Summary
マウスの膀胱壁の注入は、同所膀胱の幹細胞と癌の生物学を研究するために有用なアプローチである。この繊細な顕微法は慎重に手法と実践を習得することができます。
Abstract
マウスの膀胱壁の注入は、同所の幹細胞、平滑筋、および癌の生物学を含む膀胱の現象を研究するために便利なテクニックです。注射を開始する前に、外科領域は、石けんと水と消毒液で洗浄する必要があります。手術用機器は使用前に、各動物の間で滅菌する必要があります。各マウスは、吸入イソフルラン麻酔（誘導2-5％、メンテナンス1-3％）とハサミで正中腹部切開を行うことによって露出は膀胱の下に配置されます。膀胱がいっぱいになっている場合、それは2本の指で圧迫穏やかなことで、部分的に減圧される。興味の細胞懸濁液は、intramurally 29または30ゲージの注射針と1ccのまたはより小さいシリンジを使用して膀胱のドームの壁に注入されます。傷は、傷のクリップと温暖化のパッドに回復させたマウスを用いて閉じられます。膀胱壁の注入は、練習で習得することができる繊細な顕微技術です。
Protocol
1。マウスの膀胱壁インジェクション
マウス系統、年齢、および性別の選択は、実験的なニーズによって決定されます。これは老化の前に免疫学的成熟度のウィンドウであるため、我々は、生後8〜12週間の間にマウスを使用してください。一般的なガイドラインとして、マウスはストレス誘発性の交絡因子を避けるために、実験操作の前に少なくとも一週間に到着してください。
- 石鹸と水で手術台の表面を清掃してください。
- 慈徳のワイプまたは消毒ワイプで手術台の表面を拭いてください。
- 手術に使用する前にきれいな手術器具をオートクレーブ。
- さらに、使用直前に熱いビーズ滅菌器で手術器具を殺菌するだけでなく、手術中に動物の間で。
- 最初の使用前と最終的な外科手術の最後に無水アルコールで繰り返し吸引と注射で100μLハミルトンシリンジと29または30ゲージ（1 / 2インチ長い）針を清掃してください。
- それぞれの動物の間でリン酸緩衝生理食塩水、滅菌とハミルトンシリンジを洗浄し、すすいでください。
- 2〜5パーセントの間にイソフルランセットを使用して、イソフルラン誘導チャンバ内にそれらを置くことによってマウスを麻酔。
- 全身麻酔が達成されると、正常な体温を維持するためにウォームなパッドの下で仰臥位での室と場所からマウスを取り外します。
- （適切な麻酔を維持するために、必要に応じて1〜3パーセントから滴定）イソフルラン気化を含むノズルで、動物の鼻を配置することにより、メンテナンスの麻酔を達成する。
- バリカンで腹部の皮膚を剃る。
- 手術中の糞便汚染を防ぐために、肛門をカバーするために使い捨て、滅菌外科用ドレープを使用してください。
- 手術野（下腹部）をカバーする2番目の使い捨て、滅菌外科用ドレープを使用してください。
- Betadineに浸したガーゼの3つの部分で準備腹部。このステップを3回繰り返します。
- 拡大のための解剖顕微鏡を使って、ハサミで下の正中腹部切開を行います。
- 膀胱を公開。
- 膀胱がいっぱいになっている場合、部分的にドームでの穏やかな下方圧力によってそれを解凍。
- 上を向いて針のベベルと膀胱のドーム（壁内注射）の壁に、29または30ゲージの注射針と注射器を用いて、試料溶液を（最大50μL）注入。
- 膀胱壁に試料溶液を注入する注射器のプランジャーを押してください。極めて限局したブレブは、膀胱壁への細胞の正常な注射の指示です。
- 、シリンジを取り外します創傷クリップで切開を閉じて、マウスが温暖化のパッドに回復することができます。
2。代表的な結果：
漏れ流体をしないとサイズで安定したまま極めて限局したブレブは、膀胱壁（図1）への細胞の成功注入の指示です。組織学的分析は、膀胱壁に注入された細胞の存在を確認するために実行することができます。
図1。説明のためにインドのインクを使用して成功した膀胱壁のインジェクションの例。
図2実験手順の模式図。
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Discussion
マウスの膀胱壁の注入は、膀胱壁の定義の領域に特定の細胞の移植が可能になります。この手法は、膀胱癌、平滑筋、および幹細胞生物学のマウスモデルのための広いアプリケーションを持っています。彼らの成長と分化を生理学的に関連する解剖学的文脈で検討することができるように定義することにより、マウスの膀胱壁の注入は、同所場所に膀胱癌や幹細胞の導入を促進する。実際には、Dinneyら。最初はヌードマウス1の同所性ヒト膀胱癌の異種移植片を研究するために、このテクニックを説明した。
膀胱壁の注入法は膀胱癌および幹細胞研究の1-9の番号に利用されていますが、それが使用される唯一の方法ではありません。多くの科学者は、皮下、腹腔内、または静脈注射によってヌードマウスに膀胱癌細胞を移植しようとしましたが、これらのモデルは、予測可能な腫瘍原性と11-13 in vivoでの細胞株での選択を可能に転移特性を示したいない。さらに、腫瘍細胞とマウス14の経尿道的接種に依存している膀胱癌モデルの数があります。腫瘍の広がりは、癌細胞による正常な尿路上皮の"種まき"が発生している膀胱発癌仮説の主要な理論は、他の尿路での尿の流れに流した。このような観点から、膀胱の管腔側から癌細胞への尿路上皮の暴露につながる経尿道的接種は、より生理学的に関連する膀胱壁の注入よりも可能性があります。しかし、経尿道的接種は細胞が膀胱内に自身を埋め込む場所を指示することはできません。
対照的に、膀胱壁の注入による同所性膀胱腫瘍の移植は、一貫して膀胱の壁にある腫瘍を生成することができます。したがって、この方法は、平滑筋と幹細胞生物学3、5、9の研究にも適用できます。
この手法では、針のサイズとシリンジが重要です。我々は、½長いインチ、29と30ゲージの針が膀胱壁の注入に最適であることを見出した。長い針は無駄に接種し、精度の低い注入量に寄与することができるより多くのデッドスペースを持っている。広い針（28ゲージまたはそれ以下）がで注入することは困難であり、かつ容易に注入材料を押し出す大きな針のトラックにつながる。彼らは目的のボリュームの高精度管理を許可するので、我々は、100マイクロリットルハミルトンシリンジを使用してください。さらに、細胞や破片を容易に集約され、注入しながら針の端に凝集。このように、細胞懸濁液を注射器と注射器に吸い込まれていると針を繰り返し、各注射の間の無菌生理食塩水で洗浄してください前に十分に混合されるべきである。我々は最低限、正確な注射量は約10マイクロリットルであることを見出した。より約50マイクロリットルよりもは、注入された組織のサイズが小さいためマウスの膀胱壁に注入することはできません。インドのインクを使用してインジェクションは、それらが適切な技法を使用していることを確認するための初心者でも使用できます。マウスの手続きを経験した個人のための学習曲線は短いです。膀胱壁の注射は、わずか5〜10マウスの後にほぼ100％の成功率で行うことができます。私たちも、マウスマイクロサージェリーに不慣れな作業者のために、非常に高い成功率は10〜15マウス内に達成可能であることを期待しています。インジェクションの故障のマウスは、陰性コントロールとして使用することができます。
結論では、膀胱壁の注入は、膀胱の生物学の研究のための非常に魅力的な選択肢作り、膀胱に定義された位置に細胞のターゲットを絞った配信が発生する可能性があります。それにもかかわらず、この技術は、関連する学習曲線があり、マスターに時間と練習が必要です。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
我々は感謝NIDDKからスタンフォード小児研究基金とK08DK087895 - 01からのパイロット助成金の支援を認める。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane (Aerrane) | Baxter Internationl Inc. | NDC 10019-773-60 | |
| 29 or 30 gauge needles | Hamilton Co | 7803-06 or 7803-07 | |
| 100 microliter syringe | Hamilton Co | 7656-01 |
References
- Dinney, C. P., Fishbeck, R., Singh, R. K., Eve, B., Pathak, S., Brown, N., Xie, B., Fan, D., Bucana, C., Fidler, I. J., Killion, J. J. Isolation and Characterization of Metastatic Variants from Human Transitional Cell Carcinoma Passaged by Orthotopic Implantation in Athymic Nude Mice. The Journal of Urology. 154, 1532-1538 (1995).
- Singh, A. V., Franke, A. A., Blackburn, G. L., Zhou, J. Soy Phytochemicals Prevent Orthotopic Growth and Metastasis of Bladder Cancer in Mice by Alterations of Cancer Cell Proliferation and Apoptosis and Tumor Angiogenesis. Cancer Res. 66, 1851-1858 (2006).
- Yanagiuchi, A., Miyake, H., Nomi, M., Takenaka, A., Fujisawa, M. Modulation of the Microenvironment by Growth Factors Regulates the In Vivo Growth of Skeletal Myoblasts. BJU International. 103, 1569-1573 (2009).
- Miyake, H., Hara, I., Yamanaka, K., Gohji, K., Arakawa, S., Kamidono, S. Overexpression of Bcl-2 Enhances Metastatic Potential of Human Bladder Cancer Cells. British Journal of Cancer. 79, 1651-1656 (1999).
- Chancellor, M. B., Yokoyama, T., Tirney, S., Mattes, C. E., Ozawa, H., Yoshimura, N., Groat, W. C. de, Huard, J. Preliminary Results of Myoblast Injection into the Urethra and Bladder Wall: a Possible method for the Treatment of Stress Urinary Incontinence and Impaired Detrusor Contractility. Neurourol Urodyn. 19, 279-287 (2000).
- Dinney, C. P., Tanguay, S., Bucana, C. D., Eve, B. Y., Fidler, I. J. Intravesical Liposomal Muramyl Tripeptide Phosphatidylethanolamine Treatment of Human Bladder Carcinoma Growing in Nude Mice. J Interferon Cytokine Res. 15, 585-592 (1995).
- Mohamedali, K. A., Kedary, D., Sweeney, P., Kamaty, A., Davisy, D. W., Evey, B. Y., Huangy, S., Thorpez, P. E., Dinney, C. P., Rosenblum, M. G. The Vascular-targeting Fusion toxin VEGF121/rGel Inhibits the Growth of Orthotopic Human Bladder Carcinoma Tumors. Neoplasia. 7, 912-920 (2005).
- Slaton, J. W., Perrotte, P., Inoue, K., Dinney, C. P., Fidler, I. J. Interferon-α-mediated Down-Regulation of Angiogenesis-related Genes and Therapy of Bladder Cancer Are Dependent on Optimization of Biological Dose and Schedule. Clinical Cancer Research. 5, 2726-2734 (1999).
- Yokoyama, T., Huard, J., Pruchnic, R., Yoshimura, N., Qu, Z., Cao, B., De Groat, W. C., Kumon, H., Chancellor, M. B. Muscle-Derived Cell Transplantation and Differentiation into Lower Urinary Tract Smooth Muscle. Urology. 57, 826-831 (2001).
- Chan, E., Patel, A., Heston, W., Larchian, W. Mouse Orthotopic Models for Bladder Cancer Research. BJU International. 104, 1286-1291 (1988).
- Russell, P. J., Jelbart, M., Wills, E., Singh, S., Wass, J., Witherspoon, J., Raghavan, D. Establishment and characterization of a new human bladder cancer cell line showing features of squamous and glandular differentiation. Int. J. Cancer. 41, 74-74 (1988).
- Ahlering, T. E., Dubeau, L., Jones, P. A. A new in vivo model to study invasion and metastasis of human bladder carcinoma. Cancer Res. 41, 6660-6660 (1987).
- Heaney, J. A., Omellas, E. P., Daly, J. J., Lin, J. C., Rout, G. R. In vivo growth of human bladder cancer cell lines. Invest. Urol. 15, 380-380 (1978).
- Hadaschik, B., Black, P., Sea, J., Metwalli, A., Fazli, L., Dinney, C., Gleave, M., So, A. A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumor inoculation and bioluminescence imaging. BJU International. 100, 1377-1384 (2007).
