Name: MALDI-Probenvorbereitung: Die Ultra Thin-Layer-Methode (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: Lernen Sie die Ultra Thin-Layer-Methode zur MALDI-MS-Probenpräparation für die genaue Massenbestimmung von Proteinen. Diese Technik zeigt effektive Reinigungs- und Auftragsverfahren für zuverlässige analytische Ergebnisse.

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Es ist sehr wichtig, puderfrei Handschuhe während der Vorbereitung der dünnen Schicht zu tragen. Die Reinigung der Probenplatte <ol><li> Verwenden Sie einen Edelstahl oder Gold MALDI Probenteller. </li><li> Waschen mit MeOH und wischen Sie vorsichtig mit einem Kimwipe. Nicht reiben oder scheuern die Oberfläche mit dem Kimwipe, um zu verhindern Kratzer auf der Oberfläche. </li><li> Waschen mit H 2 O und wischen Sie vorsichtig mit einem Kimwipe. </li><li> Waschen mit MeOH und wischen Sie vorsichtig mit einem Kimwipe. </li><li> Bei Bedarf wiederholen MeOH / H 2 O / MeOH Reinigungszyklus immer mit der Endung MeOH. </li><li> Stellen Sie sicher, dass es keine Geister Flecken oder Rückstand auf den Teller. Wenn es ghost Spots sind, spülen Sie die Platte mit VE-Wasser, während das Reiben der Oberfläche mit den behandschuhten Hand (nicht mit Kimwipes reiben). Wiederholen Sie die MeOH / H 2 O / MeOH Reinigungszyklus. </li><li> Verwenden Sie die Platte sofort nach dem Waschen. </li></ol> Vorbereitung der dünnen Schicht Substrat-Lösung <ol><li> Mix 1 Teil gesättigte 4-HCCA (2 Teile ACN, 1 Teil Wasser und 0,1% endgültigen TFA) und 3 Teile Isopropanol. Hinweis: Die dünne Schicht Substrat-Lösung ist sehr stabil und kann bei Raumtemperatur in der Dunkelheit für ein Jahr gehalten werden. Es kann auch bei 4 ° C gelagert werden </li></ol> Making the dünne Schicht Substrat <ol><li> Übernehmen 20-50 ul der dünnen Schicht Substrat-Lösung auf der linken Mitte der Platte, und die Ausbreitung mit der Seite einer Pipettenspitze. Sweep in eine Richtung. </li><li> Da die Lösung trocknet die organische Lösungsmittel verdunstet sehr schnell und hinterlässt winzige Tröpfchen Wasser auf der Oberfläche der Platte. An dieser Stelle, wickeln Sie Ihren Zeigefinger mit einer Lage von Kimwipe und zunächst sanft Blot die Oberfläche der Platte mit ihm. </li><li> Wenn die Oberfläche von Wassertropfen befreit ist, wischen Sie die gesamte Platte mit uni-direktionale geschwungenen Bewegungen mit einem Kimwipe. Hinweis: Wenn die Lösung nicht genug über die Plattenoberfläche zu verbreiten, die den ACN Zusammensetzung und erstellen Sie die dünne Schicht. Einige Parameter, die die Ausbreitung der Lösung beeinflussen können, zählen Luftfeuchtigkeit und Temperatur. Hinweis: Mit goldenen Platten, die Schicht in der Regel erscheint als eine gelbliche Reflexion, je nach Betrachtung und Licht Winkeln. Mit Stahlplatten, ist nur der Rand der Schicht in der Regel sichtbar. </li><li> Reinigen Sie die Kanten der Platte mit einer frischen Kimwipe, bevor er in den Plattenhalter auf Matrix verunreinigen das Gerät zu verhindern. </li></ol> Vorbereitung der Matrix-Lösung <ol><li> <a href="http://prowl.rockefeller.edu/protocols/saturated-4HCCA-solution.html">Gesättigte 4-HCCA</a> in FWI (3 Teile Ameisensäure, 1 Teil Wasser, 2 Teilen Isopropanol) ist für die Analyse von Membran und lösliche Proteine ​​empfohlen. Es könnte auch in besonderen Fällen für die Analyse von sehr hydrophoben große Peptide (M&gt; 4.000 u) verwendet werden. Stellen Sie sicher, dass die Matrix-Lösung für die Erkennung der Proteine ​​verwendet nicht mehr als ~ 50% organischer Anteil, da sie komplett auflösen wird die dünne Schicht Substrat, dem Sieg über die Vorteile des Verfahrens. </li></ol> Test der dünnen Schicht Substrat <ol><li> Spot 0.5μL der Matrix-Lösung auf der Platte. Ein weißlicher Niederschlag wird an der Schnittstelle zwischen der dünnen Schicht und die Tröpfchen erscheinen. Wenn diese Schicht den Boden des Tropfens deckt, in der Regel innerhalb von 10-15 Sekunden, saugen die überschüssige Flüssigkeit mit einem Vakuum-Linie. Wenn es länger als 30 Sekunden für den Niederschlag zu bilden nimmt, ist dies ein Zeichen, dass es möglicherweise ein Problem mit der dünnen Schicht Substrat und / oder die Matrix-Lösung sein. </li></ol> Anwendungsbeispiel <ol><li> Die Analytkonzentration in der Startelf Lösungen sollten innerhalb von 10 und 1000μM werden. </li><li> Verdünnen Sie die Analyt-Lösung in Matrix-Lösung, um eine endgültige Konzentration des Analyten zwischen 0,2 und 2 um. Zum Beispiel mit 1μl der Probe und 9μl der Matrix-Lösung beginnen. Hinweis: Achten Sie darauf, dass die Matrix kurz davor, in die endgültige Lösung gesättigt ist, sonst wirst du abgeblasen, und der dünne Schicht Substrat. Hinweis: Analytkonzentrationen erforderlich, um menschenwürdige Signale zu erhalten sind stark abhängig von Lösung Komplexität und Zusammensetzung (zB Verunreinigungen) und Analyt Ionisierbarkeit. Hinweis: Wenn eine einstufige Verdünnung nicht nachgibt gute Ergebnisse, sollten Sie ein anderes Verdünnung versuchen. Obwohl counter-intuitive, hoch konzentrierten Analyten Lösungen nur selten zu guten Spektren. Hinweis: Membranproteine ​​benötigen in der Regel größeren Verdünnungen. </li><li> Spot 0.5μl der Probe / Matrix-Gemisch auf der Platte. Ein weißlicher Niederschlag wird an der Schnittstelle zwischen der dünnen Schicht und die Tropfenform. Dieser Niederschlag ist die Co-Kristallisation von Matrix und Analyt. Wenn diese Schicht den Boden des Tropfens deckt, usuVerbündete innerhalb von 10-15 Sekunden, absaugen die überschüssige Flüssigkeit mit einem Vakuum-Linie. Wenn es länger als 30 Sekunden für den Niederschlag zu bilden nimmt, kann es ein Hinweis auf eine Verunreinigung vorhanden, die Kristallisation verhindert, oder Ihre Analyten zu konzentrieren. </li></ol> Kalibrierlösung Anwendung <ol><li> Bereiten Sie die Kalibrierlösung / Matrix-Mischung in einer ähnlichen Weise mit einer abschließenden Kalibrierlösung Konzentration zwischen 0,1-0,5 um. </li><li> Spot 0.5μl Kalibrierlösung / Matrix-Mischung auf dem Teller in der Nähe der Probe Flecken. Diese räumliche Nähe ist in einem pseudo-interne Kalibrierung Verfahren, bei dem die Platte aus der Probe vor Ort auf die Kalibrierlösung Ort während der Probenvorbereitung Akquisition, um nur einige Laser-Aufnahmen des Kalibrierstandards, um das Spektrum hinzuzufügen bewegt werden. Dieser Ansatz garantiert eine höhere Masse Genauigkeit Kalibrierung als externe Kalibrierung nur. </li></ol> Waschschritt <ol><li> Waschen Sie jeden Ort mit rund 2μL einer eiskalten 0,1% wässriger TFA-Lösung. Saugen Sie die überschüssige Flüssigkeit mit einem Vakuum-Linie. </li></ol> Erwerb von Massenspektren <ol><li> Sie sind nun bereit, um Massenspektren zu erwerben. Wenn Sie die FWI Matrix-Lösung verwenden, müssen Sie erwerben Ihre Spektren so schnell wie möglich zu irreversiblen Veränderungen an den Analyten wie Formylierung zu verhindern. </li></ol>

<ol><li>Xiang, F., Beavis, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+to+Increase+Contaminant+Tolerance+in+Protein+Matrix-Assisted+Laser+Desorption+Ionization+by+the+Fabrication+of+Thin+Protein-Doped+Polycrystalline+Films%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">A Method to Increase Contaminant Tolerance in Protein Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization by the Fabrication of Thin Protein-Doped Polycrystalline Films.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8, 199-204 (1994).</li>
<li>Cadene, M., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Robust%2C+Detergent-Friendly+Method+for+Mass+Spectrometric+Analysis+of+Integral+Membrane+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A Robust, Detergent-Friendly Method for Mass Spectrometric Analysis of Integral Membrane Proteins.</a> Analytical Chemistry. 72, 5655-5658 (2000).</li>
<li>Hook, P., Mikami, A., Shafer, B., Chait, B. T., Rosenfeld, S. S., Vallee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+allosteric+control+of+cytoplasmic+dynein+ATPase+activity+by+the+stalk+and+C-terminal+domains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Long-range allosteric control of cytoplasmic dynein ATPase activity by the stalk and C-terminal domains.</a> J Biol Chem. 280, 33045-33054 (2005).</li>
</ol>

Es ist wichtig, dass alle Reagenzien von höchster Qualität (zB HPLC) sind. Puderfrei Handschuhe (Latex oder Nitril) Edelstahl oder Gold MALDI Probenteller Methanol (MeOH) Wasser Kimwipes alpha-Cyano-4-Hydroxy-Säure (4-HCCA) Trifluoressigsäure (TFA) (Endkonzentration in 0,1% in H 2 O) Acetonitril (ACN) Ameisensäure Isopropanol

maldi-probenvorbereitung: die ultra thin-layer-methode

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

Dieses Video demonstriert die Herstellung von ultra-dünnen Matrix / Analyt-Schicht für die Analyse von Peptiden und Proteinen durch Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation-Massenspektrometrie (MALDI-MS) 1, 2. Die ultra-dünne Schicht Methode umfasst die Herstellung einer Trägerschicht aus Matrix-Kristalle (alpha-Cyano-4-Hydroxy-Säure) auf die Probe Platte, die als Impfstoff Boden für nachfolgende Kristallisation aus einer Matrix / Analyt-Mischung dient. Vorteile der ultra-dünne Schicht Methode gegenüber anderen Probe Ablagerung Ansätze (z. B. getrocknete Tropfen) sind, dass es (i) sorgt für mehr Toleranz gegenüber Verunreinigungen wie Salzen und Detergenzien, (ii) eine bessere Auflösung, und (iii) eine höhere räumliche Gleichförmigkeit. Diese Methode ist besonders nützlich für die genaue Bestimmung der Masse von Proteinen. Das Protokoll wurde ursprünglich entwickelt und optimiert für die Analyse von Membranproteinen und verwendet werden, um erfolgreich zu analysieren Ionenkanälen, Transportern Metabolit, und Rezeptoren, die zwischen 2 und 12 Transmembrandomänen 2. Seit der ursprünglichen Veröffentlichung, hat sie auch gezeigt werden, gleichermaßen nützlich für die Analyse von löslichen Proteinen. In der Tat haben wir es für eine große Anzahl von Proteinen mit einer breiten Palette von Eigenschaften, einschließlich solcher mit molekularen Massen so hoch etwa 380 kDa 3 verwendet. Es ist derzeit unsere Methode der Wahl für die molekulare Masse Analyse aller Proteine. Die beschriebene Vorgehensweise konsequent produziert hochwertige Spektren, und es ist empfindlich, robust und einfach zu implementieren.

Dieses Video demonstriert die Herstellung von ultra-dünnen Matrix / Analyt-Schicht für die Analyse von Peptiden und Proteinen durch Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation-Massenspektrometrie (MALDI-MS).

MALDI-Probenvorbereitung: Die Ultra Thin-Layer-Methode

Dieses Video demonstriert die Vorbereitung einer ultraschlanken Matrix-/Analyt-Schicht für die Analyse von Peptiden und Proteinen mittels Matrix-unterstützter Laser-Desorption...

Willkommen zum CHI-Lab-Tutorial zur Ultradünnfilmschichtmethode, die besonders nützlich für die genaue Massenbestimmung von Proteinen ist. Aufgrund der empfindlichen Natur der Massenspektrometrie verwenden wir nur Reagenzien der HPLC-Qualität sowie puderfreie Latex- oder Nitrilhandschuhe, um die Platte zu reinigen. Spülen Sie sie abwechselnd mit Methanol und Wasser und anschließend abschließend erneut mit Methanol.Zwischen den einzelnen Spülschritten wischen Sie vorsichtig das überschüssige Lösungsmittel mit Linsenpapier ab. Diese Waschschritte können nach Bedarf mehrmals wiederholt werden, um eine saubere Platte zu erhalten. Sobald die Platte gereinigt und trocken ist, sollte sie umgehend verwendet werden.Tragen Sie 20 bis 30 Mikroliter dünne Schicht Substratlösung auf die saubere MALDI-Platte auf und verteilen Sie sie gleichmäßig. Hier verwenden wir eine P2-50-Pipettenspitze, um die Lösung gleichmäßig zu verteilen und gleichzeitig ein Kratzen der Platte zu vermeiden. Während die dünne Schicht trocknet, entfernen Sie eventuell verbliebene Wassertropfen vorsichtig durch Abtupfen mit einem Kim-Tuch.Wischen Sie dann die Platte mit einem Kim-Tuch in einer sanften, gleichmäßigen Bewegu

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Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dopamin-Substitutionstherapie Pharmakotherapie mit L-DOPA ist das am häufigsten verwendete symptomatischen Behandlung der Parkinson-Krankheit, sondern wird durch Nebenwirkungen einschließlich der zwangsweisen abnormen Bewegungen, bezeichnet Dyskinesie...

MALDI-Imaging-Massenspektrometrie von Neuropeptiden bei Parkinsonpatienten

Wir haben eine Technologie auf mesoporösen Siliciumdioxid-Dünnschicht zur selektiven Rückgewinnung von niedermolekularen Proteinen und Peptiden aus Humanserum. Die physikalisch-chemischen Eigenschaften unserer mesoporösen Chips wurden fein abgestimmt, um wesentliche Bereicherung in der Peptid-Kontrolle stellen und damit das Profil Serumproteom für diagnostische Zwecke.

Niedermolekulare Protein Enrichment auf mesoporösem Siliciumdioxid Dünnschichten für Biomarker Discovery

Genaue Massenmessung stellt einen wichtigen Schritt bei der Untersuchung von Proteinen. Matrix-unterstützte Laserdesorption / Ionisation (MALDI) Massenspektrometrie (MS) für eine solche Bestimmung verwendet werden, und deren wesentliche Vorteil ist die Toleranz zu Salzen, Detergenzien und Verunreinigungen. Hier veranschaulichen wir eine zugängliche Ansatz für die Analyse von Proteinen, die größer als 100 kDa durch MALDI-MS.

Matrix-assistierte Laser Desorptions / Ionisations-Flugzeit (MALDI-TOF)-Massenspektrometrie-Analyse von intakten Proteinen mit mehr als 100 kDa

Dithranol (DT, 1,8-Dihydroxy-9 ,10-dihydroanthracen-9-on) wurde zuvor als ein MALDI-Matrix für die Gewebeabbildung für kleine Moleküle berichtet wurde, Protokolle für die Verwendung von DT für die MALDI-Imaging von endogenen Lipiden auf die Hier werden Oberflächen von Gewebeschnitten von Positiv-Ionen-MALDI-MS auf einem ultrahochauflösenden Quadrupol-FTICR Instrument zur Verfügung gestellt.

Dithranol als Matrix für Matrix Assisted Laser Desorption / Ionisation Imaging auf einem Fourier-Transformations-Ionen-Zyklotron-Resonanz-Massenspektrometer

Bildgebenden Massenspektrometrie (MSI) ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das benutzt werden kann, um in intakten Geweben entdecken und identifizieren verschiedene chemische Spezies, die Erhaltung der Verbindungen in ihrer natürlichen Umgebung, die neue Einblicke in die biologischen Prozesse zur Verfügung stellen kann. Hierin eine für die Analyse von kleinen Molekülen entwickelt MSI Verfahren beschrieben.

MALDI-Imaging-Massenspektrometrie zur Untersuchung von Metaboliten in<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; Wurzelknöllchen

Eine massenspektrometrische Bildgebungsquelle (MSI), die bei Atmosphärendruck betrieben wird, wurde durch Kopplung von Laserdesorption im mittleren Infrarot und Elektrospray-Nachionisation entwickelt. Als energieabsorbierende Matrix wurde eine exogene Eismatrix verwendet, um die resonante Desorption von gewebebezogenem Material zu erleichtern. Dieses Manuskript enthält ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Durchführung der IR-MALDESI MSI bei einer Ganzkörper-Neugeborenenmaus.

Ganzkörper-Massenspektrometrie Imaging durch Infrarot-Matrix-assistierte Laser-Desorptions-Elektrospray-Ionisations (IR-MALDESI)

Ein Protokoll für die räumliche Heterogenitäten der Ionensignale in der MALDI-Massenspektrometrie Reduzierung von Substrattemperatur während der Probentrocknungsprozesse regulieren demonstriert.

Herstellung von homogenen MALDI Proben für die quantitative Anwendungen

Ein neuartiges Verfahren der Probenvorbereitung wurde entwickelt, um Platz für Zell- und Coculture um niedermolekulare Exchange über bildgebende Massenspektrometrie zu erkennen.

Erfassung von niedermolekularer Kommunikation zwischen Gewebe und Zellen mit Hilfe von Imaging-Massenspektrometrie

Das Ziel dieses Protokolls ist es, detaillierte Anleitungen zur Probenvorbereitung bei der Planung von Experimenten mit MALDI MSI zur Maximierung des metabolischen und molekularen Nachweises in biologischen Proben bereitzustellen.

Probenvorbereitung für metabolisches Profiling mittels MALDI-Massenspektrometrie-Bildgebung

Ziel dieses Protokolls ist es, detaillierte Anleitungen zur richtigen Probenvorbereitung für die Lipid- und Metabolitenanalyse in kleinen Geweben wie dem Drosophila-Gehirn unter Verwendung der matrixgestützten Laserdesorption / Ionisation (MALDI) Massenspektrometrie bereitzustellen.

Probenvorbereitung für die schnelle Lipidanalyse im Drosophila-Gehirn mittels matrixgestützter Laserdesorption/Ionisations-Massenspektrometrie-Bildgebung

Lernen Sie die Ultra Thin-Layer-Methode zur MALDI-MS-Probenpräparation für die genaue Massenbestimmung von Proteinen. Diese Technik zeigt effektive Reinigungs- und Auftragsverfahren für zuverlässige analytische Ergebnisse.

MALDI-Probenvorbereitung: Die Ultra Thin-Layer-Methode

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