Visualisierung und quantitative Analyse der durch Genotoxin induzierten PARP1/PARP2-Aktivierung in Zellen mit einem fluoreszierenden Fusionsprotein-basierten Reporter

Unser Labor untersucht PARP1- und PARP2-abhängige DNA-Reparatur- und DNA-Schadensreaktionswege in normalen und transformierten Zellen. Eine Herausforderung auf diesem Gebiet ist die quantitative Analyse der PARP1- und PARP2-Aktivierung in Zellen unter Vermeidung von Zelllyse. Dies ermöglicht subzelluläre Lokalisierungsstudien.

Zu Beginn geben Sie 375 Mikroliter fetales Rinderserum und Penicillin-Streptomycin-freies DMEM in ein 1,5-Milliliter-steriles Mikrozentrifugationsrohr. Dann geben Sie 10 Mikroliter eines lipidbasierten Transfektionsreagens und alle benötigten Plasmide in die Röhre. Tappen Sie vorsichtig auf das Mikrozentrifugationsrohr, um das Medium, das Transfektionsreagenz und die Plasmid-DNA zu mischen.

Inkubieren Sie bei Raumtemperatur 15 bis 30 Minuten, um die Bildung von DNA- und Transfektionsreagenzkomplexen zu ermöglichen. Anschließend wird das Plasmid- und Transfektionsreagenz-Gemisch tropfweise in die 60-Millimeter-Schale mit den kultivierten 293-Fuß-Zellen gegeben, ohne das Medium zu entfernen, und die Zellen für 48 Stunden in den Inkubator zurückgegeben. Anschließend entnehmen Sie das Kulturmedium aus den transfektierten 293-Fuß-Zellen.

Um die Lentiviruspartikel zu isolieren, wird das gesammelte Medium durch einen sterilen 0,45-Mikrometer-Filter gefiltert, um Zellreste von den lentiviralen Partikeln zu trennen. Für die Transduktion werden die gewünschten Zellen 24 Stunden lang kultiviert und überprüft, dass die Zellkonfluenz zwischen 20 % und 40 % liegt; anschließend geben Sie einen Milliliter Virus, einen Milliliter Wachstumsmedium und zwei Mikroliter Polybren zu einem 15-Milliliter-konischen Rohr, das sanft durch Inversion gemischt wird. Entferne nun das Wachstumsmedium von der Sechs-Loch-Platte.

Gib jedem Brunnen die Mischung aus Virus, Medium und Polybrene zu. Platzieren Sie die Zellen mit dem Transduktionsgemisch in einem Inkubator mit einer befeuchteten Atmosphäre bei 32 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid für 16 bis 18 Stunden. Zur Validierung der Expression der RNF146-Aminosäuren, 100 bis 182 EGFP, Samen 200.000 LivePAR-exprimierende Zellen pro Kulturschale, die Deckfolien enthalten.

Lassen Sie die Zellen 24 bis 36 Stunden an den Deckschichten haften, konditionieren Sie das Medium und beginnen Sie mit der Replikation. Dann setzen die LivePAR-exprimierenden Zellen den gegebenen Reagenzien aus. Gib die Verbindungen direkt in das Medium, das die Zellen auf den Deckungslisten enthält, und wirbelte das Medium vorsichtig in den Zellkulturschalen, um die Verbindungen zu verteilen.

Inkubieren Sie die 60-Millimeter-Schalen bei 37 Grad Celsius für 60 bis 90 Minuten. Um die Zellen zu reparieren, entferne das Medium und wasche die Zellen mit PBS. Präfixiere die Zellen mit 4 % Formaldehyd in PBS für 15 Minuten bei Raumtemperatur.

Nach dem Entfernen des Formaldehyds werden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen. Dann gibt man drei Milliliter kaltes Methanol und Aceton in den Zellen im Verhältnis 7:3, um sie zu fixieren. Stellen Sie das Geschirr neun Minuten lang bei minus 20 Grad Celsius auf.

Dann entferne ich die Methanol-Aceton-Lösung. Nachdem Sie die Zellen dreimal mit PBS gewaschen haben, pipettieren Sie 15 Mikroliter Antifade-Medium mit DAPI auf eine Glasfolie. Montiere den Deckel-Streuer vorsichtig auf das Montagemedium, sodass die Zellen nach innen zeigen, und minimiere dabei Blasen.

Zentriere und befestige den Deckel auf dem Glasschlitten und versiegele die Seiten mit einer kleinen Menge klarer Nagelemaille an den Rändern. Legen Sie die Objektträger im Dunkeln, damit der Nagelschmelz trocknen kann. Nachdem Sie Bild J heruntergeladen und installiert haben, öffnen Sie Bild J und installieren Sie die Makro-Textdatei LivePAR_Macro, indem Sie auf Plugins klicken, Makros auswählen und Installieren auswählen.

Öffne alle konfokalen Dateien in Bild J und speichere sie als TIFF-Dateien, um die Originaldateien zu erhalten. Dann öffne ein Tabellenkalkulationsdokument und speichere es als Date_CellLineFociAnalysis. Analysiere jeweils eine TIFF-Datei.

Drücke 1, um die Kerne zu finden. Wenn sich das ROI-Manager-Fenster öffnet, wählen Sie alle Einträge aus und drücken Sie auf Hinzufügen, um den Kernbereich über das Originalbild zu legen. Entfernen Sie falsch identifizierte Kerne und schließen Sie Kerne aus, die nicht vollständig innerhalb des Rahmens liegen.

Dann zeichnen Sie den Kern mit dem Freihand-Auswahlwerkzeug und drücken Sie 2, um die PAR-Brennpunkte zu quantifizieren. Wählen Sie jeden Kern im ROI-Manager aus und zählen Sie die Anzahl der Brennpunkte pro Kern. Kopiere und füge die quantifizierten Daten nach dem Bewerten aller Kerne in die offene Tabellenkalkulation ein.

Wiederholen Sie die Analyse ebenso für alle TIFF-Dateien. Nach Abschluss werden die PAR-Brennpunkte pro Kern in der gewünschten Software eingezeichnet. Die Kontrollzellen des Vehikels zeigten panzelluläre EGFP-Färbung.

Mit Genotoxin behandelte Zellen zeigten eine Ansammlung von Kernbrennpunkten, die die Lokalisierung im Kern darstellen. Die Vorbehandlung mit dem PARP1- und PARP2-Inhibitor Veliparib führte zum Verlust der PAR-Foci. Die Quantifizierung der Anzahl der PAR-Foci pro Kern als Funktion von Zeit und Behandlungsbedingungen zeigte ähnliche Ergebnisse.

Dieses Protokoll ermöglicht es uns, die Aktivierung der PARP1- und PARP2-Signalachse als Reaktion auf Genotoxine und anschließende genetische Veränderungen zu quantifizieren. Wir haben mit diesem Test traditionelle Immunfluoreszenztechniken eingesetzt, um die Kolokalisation von Proteinen mit Poly ADP-Ribose zu validieren. Zukünftig verwenden wir diesen Assay für Genotoxizitätstests, Hochdurchsatzanalysen von PARP1-, PARP2- oder PARP-Inhibitoren sowie zur Identifizierung neuer Faktoren, die an der PARP1- und PARP2-Signalübertragung beteiligt sind.