Bewertung der mikrobiellen Sicherheit von Molkereien mittels Bacterial Proteomic Profiling mittels MALDI-Ansatz

Wir entwickelten ein Protokoll zur Herstellung und Isolierung mikrobieller Gemeinschaften aus verschiedenen Tagesprodukten wie Milch, Sahne, Butter und Käse. Nach der Isolierung kann dieser Mikroorganismus schnell und genau mit MALDI-TOF MS identifiziert werden. Die Optimierung der Kulturbedingungen bleibt eine zentrale Herausforderung, ebenso wie Datenbanklücken und die anspruchsvolle Extraktion von grampositiven und sporenbildenden Bakterien. Zu Beginn nehmen Sie eine repräsentative Probe des Milchprodukts und mischen Sie gründlich, um die Gleichmäßigkeit sicherzustellen.

Aseptisch wird ein Milliliter oder ein Gramm feste Proben in ein 15-Milliliter-konisches Zentrifugenrohr mit neun Millilitern sterilem flüssigem Medium übertragen. Wirbeln Sie das Rohr kräftig für 30 bis 60 Sekunden, um die Probe zu homogenisieren. Anschließend bereiten Sie eine Reihe von zehnfachen Verdünnungen vor, indem ein Milliliter der homogenisierten Suspension in aufeinanderfolgende Röhren übertragen wird, von denen jedes neun Milliliter sterile Lösung enthält.

Jede Verdünnung gründlich durch Vortexen oder Schütteln mischen. Dann nimmt man 0,1 Milliliter der Originalprobe oder eine der zubereiteten Verdünnungen und überträgt sie auf die Oberfläche einer vorbereiteten Petrischale mit dem entsprechenden Agarmedium. Mit einem sterilen Streuer wird das Inokulum gleichmäßig über die Oberfläche der Agarplatte verteilt.

Für die aerobe Inkubation inokulieren Sie APT-, M17-, CBL-, MPCA- und TSA-Agarplatten mit den vorbereiteten Proben. Inkubieren Sie die Platten unter aeroben Bedingungen bei 37 Grad Celsius und 30 Grad Celsius für 24 Stunden. Für die anaerobe Inkubation werden die geimpften MRS-Agarplatten in eine anaerobe Kammer gelegt und bei 37 Grad Celsius bzw. 30 Grad Celsius für 24 bis 72 Stunden inkubiert.

Nehmen Sie die Platten aus dem Inkubator und untersuchen Sie sie täglich, um das Wachstum der Mikrobien zu überwachen. Mit einer mikrolitergroßen mikrobiellen Schleife streicht man die ausgewählten Kolonien auf dasselbe Agar-Medium, um sie zu subkultivieren. Inkubieren Sie unter den gleichen Bedingungen wie bisher.

Für die Massenspektrometrieanalyse beginnen Sie mit der Herstellung der MALDI-Matrixlösung. Bereiten Sie die Lösungsmittelmischung mit 50 % Acetonitril, 47,5 % HPLC-haltigem Wasser und 2,5 % Trichloressigsäure vor. Lösen Sie die Matrixverbindung in der Lösungsmittelmischung auf eine Endkonzentration von etwa 10 Milligramm pro Milliliter.

Zur MS-Identifizierung von Bakterien mittels der direkten Kolonieübertragungsmethode verwenden Sie eine sterile Schleife, um einen Mikroliter einer gewachsenen Bakterienkolonie auf eine Stelle auf der MALDI-Zielplatte zu übertragen. Verteile das bakterielle Material, um eine dünne, gleichmäßige Schicht auf der Platte zu bilden. Nach dem Trocknen geben Sie einen Mikroliter HCCA-Matrixlösung darauf und lassen Sie es bei Zimmertemperatur an der Luft trocknen.

Für die gezielte Methode der Ameisensäureextraktion verwenden Sie eine einwegige mikrobielle Schleife oder einen sterilen Zahnstocher, um eine kleine Menge bakterieller Biomasse aus einer einzelnen Kolonie zu entnehmen. Schmieren Sie das Material direkt auf eine Stelle auf der MALDI-Zielplatte, um eine dünne, gleichmäßige Schicht zu erzeugen. Geben Sie einen Mikroliter 70%ige Ameisensäurelösung über die verschmierte Stelle.

Sobald der Fleck getrocknet ist, überlagern Sie ihn mit einem Mikroliter HCCA-Matrixlösung und lassen Sie ihn bei Raumtemperatur an der Luft trocknen. Für die In-Tube-Proteinextraktionsmethode werden ein bis drei vollständige Kolonien von einer Agarkulturplatte in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr mit 300 Mikrolitern sterilem Wasser übertragen. Fügen Sie 900 Mikroliter absolutes Ethanol hinzu, um eine Endkonzentration von etwa 75 % zu erreichen. Nach kurzem Mischen des Gehalts zentrifugieren Sie das Rohr zwei Minuten lang bei 15.000 g bei Raumtemperatur.

Anschließend entsorge das Supernatant vorsichtig, ohne das Zellpellet zu stören. Anschließend geben Sie 20 bis 50 Mikroliter 70 % Ameisensäure zum getrockneten Zellpellet. Mischen Sie den Inhalt durch Pipetten oder Vortexen, bis die Kugel vollständig wieder suspendiert ist.

Gib nun ein gleiches Volumen Acetonitril zur Ameisensäuresuspension und vermische gründlich. Zentrifugiere das Rohr bei 15.000 g für zwei Minuten. Übertragen Sie einen Mikroliter des resultierenden Supernatanten auf eine bestimmte Stelle auf einer MALDI-Zielplatte und lassen Sie sie trocknen.

Anschließend überlagern Sie die getrocknete Stelle mit einem Mikroliter HCCA-Matrixlösung. Pipettieren Sie einen Mikroliter entweder des bakteriellen Teststandards, der einen Extrakt von Escherichia coli DH5 alpha enthält, oder des mikrobiologischen Kalibrators mit E.coli ATCC 25922 Proteinextrakt, Ribonukles und Myoglobin. Für die Spektrenerfassung und mikrobielle Identifikation bereiten Sie Kalibrierungspunkte auf der MALDI-Zielplatte vor.

Laden Sie die MALDI-Zielplatte sowohl mit den vorbereiteten Probepunkten als auch den Kaliberpunkten in das Massenspektrometrieinstrument. Führen Sie die Kalibrierungsanalyse im Kalibrierungsmodus durch, um das System zu kalibrieren. Betreiben Sie das Massenspektrometer im linearen positiven Ionenmodus zur allgemeinen Spektrenerfassung.

Dann stellen Sie den Massendetektionsbereich des Massenspektrometers so ein, dass er das Massen-Ladungs-Verhältnis von 2.000 bis 20.000 abdeckt. Erstelle Spektren doppelt für jeden Spot, um mindestens vier technische Replikate pro Probe zu erzeugen. Wenden Sie nun die Savitzky-Golay-Methode als Glättungsalgorithmus an.

Verwenden Sie den TopHat-Algorithmus zur Baseline-Korrektur, um Hintergrundgeräusche zu entfernen. Dann detektiere Peaks im Schwerpunktmodus. Laden Sie die verarbeiteten Massenspektren unbekannter bakterieller Isolate auf die mikrobielle Identifikationsplattform innerhalb der MALDI-Software hoch und führen Sie die Identifikation aus.

Bewerten Sie die Identifikationswerte gemäß den Schwellenwerten des Herstellers. Die Massenspektren zeigten artspezifische Proteinprofile, was die Bestimmung auf Gattungs- oder Artebene ermöglichte. Das Dendrogramm zeigte eine hohe Ähnlichkeit, die zwischen Stämmen derselben Art beobachtet wurde, sowie eine klare Unterscheidung zwischen den Arten.

Eine kürzere Inkubationszeit von 12 Stunden für Bacillus licheniformis ergab einen höheren ID-Wert von 2,38, während eine längere Inkubation von 18 bis 24 Stunden aufgrund der Dominanz der Sporensignale zu einem niedrigeren ID-Wert von 1,85 führte. Unter den Probenvorbereitungsmethoden ergab die Proteinextraktion in der Röhre den höchsten ID-Wert von 2,23, gefolgt von der gezielten Ameisensäureextraktion mit 1,97 und direktem Kolonietransfer, was zu der niedrigsten Punktzahl von 1,61 führte. Durch die Kombination von Kulturomik mit maßgeschneiderter Probenvorbereitung ermöglicht MALDI eine präzisere und schnellere Mikrobiomanalyse zu geringeren Kosten und liefert Ergebnisse, die mit den Referenzmethoden 16S rRNA vergleichbar sind.

Dieses Protokoll ermöglicht eine routinemäßige, hochdurchlaufende Überwachung von Mikroorganismen in Milchprodukten, verbessert die Erkennungsgeschwindigkeit und -genauigkeit und stärkt letztlich die Lebensmittelqualitäts- und Sicherheitssysteme. Die Erweiterung der MALDI-Datenbanken und die Automatisierung von Arbeitsabläufen in Industrielaboren werden die mikrobielle Identifikation verbessern, den Durchsatz erhöhen, Fehler reduzieren und die Überwachung der Mikrobiota beschleunigen.