Entstehung und einzellige transkriptomische Analyse von hepatozellulären Karzinom-Organoiden nach medikamentöser Behandlung
26. Mai 2026
Dieses Protokoll beschreibt eine optimierte Methode zur Erzeugung von hepatozellulären Karzinom-Organoiden, zur Anwendung einer medikamentösen Behandlung und zur Durchführung einer Einzelzell-RNA-Sequenzierung vor und nach der Behandlung, um therapieassoziierte transkriptionale Veränderungen zu charakterisieren.
Wir konzentrieren uns darauf, wie HCC-Organoide auf medikamentöse Behandlung reagieren und wie sich ihre translationalen Studien am Arbeitsplatz verändern. Dieses Protokoll ist für HCC-Organoide nützlich und kann auch an andere Tumororganoidsysteme angepasst werden. Zu Beginn werden hepatozelluläre Karzinome oder von HCC-Patienten abgeleitete Organoide etabliert und auf therapeutische Störungen vorbereitet.
Bereiten Sie die Lenvatinib-Fondlösung gemäß den Anweisungen des Herstellers in Dimethylsulphoxid (DMSO) vor. Verdünnen Sie die Lagerlösung unmittelbar vor der Verwendung in einem vorwarmen Kulturmedium auf die vordefinierte Arbeitskonzentration. Bereite genügend Lösung vor, um in allen Brunnen gleiche Endvolumina zu erreichen, wobei die gleiche DMSO-Konzentration in jedem Brunnen gewährleistet ist.
Als Nächstes fügen Sie ein lenvatinibhaltiges Medium mit 20 Mikromolaren entlang der Wand jedes Bohrlochs hinzu, um die Matrixkuppeln nicht zu stören. Fügen Sie eine Fahrzeugsteuerung mit derselben endgültigen DMSO-Konzentration hinzu. Inkubieren Sie die Organoide unter Standardkulturbedingungen für die vordefinierte Behandlungsdauer.
Bei Behandlungen, die über 72 Stunden dauern, wird das medikamentenhaltige Medium alle 48 bis 72 Stunden ersetzt, um einen einheitlichen Austauschplan in allen Brunnen sicherzustellen. Zeichnen Sie vor der Behandlung Basisbilder von Hellfeldbildern auf. Aufnahme von Bildern in festen Abständen während der Behandlung mit identischen Mikroskopeinstellungen, Vergrößerungs- und Feldpositionen.
Für die morphologiebasierte Bewertung der Behandlungsreaktion verwenden Sie für alle Bilder identische Belichtungseinstellungen, Vergrößerungs- und Analyseschwellen. Messen Sie die Wachstumskurve der Organoidfläche, indem Sie die gesamte Organoidfläche pro Bohrloch oder Feld zu jedem Zeitpunkt berechnen und die Werte auf den Ausgangswert normalisieren. Um den mittleren Organoiddurchmesser zu messen, bestimmen Sie den Durchmesser einzelner intakter Organoide und berechnen Sie den Mittelwert pro Bohrloch.
Als Nächstes bestimmen Sie die erhaltene Anzahl der Organoide, indem morphologisch identifizierbare intakte Organoide gezählt werden, wobei alle Trümmer oder kollabierte Fragmente ausgeschlossen werden. Führen Sie am Behandlungsendpunkt eine dreidimensionale Lumineszenz-Viabilitätsprüfung durch, wenn eine weitere Bulk-Viabilitätsbewertung gemäß den Anweisungen des Herstellers erforderlich ist. Dann wird die Wachstumskurven der Organoidfläche über die Zeit dargestellt.
Vergleichen Sie den mittleren organoiden Durchmesser zwischen vehikelbehandelten und lenvatinib-behandelten Gruppen. Vergleichen Sie außerdem die Anzahl überlebender Organoide zwischen den Behandlungsgruppen. Stellen Sie sicher, dass konsistente Bildaufnahmepläne, Einschlusskriterien und Analyseparameter verwendet werden, um die Reproduzierbarkeit sicherzustellen.
Wähle organoide Brunnen mit intakter 3D-Morphologie, ausreichendem Material für den Einfang einzelner Zellen und ohne sichtbare Kontamination. Zeichnen Sie Hellfeldaufnahmen jeder ausgewählten Person lange vor der Dissoziation mit identischen Mikroskopeinstellungen, Vergrößerungs- und Feldauswahlkriterien auf. Organoide zu übereinstimmenden Zeitpunkten zwischen Kontroll- und behandelten Gruppen sammeln, wobei die Beschichtungsdichte, der Behandlungsplan und die Medium-Ersatzbedingungen in allen Proben erhalten bleiben.
Aspiriere das Kulturmedium vollständig aus jedem Brunnen. Waschen Sie jeden Behälter zweimal mit eiskalten PBS, um Rückstände und Schmutz zu entfernen. Fügen Sie jedem Brunnen einen Milliliter Eiskaltezell-Rückgewinnungslösung hinzu und inkubieren Sie 20 bis 30 Minuten auf Eis.
Pipette während der Inkubation alle fünf bis sieben Minuten sanft, um die Matrixauflösung zu erleichtern. Übertragen Sie das gelöste Material in vorgekühlte Röhren mit einer breiten oder geschnittenen Pipettenspitze, um die Überspannung zu minimieren. Die enzymatische Dissoziation wird erst dann durchgeführt, wenn die Matrix weitgehend gelöst ist und nur minimale sichtbare Gelreste übrig sind.
Zentrifugiere die gewonnene organoide Suspension bei 300 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie das Überlagermittel vorsichtig, ohne das Pellet zu stören. Das Pellet wird in einem Milliliter rekombinanten Zelldissoziationsenzyms wieder suspendiert und bei 37 Grad Celsius für fünf bis zehn Minuten inkubiert.
Pipette acht bis zehn Mal vorsichtig alle zwei bis drei Minuten mit einer breiten P1000-Spitze, um die Dissoziation zu fördern. Die Verdauung wird gestoppt, wenn die meisten organoiden Fragmente in Einzelzellen verteilt sind und nur noch kleine Restcluster übrig bleiben. Anschließend geben Sie vier Milliliter eiskaltes PBS mit 2 % fetalem Rinderserum dazu, um die Verdauung zu stoppen.
Anschließend wird die Suspension durch ein 40-Mikrometer-Zellsieb gefiltert. Waschen Sie einmal mit PBS, um Restenzyme, Aggregate und Ablagerungen zu entfernen. Zähle die Zellen mit Trypan-Blue-Ausschluss.
Nachdem die Zelllebensfähigkeit von 85 % oder mehr gewährleistet ist, wird die Endkonzentration auf 700 zu 1.200 Zellen pro Mikroliter angepasst. Proben mit übermäßigem Abfall, zahlreichen toten Zellen, großen sichtbaren Aggregaten oder unvollständiger Dissoziation werden ausgeschlossen. Wiederholen Sie die Filtration vor dem Laden, wenn Zuschlagstoffe vorhanden sind.
Prozesskontrolle und behandelte Proben unter identischen Bedingungen, einschließlich Dissoziationsenzym, Verdauungszeit, Pipettfrequenz, Filtrationsmethode, Zellkonzentration und Ladestrategie. Schließlich wird nach der Einzelzellbibliotheksverstärkung eine Einzelzellsequenzierung durchgeführt. Organoid überlebte und expandierte unter den üblichen dreidimensionalen Kulturbedingungen vom ersten bis zum sechsten Tag nach der Genesung.
Am ersten Tag erschienen Organoide als kleine, kompakte Strukturen, während sie am sechsten Tag eine größere Größe und eine klar definierte Morphologie zeigten. Mit Lenvatinib behandelte Organoide waren kleiner und zeigten eine veränderte Morphologie im Vergleich zu DMSO-behandelten Kontrollen. Quantitative Analysen zeigten eine Verringerung des mittleren organoiden Durchmessers nach Lenvatinib-Behandlung im Vergleich zu DMSO-Kontrollen.
Dieses Protokoll ermöglicht es uns, Veränderungen im Zellzustand, der zellulären Zusammensetzung und der Genexpression nach der Behandlung zu untersuchen. Die größte Herausforderung besteht darin, die Zellviabilität zu erhalten und die einfache Verarbeitung über alle Gruppen hinweg konsistent zu halten. Zelluläre Downstream-Analysen können nach diesem Verfahren durchgeführt werden, einschließlich Clustering, Analyse differenzialer Genexperimente, Analyse der Weganreicherung und Treasury-Inferenz.
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Overview
This article presents a standardized workflow for generating hepatocellular carcinoma (HCC) organoids, applying drug treatment, and performing single-cell RNA sequencing to analyze transcriptional changes before and after treatment. The protocol is robust, scalable, and adaptable to other tumor organoid systems, enabling detailed characterization of cellular composition and gene expression changes associated with drug exposure.
Key Study Components
Area of Science
- Cancer biology
- Organoid technology
- Single-cell transcriptomics
Background
- Hepatocellular carcinoma is a leading cause of cancer-related deaths worldwide.
- Marked intratumoral heterogeneity in HCC contributes to variable treatment responses and disease progression.
- Understanding transcriptional changes in tumor cells before and after drug treatment is critical for improving therapies.
- Existing workflows connecting organoid-based drug treatment with single-cell transcriptomic profiling are limited.
Purpose of Study
- To develop a reproducible protocol for drug treatment and single-cell RNA sequencing of HCC organoids.
- To enable side-by-side comparison of cellular and transcriptional changes in response to therapy.
- To provide technical guidance for improving reproducibility and sample quality in organoid studies.
Methods Used
- Establishment and expansion of HCC patient-derived organoids.
- Drug treatment with lenvatinib and vehicle control under standardized conditions.
- Imaging and quantitative assessment of organoid morphology, area, diameter, and viability.
- Single-cell dissociation, viability assessment, and preparation for single-cell RNA sequencing.
- Comparative analysis of single-cell transcriptomic data, including clustering and pathway enrichment.
Main Results
- Lenvatinib-treated organoids showed reduced size and altered morphology compared to controls.
- Quantitative analysis revealed a decrease in mean organoid diameter after drug treatment.
- The protocol preserved high cell viability and reproducibility across samples.
- Single-cell RNA sequencing enabled detailed analysis of cell state, composition, and gene expression changes post-treatment.
Conclusions
- The workflow provides a practical and scalable approach for studying drug responses in HCC organoids at single-cell resolution.
- It facilitates robust comparative analysis of transcriptional changes associated with therapy.
- The protocol is adaptable to other organoid systems and supports downstream cellular analyses.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Single-cell transcriptomic profiling of hepatocellular carcinoma (HCC) organoids before and after drug treatment addresses the challenge of intratumoral heterogeneity and variable therapeutic response. This workflow enables high-resolution analysis of cellular and transcriptional changes, supporting predictive confidence in early-stage oncology discovery. The protocol's scalability and adaptability position it as a reusable platform for portfolio-wide mechanistic de-risking and target validation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of therapeutic hypotheses by capturing drug-induced transcriptional shifts at single-cell resolution.
- Supports biological de-risking through detailed mapping of cell state and composition changes post-treatment.
- Facilitates functional target validation by linking drug exposure to specific gene expression alterations.
- Provides predictive confidence for triaging candidate compounds based on mechanistic response profiles.
Screening & Assay Development
- Prepares validated organoid systems for downstream screening and quantitative assessment of drug effects.
- Standardizes imaging, viability, and morphological metrics to ensure reproducibility and assay reliability.
- Enables scalable, side-by-side evaluation of compound efficacy using robust, quantitative outputs.
- Supports platform reuse across different tumor organoid models for broader screening applications.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro drug response data with disease-relevant cellular heterogeneity observed in patient tumors.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling comparative transcriptomic analysis.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by revealing pathway-level and cell-type-specific drug effects.
- Enhances predictive de-risking for translational biomarker identification and validation.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates from early discovery through lead identification and preclinical research, bridging drug perturbation studies with high-content single-cell analytics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping drug-induced gene expression changes.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts for compound evaluation in organoid models.
- Analytics: Enables clustering, differential expression, and pathway enrichment analyses to compare treatment conditions.
- Translational Research: Connects in vitro findings to disease-relevant cellular diversity and biomarker discovery.
- Enterprise Reuse: Provides a standardized, adaptable workflow for repeated use across oncology portfolios.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in drug response studies.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable workflows for organoid-based analytics.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by enabling robust early-stage de-risking.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of oncology assets based on high-content data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in organoid culture, single-cell dissociation, and transcriptomic library preparation.
- Demands access to advanced imaging, cell viability assessment, and single-cell sequencing infrastructure.
- Necessitates strict cross-team standardization of imaging, dissociation, and analysis parameters for reproducibility.
- Adaptable across different tumor organoid systems with attention to model-specific dissociation and viability challenges.
- Sample quality and cell viability are critical limitations that must be managed throughout processing.
