Bottom-up In vitro Methoden zur Untersuchung der ultrastrukturellen Organisation, der Membranumformung und des Krümmungsempfindlichkeitsverhaltens von Septinen

Mit diesem Protokoll visualisierten wir die Organisation von filamentösen Proteinen des Zytoskeletts auf Mustersubstraten mit verschiedenen Krümmungen. Wir können die Krümmungsempfindlichkeit testen. Die Auflösung von rasterelektronenmikroskopischen Bildern ist hoch genug, um Organisationen im Nanometerbereich sichtbar zu machen.

Die Methoden, die wir zur Fixierung verwenden, sind mild genug, um die intrastrukturelle Organisation des Proteins zu erhalten. Dies bleibt im Rahmen der Grundlagenforschung, um das Verhalten von Zytoskelettfilamenten zu verstehen. Beginnen Sie mit der Entwicklung eines welligen Norland Optical Adhesive oder NOA-Nachbaus in einer Reinraumumgebung aus welligen Polydimethylsiloxan-Wellenmustern mit einer Amplitude von 250 Nanometern und einer lateralen Periodizität von zwei Mikrometern.

Dazu legen Sie fünf Mikroliter flüssiges NOA auf ein kreisförmiges Glasdeckglas von einem Zentimeter Durchmesser und legen Sie dann die PDMS-Schablone auf den Tropfen. Behandeln Sie die Baugruppe fünf Minuten lang mit UV-Licht bei 320 Nanometern, um die flüssige NOA zu einem dünnen Polymerfilm zu photopolymerisieren. Anschließend ziehen Sie die PDMS-Schablone vorsichtig vom Deckblatt mit dem frisch polymerisierten NOA ab.

Behandeln Sie den NOA-Film fünf Minuten lang mit einem Luftplasmareiniger, um die Oberfläche hydrophil zu machen. Bereiten Sie eine Lösung aus kleinen unilamellären Vesikeln oder SUVs vor, wie im Manuskript beschrieben, und erhalten Sie die SUVs, indem Sie einen getrockneten Lipidfilm im Beobachtungspuffer unter der Ultraschallbehandlung in einem Badsonikator für fünf bis 10 Minuten resuspendieren, bis die Lösung transparent ist. Später legen Sie die Abdeckblätter, die die NOA-Muster stützen, in die Vertiefungen von Zellkulturboxen ein und inkubieren Sie die frisch leuchtenden NOA-Muster mit 100 Mikrolitern eines Milligramms pro Milliliter SUV-Lösung für 30 Minuten bei Raumtemperatur, um eine unterstützte Lipiddoppelschicht zu erzeugen.

Um den nicht verschmolzenen SUV zu entfernen, spülen Sie die Seiten sechsmal gründlich mit dem Septin Low Salt Buffer aus, ohne die Probe zwischen zwei Wäschen vollständig trocknen zu lassen. Verdünnen Sie die oktomerische Septin-Stammlösung in einem Septin-Low-Salt-Puffer auf Endkonzentrationen von 10 bis 100 Nanomolar und Volumina von einem Milliliter. Dann inkubieren Sie die Proteinlösung auf den Objektträgern für eine Stunde bei Raumtemperatur.

Waschen Sie die NOA-Objektträger mit fusionierten Lipiddoppelschichten und inkubieren Sie das Protein mit einem salzarmen Septinpuffer. Septin Low Salt Buffer durch 2% Glutaraldehyd Fixierlösung in 0,1 molar Natriumcacodylatpuffer, vorgewärmt bei 37 Grad Celsius, ersetzen und die Reaktion für 15 Minuten fortsetzen lassen und die fixierte Probe dreimal waschen, jeweils fünf Minuten mit 0,1 molar Natriumcacodylat. Nach dem Waschen inkubieren Sie die Probe in der Fixierlösung von Osmiumtetroxid, dann die gefilterte Gerbsäure und schließlich das filtrierte Uranylacetat für jeweils 10 Minuten.

Waschen Sie die Probe nach jeder Lösung dreimal in destilliertem Wasser. Inkubieren Sie die Probe seriell in Ethanollösungen von 50% bis 100% für jeweils zwei bis drei Minuten. Bringen Sie die Glasobjektträger in den mit Ethanol vorgefüllten Trockner an kritischen Stellen und befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers zum Trocknen.

Da getrocknete Proben stark hydroskopisch sind, beschichten Sie sie sofort, indem Sie den Abdeckschlicker an den Stummeln befestigen. Fügen Sie dann einen Silberfarbstreifen auf die Oberseite des Abdeckstreifens auf, ohne Farbdeglomerate zu erzeugen. Stellen Sie sicher, dass die Verbindung mit dem Stub zufriedenstellend ist.

Wenn die Probe vollständig verdampft ist, verwenden Sie ein Gerät, das mit einem Plasma-Magnetron-Sputterkopf und einem rotierenden Planetentisch ausgestattet ist, und befolgen Sie die vom Hersteller bereitgestellten Standardprotokolle. Führen Sie ein Vorsputtern bei 120 Milliampere für 60 Sekunden durch, um die Oxidschicht an der Oberfläche zu entfernen. Anschließend werden 1,5 Nanometer Wolfram mit einem Schichtdickenmonitor bei 90 Milliampere und einem Arbeitsabstand von 50 Milliliter abgeschieden.

Lagern Sie die Proben später unter Vakuum, um sie bis zur REM-Analyse vor der Umgebungsluft zu schützen. Um eine hochauflösende Bildgebung durch Detektion der Sekundärelektronen mit dem Binnendetektor zu erreichen, stellen Sie die Beschleunigungsspannung auf drei Kilovolt und den Strahlstrom auf 20 Mikrometer Apertur ein. Verwenden Sie für Beobachtungen Auflösungen von 21,25 Nanometern pro Pixel bis 1,224 Nanometer pro Pixel.

Verwenden Sie eine Auflösung von 5,58 Nanometern pro Pixel für die Datenanalyse. Stellen Sie den Arbeitsabstand zwischen einem und zwei Millimetern für hochauflösende Beobachtungen und etwa drei Millimetern ein, wenn eine erhöhte Tiefenschärfe erforderlich ist. Passen Sie die Scangeschwindigkeit und die Zeilenintegration kontinuierlich an, um ein konstantes Signal-Rausch-Verhältnis mit einer Aufnahmezeit von etwa 30 bis 45 Sekunden pro Bild zu gewährleisten.

Die repräsentative Analyse veranschaulicht die Wirkung des auf den Septinfilamenten abgeschiedenen Materials auf wellige PDMS-Muster mit 1,5 Nanometern Platin und 1,5 Nanometern Wolfram. Es wurde beobachtet, dass nackte riesige unilamellare Vesikel oder GUVs perfekt kugelförmig waren. Nach der septinininduzierten Verformung erschienen die Vesikel facettiert und die Verformungen blieben statisch und schwankten daher nicht.

Bei höheren Konzentrationen der Septine wurden periodische Verformungen in den Vesikeln beobachtet. Die Selbstorganisation der Septinfilamente, die an große unilamellare Vesikel oder LUVs gebunden sind, wurde mit einem Kryoelektronenmikroskopiebild untersucht und eine 3D-Rekonstruktion aus einer geneigten Reihe erhalten. Die krümmungsabhängige Anordnung der Septinfilamente wurde durch Rasterelektronenmikroskopie sichtbar gemacht.

Bei geringer Vergrößerung war ein Wellenmuster mit der Periodizität von negativen und positiven Krümmungen sichtbar. Die ultrastrukturelle Organisation der Septinfilamente wurde bei höherer Vergrößerung betrachtet. Die NOA müssen vorsichtig abgezogen werden, um einen Abbau zu verhindern.

Nach der Bildgebung kann eine Bildanalyse durchgeführt werden, um die von SCM visualisierten Ultrastrukturmerkmale wie Filamentabstand und Ausrichtung des Filaments zu quantifizieren. Das vorliegende Verfahren wurde auf Septine angewendet, könnte aber auch für andere Zytoskelettproteine oder Proteine verwendet werden, die sich als lange Filamente organisieren und somit krümmungsempfindlich sind.