Eine optische Bildgebungsmethode mit Rasterelektronenmikroskopie zur mesoskopischen Allzell-Gehirnkartierung

Unsere Forschung konzentriert sich auf die Konnektomik. Wir entwickeln Hochdurchsatzmethoden für optische oder Elektronenbildaufnahme, die die Analyse von Neuroschaltungen und synaptischen Konnektivitätsmerkmalen ermöglichen, um die fundamentale Verbindungslogik von Neuroschaltkreisen zu entschlüsseln. Die ursprüngliche hochrevolutionäre Konnektomik ist auf kleine Gehirnvolumen beschränkt, da die Datenerfassung kostspielig ist und präzise ist, während schnelle mikroskopische Analyse und gezielte mikroskopische Studie Potenzial für ganzhirnbasierte Konnektomik bieten.

Im Vergleich zu anderen mikroskopischen Ansätzen, wie verschiedenen Larsens-Mikroskopen, erfasst OMLIT Bilder aller Neuronen mit Dendrit- und Axonalarminformationen. Neben der Kompatibilität mit dem Elektronenmikroskop gibt es weitere nanoskalige Auflösungsabbildungen unter EF. OMLIT hilft dabei, umfassende Gehirnmodelle zu erstellen, die alle Langstreckenprojektionen abbilden, einschließlich ihrer Richtung, Stärke und Typ, zusammen mit lokalen Mikroschaltkreisen in Kombination mit seriellen Themen. Es bietet Einblicke in die strukturierte Architektur und den Informationsfluss im gesamten Gehirn.

Wir entwickeln automatisierte OMLIT-Bildgebung und EM-Datenerfassung, die von OMLIT-definierten RIs geleitet werden und eine effiziente konnektomische Datenerfassung und -analyse über große oder ganze Gehirnvolumen ermöglichen. Zu Beginn wählen Sie entweder Capton- oder D50-Film mit einer Dicke von 50 Mikrometern und montieren Sie sie auf das motorisierte Wicklungssystem. Mit einem Doppelkopf-Magnetron-Sputtersystem wird eine gleichmäßige dünne Schicht aus Chrom oder anderen Metallen wie Aluminium, Silber oder Kupfer auf die Oberfläche des Bandes aufgetragen.

Positioniere das Band in einem Abstand von 80 Millimetern vom stotternden Ziel. Führen Sie den Prozess unter Gleichstrom und bei einem Druck von einem Pascal aus, der durch 99,99 % Argongas reguliert wird. Stellen Sie nun die Bandwicklungsgeschwindigkeit auf 0,6 Millimeter pro Sekunde ein, um eine Metallbeschichtungsdicke von 50 Nanometern zu erreichen.

Nach der Abscheidung nehmen Sie das Band aus dem System, sobald es auf Zimmertemperatur abgekühlt ist. Bewerten Sie die Dicke und Gleichmäßigkeit der Beschichtung mithilfe eines Stiftprofilers, einer Atomkraftmikroskopie oder einer Rasterelektronenmikroskopie. Für eine Strategie mit geringer Reflexion reinigen und machen Sie das Band hydrophil mit einem Plasmareiniger mit 80 Watt Leistung, während das Band mit sieben Millimetern pro Sekunde bewegt wird.

Nach der Behandlung werden Wassertropfen auf die Bandoberfläche gelegt, um sicherzustellen, dass sie sich schnell zu einer dünnen Schicht ausbreiten. Mit einer kleinen Schleifmaschine oder einem ähnlichen Schneidwerkzeug schneiden Sie das Harz auf der Probeseite grob ab, um das umliegende Blankharz zu entfernen und die Probefläche freizulegen. Legen Sie den in Harz eingebetteten Block in den Probenhalter und ziehen Sie ihn fest, um den Block fest zu sichern.

Montiere den Probenhalter am beweglichen Arm des Mikrotoms. Installieren Sie ein Glasmesser oder ein Diamantmesser im 45-Grad-Winkel auf den Messerhalter. Unter dem Mikroskop schneiden Sie die Probenoberfläche in eine pyramidenförmige Form und glätten Sie sie, dann schneiden und glätten Sie die vier Seiten des Probenblocks, um überschüssiges Harz zu entfernen.

Drehen Sie den Knopf, um die vorderen und hinteren Kanten des Blocks in horizontaler Position auszurichten. Nehmen Sie das Trimmmesser heraus und ersetzen Sie es durch ein Diamantmesser, das im 45-Grad-Winkel eingestellt wird. Stellen Sie den Neigungswinkel der Mikrotombasis auf sechs Grad ein und bewegen Sie den Messerhalter langsam mit dem Knopf, bis die Vorderkante des Messers ein bis zwei Millimeter von der Probenoberfläche entfernt ist.

Beobachte das helle Band zwischen der Probenoberfläche und der Messerkante und passe den Neigungswinkel so an, dass das Band von oben nach unten und von Seite zu Seite gleichmäßig ist. Jetzt injiziere destilliertes Wasser in die Nut des Diamantmessers, um die Klinge zu befeuchten. Entfernen Sie etwas Wasser mit einer Spritze, bis der Flüssigkeitsstand sinkt und die Reflexion silbig erscheint.

Als Nächstes stellen Sie die Schnittdicke, die Schneidgeschwindigkeit und das Schneidfenster in der Steuereinheit ein. Stellen Sie die Schnittgeschwindigkeit auf 0,6 Millimeter pro Sekunde und die Schnittdicke auf 60 Nanometer an, abhängig von der Probequalität. Beginne mit dem Schnitt mit dem Mikrotom.

Sobald stabile und einheitliche Abschnitte hergestellt sind, wird der Prozess pausiert. Dann benutze einen feinen Pinsel, um geschnittene Abschnitte und Ablagerungen zu entfernen. Jetzt installieren Sie sowohl die beschichtete Bandspule als auch eine leere Aufnahmespule auf das automatische, ultradünne Schnittsammelsystem.

Sichern Sie den Verriegelungsmechanismus und führen Sie einen Probelauf durch, um eine gleichmäßige Bandbewegung bei konstanter Geschwindigkeit und ordnungsgemäßes Sammeln auf der Aufnahmespule zu bestätigen. Tauchen Sie den Sammelkopf des tapedierten Sammelgeräts in das Wasserbad des Diamantmessers ein und stellen Sie den Kopf so ein, dass er parallel zur Messerkante mit 1,5-facher Probenschnittlänge ist. Sichern Sie das Sammelgerät und setzen Sie die Sektionierung fort, während Sie gleichzeitig das Bandsammelgerät ausführen.

Nachdem genügend durchgehende Abschnitte gesammelt wurden, pausieren Sie die Schnitte. Schneide das Klebeband an einer Stelle ohne Abschnitte durch. Lass das Bandsammelgerät laufen, bis das gesamte Band auf die Spule gewickelt ist.

Als Nächstes entferne ich die Spule und lege sie in einen elektronischen Trocknungsofen. Reinigen Sie das Tape-Sammelgerät und das Mikrotom und bringen Sie alle Zubehörteile an ihren richtigen Platz. Für die Montage auf einem Siliziumwafer wird die transparente Schutzfolie vom doppelseitigen leitenden Band abgezogen.

Tragen Sie das Band parallel zum doppelseitigen leitenden Band an und setzen Sie bis zu drei Bandstücke auf jedes Stück. Setzen Sie die Siliziumwafer auf die Stufe des optischen Mikroskops und sichern Sie sie mit rücksichtsfreiem Klebeband. Verwenden Sie ein Fünffachobjektiv, um ein Übersichtsbild des Siliziumwafers, des Bandes und der Probe zu erhalten.

Im Übersichtsbild umrisse und sortiere jeden Abschnitt und füge dann Fokus- und Belichtungspunkte hinzu, um eine automatische Bildgebung mit 20- oder 50-facher Vergrößerung über den gesamten Wafer durchzuführen. Nach der Bildaufnahme speichern Sie die Bilder und überprüfen Sie deren Qualität, indem Sie neu fokussieren und abbilden, falls welche unscharf oder von schlechter Qualität sind. Importieren Sie den TIFF-Bildstapel in VAST 22, indem Sie Importieren auswählen, gefolgt von Import Bildvolumen aus den Bildern in die VSV-Datei.

Schließen Sie ein externes Tablet an und verwenden Sie das Pinselwerkzeug und den Segment-Modus, um manuell Strukturen zu segmentieren und nachzuzeichnen. Verwenden Sie die Tasten A und Z, um zwischen Bildschnitten zu navigieren. Visualisieren Sie nun die segmentierte Struktur in drei Dimensionen, indem Sie Fenster auswählen, gefolgt von 3D-Betrachter, Ansicht und Aktualisierung.

Schließlich speichere du die Segmentierungsergebnisse, nachdem du Datei- und Speichersegmentierung ausgewählt hast. In den hochreflektiven Bildern zeigten die zytoplasmatischen und vaskulären Lumenregionen eine höhere Intensität als die umliegenden Bereiche, während in den niedrigreflektiven Bildern die zytoplasmatischen und vaskulären Lumenregionen eine geringere Intensität aufwiesen. Quantifizierte Ergebnisse zeigten, dass die Strategien mit hoher Reflektivität und niedriger Reflexivität

Jede hatte Vorteile hinsichtlich Kontrast und Informationsentropie. Die OMLIT-Optische Mikroskopie-Bildgebung ermöglichte die Identifikation von Axonen, Blutgefäßen, Zellkörpern und Dendriten. Die manuelle Segmentierung von Omelettbildern mit VAST zeigte zahlreiche eng angeordnete Zellkörper, Dendriten und Axone.

Die segmentierten Ergebnisse wurden mit dem Originalbild kombiniert, um eine dreidimensionale Visualisierung zu erzeugen. Vergrößerte OMLIT-Bilder zeigten eine unzureichende Auflösung, um feinere Strukturen sichtbar zu machen. Elektronenmikroskopische Bilder desselben Bereichs zeigten Synapsen, Mitochondrien, Zellkerne und Vesikel.