Mess-replikative Lebensspanne in der Hefe

Die knospende Hefe Croce Visi wurde ausgiebig verwendet, um die Biologie des Alterns zu erforschen. In diesem Artikel stellen wir ein allgemeines Protokoll zur Messung der replikativen Lebensdauer von Hefe-Mutterzellen vor. Hallo, ich bin Kristen Steffen aus dem Labor von Brian Kennedy in der Abteilung für Biochemie an der University of Washington.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Messung der replikativen Lebensdauer von Hefe-Mutterzellen. Mit diesem Verfahren untersuchen wir in unserem Labor Gene, die die Lebensdauer von Hefezellen beeinflussen. Also lasst uns loslegen.

Für das replikative Lebensdauerexperiment und die Vorbereitung von Hefezellen für die Lebensdaueranalyse müssen dazu feste YEPD-Platten vorbereitet werden. Verwenden Sie eine geeignete sterile Technik, um diese YEPD-Agarplatten vorzubereiten. Bereiten Sie mindestens zwei Platten für jeweils vier bis fünf Stämme vor, die im Lebensdauerexperiment analysiert werden sollen.

Diese Platten sollten mindestens zwei Tage vor dem Lebensdauerexperiment vorbereitet und vor Beginn des Lebensdauertests trocknen gelassen werden. Wenn das Experiment nicht innerhalb von vier bis fünf Tagen nach dem Gießen der Platten stattfindet, sollten sie in Parafolie oder Plastik eingewickelt und in einen gekühlten Inkubator gestellt werden, um ein Austrocknen zu verhindern. Entfernen Sie die Hefestämme aus den gefrorenen Brühen und streichen Sie sie für einzelne Völker.

Auf die YEPD-Agarplatten. Bis zu sechs Stämme können problemlos auf derselben YEPD-Platte gestreift werden, indem die Platte in gleich große, tortenförmige Keile unterteilt wird. Inkubieren Sie die Zellen zwei Tage lang bei 30 Grad Celsius.

Nach der Inkubation nehmen Sie die Zellen aus dem Inkubator und patchen Sie die Zellen einer einzelnen Kolonie auf eine frische YEPD-Platte. Zu diesem Zeitpunkt sollten die zu analysierenden Stämme beschichtet werden, um sicherzustellen, dass das Experiment zur replikativen Lebensdauer blind durchgeführt wird. Wo die Dissektoren die Identität der einzelnen Stämme nicht kennen. Ketten.

Inkubieren Sie anschließend die geflickten beschichteten Zellen bei 30 Grad Celsius bis zum nächsten Abend. Entfernen Sie die Zellen und flicken Sie die Zellen von jedem beschichteten Stamm leicht auf frische YEPD-Platten. Diese dienen als Experimentierplatten, die für die replikative Lebensdauer verwendet werden.

Analysezellen sollten entlang einer vertikalen Linie auf der linken Seite der YEPD-Platte geflickt werden. Übertragen Sie nicht zu viele Zellen auf eine einzige frische YEPD-Platte. Da dies zu einem dicken Wachstum der Zellen während der Inkubation über Nacht führt und ihre replikative Lebensdauer beeinträchtigt, sind etwa drei bis fünf Pflaster pro Platte optimal.

Unter der Annahme, dass die replikative Lebensdaueranalyse an 20 Zellen aus jedem Pflaster durchgeführt wird, ist das Lebensdauer-Experiment nun fertig eingerichtet und alles, was sie tun müssen, ist, über Nacht auf dem Labortisch zu inkubieren. Und dann können wir morgen mit der Mikrodissektion beginnen, um die Hefezellen auf der Platte zu positionieren und jungfräuliche Tochterzellen zu gewinnen. Für die replikative Lebensdaueranalyse.

Verwenden Sie ein Mikroskop, das mit einem für Hefe geeigneten Mikrodissektionsgerät ausgestattet ist. Übertragen Sie etwa 50 Zellen vom ersten Patch-Stamm an eine Position auf der Platte, die distal zu den gepatchten Zellen liegt. Wenn Ihr Mikroskoptisch abgestuft ist, können diese Abstufungen verwendet werden, um sicherzustellen, dass die Zellen bei nachfolgenden Iterationen leicht zu finden sind.

Manchmal können Zellen in der Nadel stecken bleiben, was ein Problem sein kann, wenn sie zur falschen Zeit herauskommen. Um sicherzustellen, dass die Nadel sauber und frei von Zellen ist, berühren Sie sie wiederholt mit der Agaroberfläche. Erzeugen Sie dann ein Loch im Agar, indem Sie die Nadel durch die Agaroberfläche drücken.

Dieses Loch dient als Markierung, um Sie bei nachfolgenden Iterationen der Dissektion und Entfernung von Dotterzellen auf der Platte zu orientieren. Achte darauf, dass keine Hefezellen in das Loch gelangen, sonst wachsen sie und bilden direkt über dem Loch eine Kolonie. Vertikal ausgerichtete einzelne Hefezellen in 20 gleichmäßig verteilten Positionen mit einem bis drei Nadeldurchmessern zwischen jeder Zellposition.

Platzieren Sie für jeweils wenige Zellen zwei Zellen nebeneinander an der gleichen Position in der Zeile und nicht in einer. Dies ermöglicht Redundanz bei der Selektion der jungfräulichen Tochterzelle. Wenn es einer der übertragenen Zellen nicht gelingt, sich zwischen der 10. und 11. Position in der Linie zu teilen, erstellen Sie eine horizontale Reihe von sieben bis acht Löchern im Agar.

Dies dient als Markierung, um Sie bei nachfolgenden Dissektionen und Tochterzellentnahmen auf der Platte zu orientieren. Auch hier gilt: Achten Sie darauf, dass keine Hefezellen in die Löcher gelangen, sonst wachsen sie und bilden eine Kolonie. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jedes Feld auf der Platte, und ordnen Sie die Zellen weiterhin vertikal entlang derselben Achse an.

Es ist wichtig, daran zu denken, dass beim Erstellen des Lochs in der AER die Anzahl der erstellten Löcher der Patch-Nummer entspricht, sodass es ein Loch für das erste Patch und zwei Löcher für das zweite Patch gibt. Nachdem die Zellen für jedes Pflaster angeordnet wurden, paraformen Sie die Platte und inkubieren Sie etwa zwei Stunden lang bei 30 Grad Celsius. Denken Sie daran, dass ab diesem Zeitpunkt alle Platten parafilmt werden sollten, es sei denn, sie werden dissektioniert.

Um ein Austrocknen zu verhindern, wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Platte. Im Experiment. Für die Lebensdaueranalyse ist es wichtig, sicher zu sein, dass jede Zelle als jungfräuliche Tochterzelle beginnt.

Um dies zu tun, nehmen Sie zunächst die Platten aus dem Inkubator und vergewissern Sie sich, dass die meisten Array-Zellen eine Zellteilung durchlaufen haben. Was wir hier haben, sind Zellen, die zuvor ausgerichtet wurden, und Sie können sehen, dass sie nach zwei Stunden im Inkubator begonnen haben, sich zu teilen. Und jetzt haben wir eine Mutterzelle, die größere, die an ihrem Körper befestigt ist, die jungfräuliche Tochterzelle, und diese jungfräuliche Tochterzelle ist eine Zelle, die verwendet wird, um die Lebensspanne zu beginnen.

Wenn zusätzliche Zeit benötigt wird, damit die Zellteilung abgeschlossen werden kann, stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator. Beginnend mit der ersten Array-Zelle. Verwenden Sie die Nadel, um Tochterzellen von der Mutterzelle zu lösen, indem Sie die Nadel vorsichtig auf die anhaftenden Zellen legen.

Manchmal ist es hilfreich, auf die Seite des Mikroskopfußes zu klopfen, während die Nadel auf den Zellen aufliegt. Platzieren Sie dann die abgelöste Tochterzelle in der vertikalen Zelllinie, ersetzen Sie die Mutterzelle und alle zusätzlichen Tochterzellen und schieben Sie sie vorübergehend beiseite. Wiederholen Sie diese Schritte für jede der Array-Zellen.

Wenn sich eine Zelle nicht teilt, entnehmen Sie eine Tochterzelle aus einer der redundanten Zellen, die neben der Testzelle positioniert sind. Wenn Sie fertig sind, sollten Sie 20 Tochterzellen für jedes Pflaster haben, die vertikal auf der Lebensdauerplatte ausgerichtet sind. Sammle alle Mutterzellen und überschüssigen Tochterzellen auf einem Stapel und bringe sie zurück in einen Bereich in der Nähe der Flecken, der Friedhof genannt wird.

Es ist wichtig, unerwünschte Zellen von den Zellen fernzuhalten, die einer Lebensdaueranalyse unterzogen werden, um die Bildung von Mikrokolonien und die Erschöpfung lokaler Nährstoffe zu verhindern. Nachdem die Zellen getrennt wurden, wird die Platte abgetrennt und etwa zwei Stunden lang bei 30 Grad Celsius inkubiert. Wiederholen Sie diese Schritte für jede Platte im Experiment.

Um die Replikationskapazität einzelner Zellen zu messen, müssen Sie Datenblätter zur Lebensdauer erstellen. Ein Lebensdauer-Datenblatt kann ein einfaches Raster sein, in dem jede Zeile einer einzelnen Mutterzelle und jede Spalte einem Alterspunkt entspricht. Achten Sie darauf, jedes Datenblatt entsprechend der Anzahl der zu analysierenden Stämme zu beschriften.

Nehmen Sie zunächst die Platten aus dem Inkubator und stellen Sie sicher, dass die meisten Array-Zellen mindestens eine Zellteilung durchlaufen haben. Wenn zusätzliche Zeit benötigt wird, damit die Zellteilung abgeschlossen werden kann, stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator. Beginnen Sie mit der ersten Array-Zelle auf der ersten Platte und beobachten Sie visuell die Mutter und Tochter, die Zelle oder die Zellen, um die Anzahl der aufgetretenen Zellteilungen zu bestimmen.

Es ist im Allgemeinen einfach, anhand charakteristischer Muster der Zellanordnungen zu bestimmen, wie viele Tochterzellen eine Mutter produziert hat. Das ist wirklich einfach zu sehen, wie viele Zellen es produziert hat, weil es zwei gibt und sie sind gleich groß und beide kleiner als die Mutter. Notieren Sie die Anzahl der von der Mutterzelle produzierten Tochterzellen in das entsprechende Feld auf dem Lebensdauer-Score-Blatt.

Verwenden Sie als Nächstes die Nadel, um Tochterzellen von der Mutterzelle zu lösen, wie zuvor beschrieben, indem Sie die Nadel vorsichtig auf die angehängten Zellen legen und auf die Seite des Mikroskopsockels klopfen, während die Nadel auf den Zellen ruht. Halten Sie die Mutterzelle in ihrer Position in der vertikalen Linie und schieben Sie die Tochterzelle(n) vorübergehend zur Seite. Wiederholen Sie diese Schritte für jede der Array-Zellen.

Sammle schließlich alle abgelegten Tochterzellen ein und lege sie auf den Friedhof in der Nähe der ursprünglichen Flecken. Para-Film der Platte und zwei bis drei Stunden bei 30 Grad Celsius inkubieren. Wiederholen Sie das Verwerfen der Tochterzellen und die Inkubation.

Schritt für jede Platte im Experiment. Wiederholen Sie den gesamten Vorgang, bis sich alle Mutterzellen nicht mehr teilen. Denken Sie daran, dass mit zunehmendem Alter der Mutterzellen das Fortschreiten des Zellzyklus langsamer wird und es wünschenswert ist, die Platte zwischen den Alterspunkten länger zu inkubieren. Danach können die Platten über Nacht bei vier Grad Celsius platziert werden.

Die Rohdaten, die von einem replikativen Lebensdauerexperiment erzeugt werden, sind eine Liste von Zahlen, die den Tochterzellen entsprechen, die von jeder Mutterzelle zu jedem Zeitpunkt produziert werden. Wie hier zu sehen. Durch die Summierung jeder Zeile des Scoresheets erhält man die replikative Lebensdauer für jede Mutterzelle.

Daten von anderen Zellen aus derselben Versuchsgruppe können gepoolt werden, um eine Überlebenskurve zu erstellen und statistische Berechnungen durchzuführen. Die Kurve sollte in etwa mit der Gomperts-Mac-am-Kinetik übereinstimmen und eine sigmoidale Form mit geringer früher Mortalität zeigen, gefolgt von einem relativ schnellen Rückgang des Überlebens und einer Abflachung der Kurve im späteren Alter. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie ein Experiment zur replikativen Lebensdauer von Hefe durchführen.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, dass sich die Zellen immer dann teilen, wenn sie nicht in der Kälte sind. Denken Sie also daran, die Platten über Nacht auf vier Grad zu stellen, damit Sie am Morgen nicht zu viele Tochterzellen zum Zählen haben. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.