Mess-replikative Lebensspanne in der Hefe

Die Budding-Hefe Croce Visi wurde umfassend zur Erforschung der Biologie des Alterns verwendet. In diesem Artikel stellen wir ein allgemeines Protokoll zur Messung der replikativen Lebensdauer von Hefe-Mutterzellen vor. Hallo, ich bin Kristen Steffen aus dem Labor von Brian Kennedy am Fachbereich Biochemie der University of Washington.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Messung der reproduktiven Lebensdauer von Hefe-Mutterzellen. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um Gene zu untersuchen, die die Lebensdauer von Hefezellen beeinflussen. Beginnen wir also.

Für das Experiment zur replikativen Lebensdauer und die Vorbereitung der Hefe-Zellen zur Lebensdaueranalyse müssen feste YEPD-Platten hergestellt werden. Verwenden Sie geeignete sterile Techniken, um diese YEPD-Agarplatten herzustellen. Bereiten Sie mindestens zwei Platten für jeweils vier bis fünf Stämme vor, die im Lebensdauerexperiment analysiert werden sollen.

Diese Platten sollten mindestens zwei Tage vor dem Lebensdauer-Experiment hergestellt und vor Beginn des Lebensdauer-Assays austrocknen gelassen werden. Falls das Experiment nicht innerhalb von vier bis fünf Tagen nach dem Gießen der Platten durchgeführt wird, sollten sie mit Parafilm oder Plastikfolie umwickelt und in einen gekühlten Inkubator gestellt werden, um Austrocknung zu verhindern. Entnehmen Sie die Hefestämme aus den gefrorenen Lagerbeständen und streichen Sie sie zur Gewinnung einzelner Kolonien aus.

Auf die YEPD-Agarplatten. Bis zu sechs Stämme können leicht auf derselben YEPD-Platte angeimpft werden, indem die Platte in gleich große, tortenstückförmige Segmente unterteilt wird. Inkubieren Sie die Zellen zwei Tage lang bei 30 Grad Celsius.

Nach der Inkubation entfernen Sie die Zellen aus dem Inkubator und übertragen Zellen aus einer einzelnen Kolonie auf eine frische YEPD-Platte. Zu diesem Zeitpunkt sollten die zu analysierenden Stämme so beschriftet werden, dass das Experiment zur Bestimmung der replikativen Lebensdauer verblindet durchgeführt wird, wobei die Personen, die die Zellen dissezieren, die Identität der einzelnen Stämme nicht kennen.

Als Nächstes inkubieren Sie die gepflasterten, beschichteten Zellen bei 30 Grad Celsius bis zum folgenden Abend. Entfernen Sie die Zellen und pflastern Sie leicht Zellen jeder beschichteten Stamm auf frische YEPD-Platten. Diese dienen als Versuchsplatten für die replikative Lebensdauer.

Analysezellen sollten entlang einer vertikalen Linie auf der linken Seite der YEPD-Platte gepflückt werden. Übertragen Sie nicht zu viele Zellen auf eine einzige frische YEPD-Platte. Da dies zu einem dichten Wachstum der Zellen während der Übernachtsinkubation führen und ihre replikative Lebensdauer beeinträchtigen würde, sind ungefähr drei bis fünf Pflöcke pro Platte optimal.

Unter der Annahme, dass die Analyse der replikativen Lebensdauer an 20 Zellen aus jedem Patch durchgeführt wird, ist das Lebensdauer-Experiment nun vollständig vorbereitet, und es muss lediglich über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert werden. Dann können wir morgen mit der mikroskopischen Dissektion beginnen, um die Hefezellen auf der Platte zu positionieren und virgine Tochterzellen zu gewinnen. Für die Analyse der replikativen Lebensdauer.

Verwenden Sie ein Mikroskop, das mit einer Mikrodissektionsvorrichtung ausgestattet ist, die für Hefe geeignet ist. Übertragen Sie etwa 50 Zellen vom ersten Patch-Stamm an eine Position auf der Platte, die der Position der gepatchten Zellen gegenüberliegt. Falls der Mikroskoptisch skaliert ist, können diese Einteilungen genutzt werden, um sicherzustellen, dass die Zellen in nachfolgenden Schritten leicht auffindbar sind.

Manchmal können Zellen in der Nadel stecken bleiben, was problematisch sein kann, wenn sie zum falschen Zeitpunkt austreten. Um sicherzustellen, dass die Nadel sauber und zellenfrei ist, berühren Sie wiederholt die Agaroberfläche mit der Nadel. Erzeugen Sie dann ein Loch im Agar, indem Sie die Nadel durch die Agaroberfläche zwingen.

Dieses Loch dient als Markierung, um Sie während nachfolgender Schritte der Dissektion und Entfernung der Dotterzellen auf der Platte zu orientieren. Achten Sie darauf, dass keine Hefezellen in das Loch gelangen, da sie sonst wachsen und direkt oberhalb des Lochs eine Kolonie bilden würden. Richten Sie einzelne Hefezellen vertikal in 20 gleichmäßig verteilten Positionen aus, mit einem bis drei Nadeldurchmessern Abstand zwischen jeder Zellposition.

Platzieren Sie für jeweils einige Zellen zwei Zellen nebeneinander an derselben Position in der Reihe, anstatt nur eine. Dies ermöglicht eine Redundanz bei der Auswahl von jungfräulichen Tochterzellen. Falls sich eine der übertragenen Zellen zwischen der 10. und 11. Position in der Reihe nicht teilt, erzeugen Sie eine horizontale Reihe aus sieben bis acht Löchern im Agar.

Dies dient als Markierung, um Sie während nachfolgender Präparationen und Entfernungen von Tochterzellen auf der Platte zu orientieren. Achten Sie erneut darauf, keine Hefezellen in die Löcher zu bringen, da diese sonst wachsen und eine Kolonie bilden würden. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Fleck auf der Platte, wobei Sie die Zellen weiterhin vertikal entlang derselben Achse anordnen.

Es ist wichtig, darauf zu achten, dass bei der Erstellung der Löcher in der AER die Anzahl der erzeugten Löcher der Patch-Nummer entspricht, sodass ein Loch für den ersten Patch und zwei Löcher für den zweiten Patch vorgesehen sind. Sobald die Zellen für jeden Patch angeordnet wurden, parafilmieren Sie die Platte und inkubieren sie etwa zwei Stunden lang bei 30 Grad Celsius. Denken Sie daran, dass von diesem Zeitpunkt an alle Platten mit Parafilm abgedeckt sein sollten, außer wenn sie gerade dissekiert werden.

Um Austrocknung zu verhindern, wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Platte. Im Experiment. Für die Lebensdaueranalyse ist es wichtig sicherzustellen, dass jede Zelle als jungfräuliche Tochterzelle beginnt.

Führen Sie zunächst die Platten aus dem Inkubator heraus und überprüfen Sie, ob die meisten Zellen des Arrays eine Zellteilung durchlaufen haben. Was wir hier sehen, sind zuvor ausgerichtete Zellen, und Sie können erkennen, dass sie nach zwei Stunden im Inkubator mit der Teilung begonnen haben. Nun haben wir eine Mutterzelle, die größere Zelle, die an ihrem Körper befestigt ist, sowie die Jungtochterzelle, und diese Jungtochterzelle ist die Zelle, mit der die Lebensdauer beginnt.

Falls zusätzliche Zeit benötigt wird, um die Zellteilungen abzuschließen, stellen Sie die Platte zurück in den Inkubator. Beginnen Sie mit der ersten Array-Zelle. Lösen Sie mit der Nadel die Tochterzellen von der Mutterzelle, indem Sie die Nadel vorsichtig auf die angehefteten Zellen aufsetzen.

Es kann manchmal hilfreich sein, während die Nadel auf den Zellen ruht, leicht an die Seite des Mikroskopsockels zu klopfen. Danach platzieren Sie die abgetrennte Tochterzelle in der vertikalen Zellreihe, ersetzen die Mutterzelle und alle weiteren Tochterzellen und schieben diese vorübergehend beiseite. Wiederholen Sie diese Schritte für jede Zelle des Arrays.

Falls eine Zelle sich nicht teilt, nehmen Sie eine Tochterzelle von einer der neben der Testzelle positionierten überzähligen Zellen. Am Ende sollten Sie für jeden Patch 20 vertikal auf der Lebensdauer-Platte ausgerichtete Tochterzellen haben. Sammeln Sie alle Mutterzellen und zusätzlichen Tochterzellen zu einem Haufen und übertragen Sie sie zurück in einen Bereich in der Nähe der Patches, der als Friedhof bezeichnet wird.

Es ist wichtig, unerwünschte Zellen weit entfernt von den Zellen zu halten, die der Lebensdaueranalyse unterzogen werden, um die Bildung von Mikrokolonien und eine lokale Erschöpfung der Nährstoffe zu verhindern. Sobald die Zellen getrennt wurden, entfernen Sie das Para von der Platte und inkubieren Sie sie etwa zwei Stunden lang bei 30 Grad Celsius. Wiederholen Sie diese Schritte für jede Platte im Experiment.

Um die replikative Kapazität einzelner Zellen zu messen, müssen Sie Lebensdauer-Datentabellen vorbereiten. Eine Lebensdauer-Datentabelle kann ein einfaches Raster sein, bei dem jede Zeile einer einzelnen Mutterzelle und jede Spalte einem Alterszeitpunkt entspricht. Achten Sie darauf, jede Datentabelle gemäß der Anzahl der zu analysierenden Stämme zu beschriften.

Entfernen Sie zunächst die Platten aus dem Inkubator und überprüfen Sie, ob die meisten Array-Zellen mindestens eine Zellteilung durchlaufen haben. Falls zusätzliche Zeit erforderlich ist, um die Zellteilung abzuschließen, stellen Sie die Platte erneut in den Inkubator. Beginnen Sie mit der ersten Array-Zelle auf der ersten Platte und beobachten Sie visuell Mutter- und Tochterzelle(n), um die Anzahl der stattgefundenen Zellteilungen zu bestimmen.

Es ist im Allgemeinen einfach, anhand charakteristischer Muster der Zellanordnung zu bestimmen, wie viele Tochterzellen eine Mutterzelle hervorgebracht hat. Bei dieser ist besonders leicht zu erkennen, wie viele Zellen gebildet wurden, da sich zwei Zellen befinden, die gleich groß sind und beide kleiner als die Mutterzelle sind. Tragen Sie die Anzahl der von der Mutterzelle produzierten Tochterzellen in das entsprechende Feld auf dem Lebensdauer-Erfassungsbogen ein.

Verwenden Sie anschließend die Nadel, um Tochterzellen von der Mutterzelle abzulösen, wie zuvor beschrieben, indem Sie die Nadel vorsichtig auf die angehefteten Zellen legen und gleichzeitig die Seite des Mikroskoptisches antippen, während die Nadel auf den Zellen ruht. Halten Sie die Mutterzelle in ihrer Position in der vertikalen Linie und bewegen Sie die Tochterzelle oder die Tochterzellen vorübergehend zur Seite. Wiederholen Sie diese Schritte für jede der Anordnungszellen.

Sammeln Sie abschließend alle verworfenen Tochterzellen und bringen Sie sie auf den Friedhof, der sich in der Nähe der ursprünglichen Kolonien befindet. Versiegeln Sie die Platte mit Parafilm und inkubieren Sie sie bei 30 Grad Celsius für zwei bis drei Stunden. Wiederholen Sie das Verwerfen der Tochterzellen und die Inkubation.

Schritt für jede Platte im Experiment. Wiederholen Sie diesen gesamten Vorgang, bis alle Mutterzellen mit der Teilung aufgehört haben. Beachten Sie, dass mit zunehmendem Alter der Mutterzellen die Zellzyklusprogression langsamer wird und es daher sinnvoll ist, die Platte zwischen den Alterszeitpunkten anschließend länger inkubieren zu lassen. Danach können die Platten über Nacht bei vier Grad Celsius aufbewahrt werden.

Die Rohdaten eines Experimentes zur replikativen Lebensspanne bestehen aus einer Zahlenliste, die den von jeder Mutterzelle in jedem Alter erzeugten Tochterzellen entspricht. Wie hier dargestellt. Durch Summierung jeder Zeile des Erfassungsbogens ergibt sich die replikative Lebensspanne jeder Mutterzelle.

Daten von anderen Zellen derselben experimentellen Gruppe können zusammengefasst werden, um eine Überlebenskurve zu erstellen und statistische Berechnungen durchzuführen. Die Kurve sollte in etwa mit der Gompertz-Makeham-Kinetik übereinstimmen, eine sigmoide Form aufweisen, mit geringer Frühsterblichkeit, gefolgt von einem relativ schnellen Rückgang der Überlebensrate und einer Abflachung der Kurve im fortgeschrittenen Alter. Soeben haben wir Ihnen gezeigt, wie man ein Experiment zur replikativen Lebensspanne von Hefe durchführt.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass sich die Zellen weiter teilen, sobald sie sich nicht in der Kälte befinden. Denken Sie daher daran, die Platten über Nacht auf vier Grad Celsius zu stellen, um am Morgen nicht zu viele Tochterzellen zählen zu müssen. Das war's.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.