MALDI-Probenvorbereitung: Die Ultra Thin-Layer-Methode

Willkommen zum CHI Lab Tutorial über die ultradünne Schichtmethode, die besonders nützlich für die genaue Massenbestimmung von Proteinen ist. Aufgrund der Empfindlichkeit der Massenspektrometrie verwenden wir zur Reinigung der Platte nur Reagenzien in HPLC-Qualität sowie puderfreie Latex- oder Nitrilhandschuhe. Spülen Sie abwechselnd mit Methanolwasser und schließlich wieder mit Methanol.

Wischen Sie zwischen jedem Spülen das überschüssige Lösungsmittel vorsichtig mit einem Linsentuch ab. Sie können diese Waschschritte so oft wie nötig wiederholen, um eine saubere Platte herzustellen. Und nach der Reinigung und Trocknung sollte die Platte sofort verwendet werden.

20 bis 30 Mikroliter dünnschichtige Substratlösung auf die saubere MALDI-Platte auftragen und verteilen. Hier verwenden wir eine P zwei 50 Pipettenspitze, um die Lösung gleichmäßig zu verteilen und gleichzeitig ein Verkratzen der Platte zu vermeiden. Während die dünne Schicht trocknet, entfernen Sie alle verbleibenden Wassertröpfchen, indem Sie sie vorsichtig mit einem Kim-Tuch abtupfen.

Wischen Sie dann die Platte vorsichtig in einer sanften Bewegung mit einem Kim-Tuch ab, um die dünne Schicht richtig zu formen. Reinigen Sie abschließend die Ränder der Platte, um eine Kontamination des Massenspektrometers zu vermeiden. Es ist wichtig, die dünne Schicht zu testen, bevor Sie Ihre Probe auftragen.

Wenn das Trocknen des Testflecks zu lange dauert und die Kristalle nicht homogen sind, kann das Problem in der dünnen Schicht selbst oder in der Matrixlösung liegen, reinigen Sie die Platte, tragen Sie die dünne Schicht erneut auf und testen Sie erneut. Wenn Sie auf die dünne Schicht aufblicken, möchten Sie nicht, dass Ihre Flecken bis zur Trockenheit verdunsten. Sobald sich die Kristallisation verlangsamt und gestoppt hat, entfernen Sie stattdessen das überschüssige Lösungsmittel.

Bei Verwendung eines Vakuumsaugers kann das Vorhandensein von Verunreinigungen wie Salzen und Reinigungsmitteln sowie eine hohe Analytkonzentration die Kristallisation beeinträchtigen. Eine weitere Probenverdünnung kann die Kristallisation verbessern Erkennen Sie die Ameisen in unmittelbarer Nähe der Probe. Dies ermöglicht eine pseudointerne Kalibrierung, bei der die Platte vom Probenfleck zum Kalibrierpunkt bewegt wird.

Bei der Probenerfassung, bei der dem Spektrum einige Laseraufnahmen des CAS hinzugefügt werden, garantiert dieser Ansatz eine Kalibrierung mit höherer Massengenauigkeit als die externe Kalibrierung allein. Es ist sehr wichtig, alle Verunreinigungen wie Salz oder Reinigungsmittel zu entfernen, die den Analyten beeinträchtigen könnten. Ionisation. Geben Sie dazu eiskalte, 0,1%ige Trifluoressigsäure in die HPLC und geben Sie Wasser direkt auf die Flecken.

Entfernen Sie die Waschlösung mit einem Vakuumsauger Wie hier gezeigt. Diese Methode erzeugt hervorragende Spektren sowohl für membranische als auch für lösliche Proteine.