Synthese, Hämoglobinkapselung und biorthogonale PEGylation in hierarchisch porösen UiO-66-Nanopartikeln für Anwendungen zur Sauerstoffabgabe
8. Mai 2026
Dieses Protokoll beschreibt die Synthese, Hämoglobin-Einkapselung und Oberflächen-PEGylation hierarchisch poröser UiO-66-Nanopartikel, die für die Sauerstoffabgabe entwickelt wurden. Das Verfahren kombiniert Defekttechnik mit dehnungsgeförderter biorthogonaler Konjugation, um hochdurchlässige und physiologisch stabile Träger zu erzeugen, die für biomedizinische Anwendungen geeignet sind.
Ziel dieser Forschung ist es, stabile metall-organische Rahmenwerke zu definieren, MOF-basierte Nanopartikel für die Hämoglobinkapselung und Sauerstoffabgabe. Die hierarchische poröse Morph kann die Begrenzung der Postgröße für die Hämoglobinkapselung überwinden, und die Oberflächenpopulation kann die Partikelstabilität in physiologischen Umgebungen verbessern. Zunächst sollten Sie 50 Milligramm hierarchisch poröser UIO 66 präzise wiegen, die Nanopartikel in einen 25-Milliliter-Rundbodenkolben einführen.
Gib 10 Milliliter Tetrahydrofuran in die Flasche. Anschließend ultrasonicieren Sie die Mischung fünf Minuten lang, um die Partikel vollständig zu verteilen und so eine gleichmäßige, undurchsichtige Suspension zu erzeugen. Stellen Sie den runden Boden in ein Eiswasserbad auf einem magnetischen Rührer, der auf 400 U/min eingestellt ist.
Mit einer Glasspritze geben Sie 0,4 Milliliter Tert-Butylnitrit tropfweise über fünf Minuten hinweg ein, während die Temperatur unter fünf Grad Celsius bleibt. Fügen Sie unter denselben kalten Bedingungen sofort 0,35 Milliliter Trimethyl SL-Azid tropfweise hinzu. Ein leichtes Spritzen kann auftreten, was auf einen Nitrosationsfortschritt hinweist.
Dann wickle das Eiswasserbad in Alufolie, um die Reaktion vor Licht zu schützen. Rühren Sie die Reaktionsmischung über Nacht im Eiswasserbad weiter um. Am nächsten Tag waschen und trocknen Sie das Produkt wie gezeigt.
Anschließend verwenden Sie FTIR-Spektroskopie, um die chemische Umwandlung zu überprüfen. Übertrage fünf Milligramm hierarchisch poröser UIO-66-Azid-Nanopartikel in ein zwei-Milliliter-Zentrifugenrohr. Gib 0,5 Milliliter HEPES-Puffer hinzu und sonikiere für zwei bis fünf Minuten.
Fügen Sie 0,5 Milliliter HEPES-Puffer mit 20 Milligramm pro Milliliter Hämoglobin hinzu und wenden Sie das Rohr mehrmals vorsichtig um, um die Nanopartikel vollständig zu verteilen. Nun setze das Rohr auf einen Thermoshaker und inkubiere bei Raumtemperatur mit einem Schütteln von 1.000 U/min für zwei Stunden. Nach der Inkubation wird das Röhrchen bei 13.500 G für fünf Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert, um das hierarchisch poröse Hämoglobin-geladene UIO-66-Azid-Nanopartikel zu pelletieren.
Dann sammeln Sie vorsichtig das Supernatant zur Quantifizierung des nicht gefangenen Hämoglobins. Waschen Sie das Pellet vorsichtig dreimal mit einem Milliliter ultrareines Wasser, indem Sie es auf und ab pipetten, um das lose aufgenommene Hämoglobin zu entfernen. Dann sammeln Sie sorgfältig das Supernatant jeder Wäsche zur Quantifizierung des eingeschlossenen Hämoglobins.
Das endgültige Pellet wird in 0,5 Millilitern ultrareines Wasser aufgehängt und vor der Charakterisierung im Kühlschrank gelagert. Verwenden Sie den Natriumlorbeer-Sulfat-Hämoglobin-Test, um das eingeschlossene Hämoglobin in den gesammelten Supernatanten zu bestimmen. Pipettieren Sie 10 Mikroliter jedes Überlagerungsmittels in eine 96-Brunnen-Mikroplatte.
Gib 100 Mikroliter Natriumlorbeersulfat-Reagenz hinzu und brüte fünf Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln. Mit einem ultravioletten sichtbaren Spektrophotometer wird die Absorption bei 412 Nanometern gemessen. Anschließend bereiten Sie eine serielle Verdünnung des Hämoglobinbestands im HEPES-Puffer vor, um eine Standardkurve zu erzeugen.
Übertragen Sie die vorbereiteten Verdünnungen in die vorbereitete 96-Bohrlochplatte, um eine Standardkurve zur Umwandlung von Absorptionswerten in Hämoglobinkonzentrationen zu erzeugen. Übertragen Sie 10 Milligramm des hierarchisch porösen Hämoglobin-Hämoglobin-Azid-Nanopartikels UIO 66 in ein zwei-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, das 0,5 Milliliter ultrareines Wasser und Sonikat enthält, für zwei bis fünf Minuten. Fügen Sie 20 Milligramm Dibenzocyclooctan hinzu, das mit Polyethylenglykol modifiziert wird, um ein äquimolares Verhältnis von Polyethylenglykol zu Nanopartikeln zu erreichen.
Vortexen Sie das Rohr, bis das Gemisch homogenisiert ist. Setzen Sie das Rohr auf einen Thermoshaker und inkubieren Sie bei Raumtemperatur, wobei Sie eine Stunde lang bei 1.000 U/min geschüttelt werden. Dann wird das Röhrchen in einen Kühlschrank gebracht, der bei vier Grad Celsius gehalten wird, um über Nacht zu reagieren.
Zentrifugieren Sie das Rohr bei 12.000 G für fünf Minuten bei Raumtemperatur, um die Polyethylenglykol-modifizierten, hämoglobingeladenen, hierarchisch porösen UIO-66-Nanopartikel zu pelletieren. Dann entsorge das Überdachungsmittel, das nicht reaktives Polyethylenglykol enthält. Waschen Sie das Pellet dreimal mit zwei Millilitern ultrareinem Wasser, indem Sie auf und ab pipettieren und unter denselben Bedingungen wie zuvor gezeigt zentrifugieren.
Suspendieren Sie die gereinigten, pegylierten Hämoglobin-geladenen, hierarchisch porösen UIO-66-Polyethylenglykol-Nanopartikel in zwei Millilitern ultrareinem Wasser. Lagern Sie die Federung bei vier Grad Celsius. Das entstehende Kolloid erscheint homogen und leicht opalisierend, was auf eine gute Dispersionsstabilität hinweist.
Dann bestätigen Sie die erfolgreiche Pegyllierung durch dynamische Lichtstreuung, oder DLS. Oberflächenaminogruppen wurden erfolgreich in Azide umgewandelt. Dies wurde durch das Auftreten eines charakteristischen asymmetrischen Azid-Dehnungsbandes bei 2.122 inversen Zentimetern im FTIR-Spektrum hierarchisch poröser UIO-66-Azid-Nanopartikel demonstriert.
Dieses Band fehlte bei hierarchisch porösen UIO-66-Amin-Nanopartikeln. Die Hämoglobinkapselung wurde visuell durch einen deutlichen Farbwechsel von Gelb zu Rot angezeigt. Die Stickstoffaufnahme nahm nach der Hämoglobinbelastung ab, was auf die Besetzung der Mesopore durch Hämoglobinmoleküle hinweist.
Das Zeta-Potenzial der hierarchisch porösen UIO-66-Azid-Nanopartikel sank nach der Hämoglobin-Einkapselung von 42,9 Millivolt auf 20,4 Millivolt. Die erfolgreiche Polyethylenglykol-Konjugation wurde durch das Verschwinden der Dehnungsvibration der Azide bei 2.122 inversen Zentimetern und das Auftreten von Polyethylenglykol-assoziierten Signalen im FTIR-Spektrum bestätigt. Die DLS-Analyse zeigte einen Anstieg des hydrodynamischen Durchmessers von etwa 114,9 auf 140,8 Nanometer nach der Pegylierung, wobei ein niedriger PDI beibehalten wurde.
Dieses Partikel ermöglicht die Synthese hierarchisch poröser Morph-Nanopartikels, Hämoglobinkapselung, Oberflächenpekulation und Bewertung der Sauerstofffreisetzungsfunktion. Mit diesem Protokoll können zusätzliche physikalisch-chemische Charakterisierungen und funktionelle Untersuchungen durchgeführt werden, einschließlich der Analyse der Sauerstofffreisetzung in vitro und der Biokompatibilität von Nanopartikeln. Zukünftige Studien können sich darauf konzentrieren, die Funktionalität des Hämoglobins länger zu erhalten, etwa durch die Einbindung von Komponenten, um einen substanziellen Abbau zu verhindern.
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Overview
This article presents a detailed, scalable protocol for fabricating hierarchically porous UiO-66 nanoparticles (HP-UiO-66 NPs) designed to encapsulate hemoglobin (Hb) for use as hemoglobin-based oxygen carriers (HBOCs). The protocol emphasizes reproducibility, scalability, and stability, utilizing bioorthogonal polyethylene glycol (PEG) shells to enhance nanoparticle performance and biocompatibility. The workflow is modular and adaptable for encapsulating other biomacromolecules or enzymes for therapeutic delivery.
Key Study Components
Area of Science
- Nanomaterials
- Biomaterials
- Oxygen delivery systems
- Biomedical engineering
Background
- Hemoglobin-based oxygen carriers (HBOCs) are developed to address hypoxia in biomedical applications.
- Free hemoglobin is unstable and vasoactive outside red blood cells, limiting its direct use.
- Metal-organic frameworks (MOFs), such as UiO-66, offer tunable porosity and stability for encapsulation.
- PEGylation is commonly used to improve nanoparticle stability and biocompatibility.
Purpose of Study
- To provide a reproducible, step-by-step protocol for fabricating HP-UiO-66 NPs encapsulating Hb.
- To enhance the stability and oxygen-carrying capacity of encapsulated Hb using PEG shells.
- To detail troubleshooting strategies and critical parameters for inter-laboratory reproducibility.
Methods Used
- Defect engineering of UiO-66-NH2 nanoparticles via dodecanoic acid modulation and acid washing.
- Surface amine conversion to azides for subsequent bioorthogonal chemistry.
- Encapsulation of hemoglobin in buffered aqueous media.
- PEGylation using catalyst-free strain-promoted alkyne-azide cycloaddition (SPAAC).
- Comprehensive physicochemical characterization (crystallinity, porosity, surface chemistry, PEG corona).
- Functional assays for oxygenation/deoxygenation of encapsulated Hb.
Main Results
- Gram-scale production of HP-UiO-66-NH2 NPs per batch is achievable.
- Encapsulation efficiencies of ~35% (loading content ~24 wt%) for Hb under mild conditions.
- PEGylated NPs exhibit a hydrodynamic diameter of ~140 nm and low polydispersity.
- Physicochemical analyses confirm framework integrity, mesoporosity, and successful PEGylation.
- Encapsulated Hb retains reversible oxygenation/deoxygenation capacity.
- PEGylation significantly improves colloidal and structural stability in various biological media.
Conclusions
- The protocol enables robust, scalable fabrication of MOF-based HBOCs with high encapsulation efficiency and stability.
- PEGylation is critical for maintaining nanoparticle integrity and function in physiological environments.
- The workflow is modular and adaptable for other therapeutic biomacromolecules or enzymes.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Hierarchically porous UiO-66 nanoparticles encapsulating hemoglobin and stabilized by bioorthogonal PEGylation address critical challenges in oxygen delivery system development. This modular, scalable protocol enhances predictive confidence in nanoparticle-based therapeutic carriers by ensuring reproducibility, stability, and functional oxygen transport. The approach supports robust pipeline integration for advanced biomacromolecule delivery platforms in biopharma R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic evaluation of nanoparticle encapsulation and stabilization strategies for therapeutic protein delivery.
- Supports mechanistic de-risking by verifying hemoglobin functionality post-encapsulation and PEGylation.
- Facilitates target validation for oxygen carrier systems through quantitative oxygenation/deoxygenation assays.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible nanoparticle preparations for downstream screening of oxygen delivery efficacy.
- Delivers quantitative encapsulation efficiency and physicochemical characterization outputs for assay benchmarking.
- Enables scalable production of uniform nanoparticles, supporting high-throughput screening and platform reuse.
Translational & Preclinical Research
- Demonstrates stability and functional retention of encapsulated hemoglobin in physiologically relevant media.
- Aligns with translational biomarker requirements by confirming reversible oxygen transport in vitro.
- Supports risk-adjusted advancement of nanoparticle-based HBOCs toward preclinical evaluation.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol positions HP-UiO-66-PEG nanoparticles as a bridge from early discovery through preclinical model development for oxygen carrier therapeutics.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing for protein encapsulation and stabilization in MOF-based carriers.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for nanoparticle characterization and functional assays.
- Analytics: Supplies encapsulation efficiency, hydrodynamic size, and oxygenation data for comparative analysis.
- Translational Research: Demonstrates nanoparticle stability and function in serum and physiological buffers.
- Enterprise Reuse: Offers a modular workflow adaptable to other therapeutic biomacromolecules or enzymes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in nanoparticle-based oxygen carriers and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes nanoparticle synthesis and PEGylation for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making for therapeutic carrier platforms and enhances capital efficiency.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of advanced delivery systems for hypoxia mitigation and beyond.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nanoparticle synthesis, surface chemistry, and protein encapsulation.
- Needs access to analytical instrumentation for physicochemical and functional characterization.
- Demands cross-team standardization of critical parameters and troubleshooting protocols.
- Adaptable to various biomacromolecules with consideration for protein stability and compatibility.
- Scale-up and reproducibility depend on precise control of defect engineering and PEGylation steps.
