>07-000-109</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro rekonstitution von zytoskelett-netzwerken in phasengetrennten riesigen unilamellären vesikeln (guvs)

In vitro Reconstitution of Cytoskeletal Networks inside Phase Separated Giant Unilamellar Vesicles (GUVs)

In einem ersten Schritt wurden GUVs mit Membranphasentrennung nach einem modifizierten invertierten Emulsionsansatz hergestellt (Abbildung 1A). Dies führt zu einer hohen Ausbeute an GUVs, die eine in Ld - und Lo-Domänen entmischte Membran aufweisen, wie durch die Atto 655-DOPE-Markierung auf derL-d-Domäne und dunkle Regionen, die unmarkiertenL-o-Domänen entsprechen, dargestellt wird (Abbildung 1B). Diese Methode liefert phasengetrennte GUVs mit Größen von 5 bis 30 μm (Abbildung 1C) bei erhöhten Temperaturen (alle Schritte wurden bei 37 °C durchgeführt und bei RT abgebildet). Darüber hinaus wurden die Zentrifugationsgeschwindigkeiten angepasst, um den Einbau der ursprünglichen Lipide in die GUVs zu gewährleisten und eine übermäßige Überpopulation zu vermeiden.
Um die erfolgreiche Verkapselung von Biomolekülen mit der im aktuellen Protokoll beschriebenen Emulsionsmethode zu demonstrieren, wurden sowohl FtsZ- als auch Aktin-Netzwerke in einzelnen Experimenten rekonstituiert. FtsZ-Netzwerke werden in GUVs rekapituliert, die als Filamente auftreten, die bevorzugt über ihre Membran-Targeting-Sequenz (MTS) anL-d-Domänen in Gegenwart von 2,5 mM GTP und 50 g/L Ficoll70 binden (wie in Abbildung 2 dargestellt). Die Netzwerke wurden etwa 1 h nach dem Verkapselungsschritt beobachtet. Actomyosin-Netzwerke treten jedoch nach der Rekonstitution innerhalb von GUVs als dünne Bündel auf (im Gegensatz zu dicken Netzwerken von FtsZ) (Abbildung 3). Es ist zu beachten, dass biotinylierte Lipide eine entscheidende Rolle bei der Bindung der Aktomyosin-Netzwerke an die Membran der GUVs spielen. Ohne biotinylierte Lipide können Aktomyosin-Bündel keine gekrümmte Konfiguration annehmen und bleiben als gerade, kurze und steife Bündel im Lumen verbleiben, anstatt als verschränktes Netz aus langen Bündeln an der Membran zu haften (Abbildung 4).
Im modifizierten Emulsionsprotokoll wird die Zentrifugationsgeschwindigkeit angepasst, um phasengetrennte GUVs zu erhalten, wie bereits erwähnt. Höhere Zentrifugationsgeschwindigkeiten mit Proben, die Aktomyosin-Netzwerke enthalten (600 x g für 15 min), führen dazu, dass sich Vesikel in der Produktionsvertiefung zu einer gewebeähnlichen Konfiguration zusammenballen. Daher wurde in allen Standard-Rekonstitutionsexperimenten von Aktomyosin-Netzwerken die optimale Zentrifugationsgeschwindigkeit auf 200 x g eingestellt, um nicht-aggregierte GUVs zu erhalten (Abbildung 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68530/68530fig1.jpg"> 
Abbildung 1: Ein-Topf-Erzeugung von phasengetrennten GUVs unter Verwendung der Doppelemulsionstransfermethode. (A) Experimentelles Schema der Schlüsselschritte bei der Eintopfproduktion von phasengetrennten Vesikeln durch Doppelemulsionstransfer. (B) Konfokales Z-Projektionsbild der resultierenden GUVs, die nach dem in A beschriebenen Verfahren erzeugt wurden. Der Maßstabsbalken beträgt 50 μm. (C) Balkendiagramm mit dem Anteil der phasengetrennten GUVs, die entsprechend ihrem Durchmesser erzeugt wurden. Durchgeführte Experimente n = 3, die Gesamtzahl der pro Experiment analysierten GUVs = 100. Die Daten werden als Mittelwerte angezeigt, einzelne Datenpunkte sind die drei unabhängigen Experimente. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung der drei Experimente dar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68530/68530fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68530/68530fig2.jpg"> 
Abbildung 2: Phasengetrennte Vesikel mit verkapselten FtsZ-Netzwerken. (A) Konfokale 3D-Projektionsbilder, die auf einem vollständig erfassten Z-Stack eines phasengetrennten GUV durchgeführt wurden, das ein FtsZ-Netzwerk enthält. (B) Konfokale Z-Projektionsbilder, die nur auf der oberen Hälfte des Vesikels durchgeführt wurden. Aufgrund der heterogenen Bildung von Domänen über die Oberfläche des GUV zeigt die 3D-Rekonstruktion der aufgenommenen konfokalen Schnitte die Überlappung von Lipiddomänen aus dem oberen und unteren Bereich des Vesikels. Um Überlappungen zu vermeiden und die visuelle Inspektion der Domänen zu erleichtern, wird die untere Hälfte der erfassten Z-Stapel aus der Datei entfernt. Die resultierende obere Hälfte wird dann für ihre 3D-Projektion über die Standardabweichung verwendet. Die Maßstabsleisten sind beide 20 μm groß. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68530/68530fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68530/68530fig3.jpg"> 
Abbildung 3: Phasengetrennte Vesikel mit verkapselten Aktomyosin-Netzwerken. (A) Konfokale Z-Projektionsbilder eines gesamten aufgenommenen Stacks mit einer Zoom-Out-Ansicht des Wells nach der Vesikelproduktion. Die hohe Ausbeute an erhaltenen Vesikeln ermöglicht die Untersuchung verschiedener Aktomyosinstrukturen innerhalb der Vesikel. Der Maßstabsbalken beträgt 50 μm. (B) Konfokale Z-Projektionsbilder, die auf der oberen Hälfte eines Vesikels durchgeführt wurden. Um die visuelle Analyse von Lipiddomänen zu erleichtern, wird nur die obere Hälfte der Bildscheiben für eine 3D-Projektion verwendet. Der Maßstabsbalken beträgt 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68530/68530fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68530/68530fig4.jpg"> 
Abbildung 4: Bedeutung von biotinylierten Lipiden für die Bildung von membrangebundenen Aktomyosin-Netzwerken in phasengetrennten Vesikel. Konfokale 3D-Projektionen, die phasengetrennte Vesikel mit nicht gebundenen Aktomyosin-Netzwerken darstellen. Wenn biotinylierte Lipide nicht in die Mischung eingebaut werden, bilden sich am Lumen Aktomyosin-Strukturen, die auf dem inneren Segel der Vesikel keine gekrümmte Konfiguration annehmen (rechtes Bild, Aktin markiert mit Atto488). Der Maßstabsbalken beträgt 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68530/68530fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68530/68530fig5.jpg"> 
Abbildung 5: Einfluss der Zentrifugationsgeschwindigkeit auf die Herstellung von phasengetrennten Vesikeln durch Emulsionstransfer. Konfokale 2D-Bilder, die eine GUV-Probe zeigen, die mit einer Zentrifugationskraft von 600 x g für 15 min erzeugt wurde. Die verwendete Zentrifugationsgeschwindigkeit, die höher ist als die optimierten 200 x g, führt dazu, dass sich die Vesikel in der Vertiefung zu einer gewebeähnlichen Konfiguration zusammenballen. Der Maßstabsbalken beträgt 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68530/68530fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

In vitro Rekonstitution von Zytoskelett-Netzwerken in phasengetrennten riesigen unilamellären Vesikeln (GUVs)

Biomimetic lipid membranes in the form of giant unilamellar vesicles (GUVs) are commonly used to mimic cellular membrane behavior because of the ease of ...

in-vitro-reconstitution-cytoskeletal-networks-inside-phase-separated

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Elektroformation, und Gel-unterstützte Schwellung - Die Wiederherstellung der Transmembranprotein, KvAP, in riesige unilamellare Vesikel (GUVs) ist für zwei Dehydration-Rehydrierung Methoden nachgewiesen. In beiden Verfahren werden kleine unilamellare Vesikel, die das Protein enthält, zusammengeschmolzen, um GUVs die dann durch Fluoreszenzmikroskopie und Patch-Clamp-Elektrophysiologie untersucht werden können zu bilden.

Rekonstitution der ein Transmembranprotein, das spannungsgesteuerten Ionenkanal, KvAP, in Riesen unilamellare Vesikel für Mikroskopie und Patch-Clamp-Studien

Riesenvesikel mit hochgepackten mikrometergroßen Komponenten sind nützliche Zellmodelle. Das Wasser-in-Öl-Emulsionszentrifugationsverfahren ist ein einfaches, leistungsstarkes Werkzeug zur Herstellung von riesigen Vesikeln mit verkapselten Materialien.

Herstellung von Riesenvesikeln Encapsulating Microspheres durch Zentrifugation einer Wasser-in-Öl-Emulsion

Experimente an Phase getrennt giant Unilamellar Vesikeln (GUVs) vernachlässigen häufig physiologische Lösungsbedingungen. Dieses Werk stellt Ansätze, um die Auswirkungen der hohen Salzgehalt Puffer auf flüssig / flüssig Phasentrennung in aufgeladenen Mehrkomponenten GUVs als Funktion des Trans-Membran Lösung Asymmetrie und Temperatur zu studieren.

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Viele Proteine in der Zelle spüren und Krümmung der Membran zu induzieren. Wir beschreiben eine Methode zur Membran Nanoröhrchen aus Lipid Vesicles, die Interaktion von Proteinen oder jede Krümmung-aktive Molekül mit gebogenen Membranen in VitroStudie ziehen.

Membran-Nanoröhrchen ziehen aus riesigen Unilamellar Vesikel

Wir präsentieren eine Technik zur kontaktlosen Mikromanipulation von Vesikeln, mit lokalisierten Kalzium Ionen Steigungen. Mikroinjektion einer Kalzium-Ionen-Lösung, in der Nähe einer riesigen Lipid-Bläschen, wird genutzt, um die Lipidmembran, wodurch die Produktion der Membran röhrenförmige Ausstülpungen umzugestalten.

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Dieser Artikel stellt eine einfache Methode zur schnellen Herstellung von riesigen unilamellären Vesikeln mit verkapselten zytoskelettalen Proteinen vor. Die Methode erweist sich als nützlich für die Bottom-up-Rekonstitution von Zytoskelettstrukturen in Enstrikt- und Zytoskelett-Membran-Interaktionen.

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Bottom-up In vitro Methoden zur Untersuchung der ultrastrukturellen Organisation, der Membranumformung und des Krümmungsempfindlichkeitsverhaltens von Septinen

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In vitro Rekonstitution des Aktinzytoskeletts in riesigen unilamellaren Vesikeln

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In diesem Artikel wird ein Verfahren zur Herstellung von zusammengesetzten Riesen-Unilamellären Vesikeln (cGUVs) mit einer Vesikel-in-Vesikel-Struktur mit angepasster elektrischer Leitfähigkeit im inneren, ringförmigen und äußeren Bereich vorgestellt. Bei der Elektroformation werden einfache GUVs synthetisiert, die durch osmotischen Schock in Stomatozyten und cGUVs umgewandelt werden, was ein wertvolles Modell für die Untersuchung der Biophysik kernhaltiger Zellen darstellt.

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Lernen Sie die Rekonstitution von Zytoskelett-Netzwerken in phasengetrennten riesigen unilamellären Vesikeln (GUVs). Diese Methode ermöglicht die vielseitige Einkapselung von Biomolekülen für synthetische Zellforschung.

In vitro Rekonstitution von Zytoskelett-Netzwerken in phasengetrennten riesigen unilamellären Vesikeln (GUVs)

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