3D-Flipwell-Engineering für die Entwicklung asynchroner Systeme für toxikologische und immunmodulatorische Therapien in Bakterien-, Darm- und Immunzellen

Wir haben ein 3D-Kokultursystem entwickelt, das die Darmschleimhaut nachahmt, um das serielle Crosstalk zu untersuchen und die Wirkstoffreaktionen zu bewerten, die für das Drogenscreening und das Verständnis mukosaler zellulärer Interaktionen genutzt werden können. Verschiedene Gruppen haben mehrere verschiedene Kultursysteme entwickelt, um die Darmschleimhautumgebung mithilfe sehr komplexer bioingenieurwissenschaftlicher Techniken zu modellieren. Stattdessen haben wir ein Kokultursystem entwickelt, das viel einfacher mit günstigeren Materialien herzustellen ist.

Unser Kokultursystem zeigte, dass ein proteinogenes Medikament koordinierte Reaktionen zwischen Darmbakterien, Epithel- und Immunzellen auslöst, wodurch die Wirtsimmunität wahrscheinlich mit unseren bakteriellen Metaboliten aktiviert wird und die Kommunikation zwischen verschiedenen Arten vermittelt wird. Wir wollen sowohl aerobe als auch anerobische Bakterienstämme sowie deren Metaboliten untersuchen, um immunmodulierende Effekte zu entdecken und so den Weg für neue immuntherapeutische Strategien auf Basis bakterieller Metabolite zu ebnen. Zu Beginn öffnen Sie einen Petrischalendeckel und stellen Sie ihn beiseite.

Legen Sie eine Skalpellklinge an den Rand des Petrischalenbodens. Nimm eine sterile Pinzette und greife vorsichtig den Unterboden des Einsatzes, um ihn aus der Verpackung zu nehmen. Mit der anderen Hand nimm die sterile Skalpellklinge und führe sie zum Einsatz.

Mit einer C-förmigen Bewegung stoßen Sie die Membran an der Kante durch und schieben Sie die Skalpellklinge vorsichtig um den Boden des Einsatzes, wobei Sie nahe an der Kunststoffwand bleiben. Schneide die PET-Membran heraus und benutze die zweite Pinzette, um sie zu entfernen. Dann benutze die Skalpellklinge, um weiße Membranspäne abzukratzen, um die Kante und den Rand des Einsatzes zu reinigen.

Als Nächstes verteilt man vorsichtig eine 2-3 Millimeter dicke Silikonperle rund um den Boden des Einsatzes und achte darauf, die Membran nicht zu berühren. Nehmen Sie das zweite Set steriler Pinzette und heben Sie vorsichtig den ersten Einsatz an, ohne dass die Membran aus dem Schutzpaket herauskommt. Bring die beiden Einsätze von unten nach unten zusammen, damit die unteren Felgen ausgerichtet sind.

Wenn der Flipwell-Stapel geklebt ist, geben Sie ihn in die ursprüngliche sterile Packung oder eine tiefe Petrischale, damit sie 72 Stunden trocknet. Verwenden Sie den Deckel der angegebenen Petrischalen, um die Stapeleinheit abzudecken. Um die Stapelbaugruppen zu sterilisieren, verwenden Sie eine sterile Pinzette, um den Flipwell-Stapel am Rand des festgelegten tiefen Petrischalenrands aufzuhängen.

Schließen Sie dann den Glasrahmen des Biosicherheitsschranks und schalten Sie das ultraviolette Licht ein. Um vor der Kollagenbeschichtung auf Leckage zu testen, geben Sie zunächst 500 Mikroliter steriles PBS oder steriles deionisiertes Wasser hinzu. Am nächsten Tag aspirieren Sie die für die Tests verwendete Flüssigkeit, bevor Sie die Stapel 1–2 Stunden im Biosicherheitsschrank trocknen.

Um die Membran mit Kollagen zu beschichten, öffnen Sie den Petrischalendeckel und lassen Sie den Flipwell am Rand der Petrischale hängen. Gib vorsichtig 200 Mikroliter Kollagenlösung auf eine Seite des Insert-Stacks. Aspirieren Sie die Kollagenlösung nach einer Stunde und pipettieren Sie dann 200 Mikroliter steriles PBS. Nach dem Aspirieren des PBS werden die Petrischüssel mit einem Deckel abgedeckt und die Membran 60 Minuten im Schrank getrocknet.

Wenn die Membran trocken ist, verwenden Sie eine sterile Pinzette oder Pinzette, drehen Sie das Flipwell auf die gegenüberliegende Seite und lassen Sie es am Rand der Petrischale hängen. Um den bakteriellen Einsatz herzustellen, setzen Sie zwei Sätze steriler Pinzetten und die 24-Well-Einsätze in den Biosicherheitsschrank. Mit einer sterilen Pinzette heben Sie den Einsatz aus dem sterilen Pack.

Mit der zweiten Pinzette oder Pinzette brechen Sie die kleinen Plastikfüße am unteren Rand des Einsatzes ab. Testen Sie den 24-Well-Einsatz, indem Sie ihn in einen der sterilen Flipwell-Co-Culture-Insert-Stacks oder die ursprünglichen 12-Well-Inserts einsetzen. Um mit der Aussäung der Flipwells zu beginnen, säen Sie 500 Mikroliter der Epithelzelllinien auf jeder Seite der apikalen Seite des Flipwells aus.

Decken Sie die Baugruppen mit einem Petrischalendeckel ab und inkubieren Sie dann über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid, bis die Zellen anhaften. Öffnen Sie den Petrischalendeckel und saugen Sie das DMEM-Material von der apikalen Seite des Flipwell-Stapels ab. Mit einer sterilen Pinzette heben Sie den Flipwell vorsichtig am Haken auf und drehen Sie ihn um 180 Grad.

Mit dem zweiten Satz steriler Pinzetten greifen Sie den Flipwell-Stapel am anderen Haken, der jetzt nach oben zeigt. Dann lassen Sie die Baugruppe zurück in die Petrischale und hängen Sie den Haken über den Rand der Petrischale. Fügen Sie 500 Mikroliter THP-1-Zellsuspension auf die apikale Seite des Kokultur-Insert-Stacks hinzu.

Passen Sie das HT-29-Medium für die Dickdarmepithelzellen an, indem Sie das Medium in die tiefe Petrischale geben. Um Luftblasen zu entfernen, halten Sie den Flipwell-Stapel mit einer sterilen Pinzette am Arm fest. Senken Sie vorsichtig eine Gavage-Nadel in und unter die Einsatzeinheit und setzen Sie die weiche Spitze sehr vorsichtig an die Luftblase.

Ziehe vorsichtig und sehr langsam den Spritzenstempel hoch und beobachte, wie die Luftblase langsam verschwindet. Dann entferne vorsichtig Nadel und Spritze aus dem Flipwell. Nachdem die Luftblasen mit einer Schenknadel entfernt wurden, wird beide Zelltypen im Zellkulturinkubator kultiviert.

Mit einer Pinzette legt man den Einsatz in eine sterile Petrischale und deckt sie mit dem Deckel ab. Transferiere die Petrischale mit den Flipwells in den Biosicherheitsschrank und stelle sie auf der gegenüberliegenden Seite der Schale mit bakteriellen Einsätzen beiseite. Pipettiere 300 Mikroliter DMEM-Medium von der apikalen Seite des Flipwell, um Platz für den bakteriellen Einsatz zu schaffen, und decke dann mit dem Petrischalendeckel ab.

Geben Sie nun 50 bis 100 Mikroliter Bacillus subtilis-Kultur zu den 24-Well-Bakterieneinlagen und führen Sie sie in die Flipwell-Oberseite ein. Drehen Sie den Arm und hängen Sie ihn am Rand des Flipwell Co-Culture Insert-Stacks auf. Halte den Stapel mit dem zweiten Satz steriler Pinzette.

Nach einer dreistündigen Inkubation verwenden Sie eine sterile Pinzette, um den bakteriellen Einsatz aus dem Flipwell zu entfernen. Platzieren Sie den Flipwell in ein 50-Milliliter-konisches Rohr, ohne sie zu zerlegen. Um das Flipwell für die Elektronenmikroskopie zu zerlegen, halten Sie es mit beiden Händen und drehen Sie jedes verklebte Teil des Stapels ab.

Drehen Sie den Einsatz mit der Membran und legen Sie ihn mit nach oben gezeigter Membran ab. Halten Sie den Einsatz fest, schneiden Sie die Membran vorsichtig mit einer Skalpellklinge heraus und legen Sie sie dann in ein 1,7-Milliliter-Rohr mit Paraform-Aldehydlösung. Für die konfokale Mikroskopie werden 300 Mikroliter steriles PBS auf die apikale Seite gegeben.

Entferne den Stapel vorsichtig aus der Petrischale, nachdem du das PBS ausgepipettiert hast. Jetzt drehen Sie den Flipwell um und fügen Sie 300 Mikroliter PBS auf die nun nach oben gerichtete RPMI-Seite des Flipwell-Co-Culture-Insert-Stacks hinzu, dann aspirieren Sie die phosphatgepufferte Kochsalzlösung. Mit einer 200-Mikroliter-Pipette erzeugen Sie einen großen Tropfen PBS.

Drehen Sie die Einsatzbaugruppe ab, um sie in die Einsätze zu trennen. Dann positioniere den Flipwell-Stapel vorsichtig mit THP-1-Zellen auf dem 200-Mikroliter-Tropfen PBS. Fügen Sie 200 Mikroliter Permeabilisierungspuffer mit Darmepithelzellen auf die Oberseite hinzu und lassen Sie es 10 Minuten liegen.

Für die immunfluoreszierende Färbung pipettieren Sie 300 Mikroliter primären Antikörper auf die Oberseite des Einsatzes. Gib 300 Mikroliter Primärantikörper in den Brunnen einer 12-Well-Platte und stecke dann den Einsatz in den Schacht oben auf den Tröpfchen. Decken Sie den Antikörper gut ab.

Die Färbung zeigte nach der Sepiapterinbehandlung einen deutlichen Anstieg der Schleimsekretion im Darmepithelkompartiment, was durch die Zunahme des epithelialen Markerproteins CK20 und des schleimhäutigen Proteins MUC2 angezeigt wird. In THP-1-Monokulturen erhöhte die Sepiapterinbehandlung signifikant die Expression des M1-Makrophagenmarkers CD80, während der M2-Makrophagenmarker CD163 heruntermoduliert wurde, was auf M1-Polarisation hinweist. Die Rasterelektronenmikroskopie zeigte eine erhöhte Schleimsekretion aus Epithelzellen in septerbehandelten Kokulturen.

Die Sepiapterinbehandlung induzierte Makrophagenmorphologie, die dem M1-Phänotyp sowohl in Monokulturen als auch in Kokulturen ähnelt. Bakterielle Zellen in mit Sepiapterin behandelten Monokulturen wiesen faltige Oberflächen auf, die für die Biofilmbildung charakteristisch sind.