Summary
마우스 방광 벽 주입은 orthotopically 방광 줄기 세포와 암 생물학을 연구하는 유용한 방법입니다. 이 섬세한 microsurgical 방법은 신중 기술과 연습 마스터하실 수 있습니다.
Abstract
마우스 방광 벽 주입은 orthotopically 줄기 세포, 평활근, 그리고 암 생물학을 포함하여 방광 현상을 연구하기위한 유용한 기술입니다. 주사를 시작하기 전에, 수술 지역은 비누와 물로 및 살균 솔루션을 청소해야합니다. 수술 장비는 사용하기 전에 각각의 동물 사이에 소독해야합니다. 각각의 마우스는 흡입 isoflurane 마취 배치 (유도에 대한 2~5%, 유지 보수 1-3 %)와 방광 가위로 복부 정중선 절개하여 노출됩니다. 방광이 가득있다면, 두 손가락 사이 압박에 의해 부분적으로 부드럽게 풀립니다. 관심의 세포 현탁액은 intramurally 29 또는 30 게이지 바늘 1 CC 또는 작은 주사기를 사용하여 방광의 돔 벽에에 주입합니다. 상처는 상처 후 클립과 온난 패드를 복구하는 허용 마우스를 사용 닫힙니다. 방광 벽 주입은 연습 마스터 수있는 민감한 microsurgical 기법입니다.
Protocol
1. 마우스 블레더 월 주입
마우스 변형, 연령 및 성별의 선택은 실험 요구에 의해 결정됩니다. 이것이 노화하기 전에 면역 성숙의 윈도우이기 때문에 우리는, 나이, 8, 12 주 정도 마우스를 사용합니다. 일반적인 지침으로, 생쥐가 스트레스 유발 혼란함을 주죠 요인을 방지하기 위해 실험 조작하기 전에 적어도 한 주에 도착해야합니다.
- 비누와 물로 수술 테이블 표면을 청소하십시오.
- Cide의 Swipes 또는 살균 잎사귀와 수술 테이블 표면을 닦아주십시오.
- 수술에 사용하기 전에 깨끗한 수술 악기 압력솥.
- 또한, 사용하는 즉시 사전 핫 구슬 살균기와 수술 도구를 소독뿐만 아니라, 수술하는 동안 동물 사이.
- 100 μL 해밀턴 주사기 29 또는 30 게이지 (긴 2분의 1 인치) 처음 사용하기 전에 절대 알코올로 반복 흡인과 주사로하고 최종 수술의 끝에 바늘을 청소하십시오.
- 각 동물 간의 생리 인산염 버퍼 소독과 해밀턴 주사기를 씻고 린스.
- 2~5% 사이 isoflurane 세트와 isoflurane 유도 챔버에서 그들을 배치하여 생쥐를 마취.
- 전신 마취를 얻을되면 정상적인 체온을 유지하기 위해 밑에 따뜻한 패드와 부정사 위치에 챔버와 장소에서 마우스를 제거합니다.
- (적절한 마취를 유지하기 위해 필요한 1~3%에서 titrated) isoflurane 기화가 들어있는 노즐에서 동물의 주둥이를 배치하여 유지 보수 마취를 얻을 수 있습니다.
- 가위로 복부 피부를 면도.
- 수술하는 동안 배설물로 오염을 방지하기 위해 항문을 충당하기 위해 일회용, 살균 외과 드레이프를 사용하십시오.
- 외과 분야 (낮은 복부)를 충당하기 위해 두 번째 일회용, 살균 외과 드레이프를 사용하십시오.
- Betadine - 젖었 거즈 3 가지로 준비 복부. 이 단계를 세 번 반복합니다.
- 확대를위한 해부 현미경을 사용하여 가위로 더 낮은 복부 정중선 절개를합니다.
- 방광을 폭로.
- 방광이 가득 경우, 부분적으로 돔에서 완만한 하향 압력에 의해 그것을 압축 해제.
- 위쪽을 향하고 바늘의 베벨과 방광 돔 (교내 사출)의 벽에, 29 또는 30 게이지 바늘과 주사기를 사용하여 샘플 솔루션을 (최대 50 μL) 주사.
- 방광 벽에 샘플 솔루션을 주입하는 주사기의 플런저를 밀어. 잘화된 물집이 방광 벽에있는 세포의 성공적인 주입의 표시입니다.
- , 주사기를 제거 상처 클립으로 절개를 닫고 마우스가 온난 패드에 복구할 수 있습니다.
2. 대표 결과 :
누출 액을하지 않으며 크기의 안정 유지 잘화된 물집은 방광 벽 (그림 1)에 세포의 성공적인 주입의 표시입니다. Histological 분석은 방광 벽에 주입된 세포의 존재를 확인하기 위해 수행할 수 있습니다.
그림 1. 보여주기위한 인도 잉크를 사용하여 성공적인 방광 벽 주입의 예.
그림 2. 실험 절차의 도식.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
마우스 방광 벽 주입은 방광 벽 정의된 영역에 특정 세포의 주입을 허용합니다. 이 기술은 방광 암, 부드러운 근육, 그리고 줄기 세포 생물학의 마우스 모델에 대한 다양한 응용 프로그램을하고 있습니다. 자신의 성장과 분화가 생리학 관련 해부학 맥락에서 공부를 할 수 있도록 정의함으로써, 마우스 방광 벽 주입은 orthotopic 위치에 방광 암 또는 줄기 세포의 도입을 용이하게합니다. 사실, Dinney 외. 첫 번째는 누드 생쥐 1 orthotopic 인간의 방광 암 xenografts를 공부하기 위해이 기술을 설명했다.
방광 벽 사출 기술이 방광 암, 줄기 세포 연구 1-9의 번호를 이용하고있는 동안, 그것은 사용할 수있는 유일한 방법은 아닙니다. 많은 과학자들은 피하, intraperitoneal, 또는 정맥 주사하여 누드 마우스로 방광 암 세포를 이식하려고 노력하지만, 이러한 모델은 예측 tumorigenicity 및 생체내 세포 라인에 11-13의 선택을 허용 전이성 속성을 전시하지 않았습니다. 또한, 종양 세포 14 생쥐의 transurethral 접종에 의존 방광 암 모델은 여러 가지가있을 수 있습니다. 종양 확산이 암 세포에 의해 정상 urothelium의 "시딩"에 의해 발생하는 방광 carcinogenesis posits의 선도적인 이론은 다른 요로에서에서 비뇨기 스트림에 창고. 이러한 관점에서, 방광의 luminal 측면에서 암세포에 urothelium의 노출 결과 transurethral 접종은 더 생리학 관련성이 높은 방광 벽 주입보다 수 있습니다. 그러나, transurethral 접종은 세포가 방광 내에서 자신을 삽입 위치를 직접 수 없습니다.
반면, 방광 벽 주입에 의해 orthotopic 방광 종양 주입이 지속적으로 방광의 벽을에 위치한 종양을 생성할 수 있습니다. 따라서이 방법은 평활근과 줄기 세포 생물학 3, 5, 9 연구에도 적용할 수 있습니다.
이 기법에서는, 바늘 크기와 주사기가 중요합니다. 우리는 오랫동안 ½ 인치, 29 30 게이지 바늘이 방광 벽에 주입에 가장 적합한 것으로 나타났습니다. 긴 바늘은 낭비 inocula하고 덜 정확한 주입 볼륨에 기여할 수 많은 죽은 공간이 있습니다. 넓은 바늘 (28 게이지 또는 낮은가)를 투입하고, 쉽게 주입 재료를 압출 성형 큰 바늘 자국으로 이어질하기 어렵습니다. 그들이 원하는 볼륨의 고도로 정확한 관리를 허용하기 때문에 100 microliter 해밀턴 주사기를 사용합니다. 또한, 세포 부스러기 쉽게 집계하고 주입하는 동안 바늘의 끝에 clumped. 따라서 세포 현탁액은 주사기와 주사기로 위협하고 그리고 바늘이 반복 각 분사 사이의 살균 정상적인 생리와 청소해야하기 전에 잘 혼합한다. 우리는 최소한의 정확한 주사용 볼륨이 약 10 microliters 것으로 나타났습니다. 없음 50 정도 이상의 microliters는 주입 조직의 작은 크기로 인해 마우스 방광 벽에 주입 수 있습니다. 인도 잉크를 사용하여 사출들은 적절한 기술을 사용하는 데 도움을 확인 초보자 사용할 수 있습니다. 마우스 절차에 경험이 개인에 대한 학습 곡선은 짧습니다. 방광 벽 주사는 50-10 생쥐 이후 거의 100 % 성공 속도로 수행할 수 있습니다. 우리는 심지어 마우스를 미세에 익숙하지 않은 근로자에 대한 매우 높은 성공을 속도가 10-15 생쥐 내에 달성해야한다는 기대. 사출 실패 마우스는 부정적인 컨트롤로 사용할 수 있습니다.
결론적으로, 방광 벽 주입은 방광 생물학 연구를위한 매우 매력적인 옵션을 만들어 방광에 정의된 위치로 세포의 타겟이 분명한 전달이 발생할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고,이 기법은 관련된 학습 곡선을 가지고 있으며, 마스터 시간과 연습이 필요합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 기꺼이 NIDDK에서 스탠포드 소아 연구 기금과 K08DK087895 - 01의 파일럿 부여의 지원을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane (Aerrane) | Baxter Internationl Inc. | NDC 10019-773-60 | |
| 29 or 30 gauge needles | Hamilton Co | 7803-06 or 7803-07 | |
| 100 microliter syringe | Hamilton Co | 7656-01 |
References
- Dinney, C. P., Fishbeck, R., Singh, R. K., Eve, B., Pathak, S., Brown, N., Xie, B., Fan, D., Bucana, C., Fidler, I. J., Killion, J. J. Isolation and Characterization of Metastatic Variants from Human Transitional Cell Carcinoma Passaged by Orthotopic Implantation in Athymic Nude Mice. The Journal of Urology. 154, 1532-1538 (1995).
- Singh, A. V., Franke, A. A., Blackburn, G. L., Zhou, J. Soy Phytochemicals Prevent Orthotopic Growth and Metastasis of Bladder Cancer in Mice by Alterations of Cancer Cell Proliferation and Apoptosis and Tumor Angiogenesis. Cancer Res. 66, 1851-1858 (2006).
- Yanagiuchi, A., Miyake, H., Nomi, M., Takenaka, A., Fujisawa, M. Modulation of the Microenvironment by Growth Factors Regulates the In Vivo Growth of Skeletal Myoblasts. BJU International. 103, 1569-1573 (2009).
- Miyake, H., Hara, I., Yamanaka, K., Gohji, K., Arakawa, S., Kamidono, S. Overexpression of Bcl-2 Enhances Metastatic Potential of Human Bladder Cancer Cells. British Journal of Cancer. 79, 1651-1656 (1999).
- Chancellor, M. B., Yokoyama, T., Tirney, S., Mattes, C. E., Ozawa, H., Yoshimura, N., Groat, W. C. de, Huard, J. Preliminary Results of Myoblast Injection into the Urethra and Bladder Wall: a Possible method for the Treatment of Stress Urinary Incontinence and Impaired Detrusor Contractility. Neurourol Urodyn. 19, 279-287 (2000).
- Dinney, C. P., Tanguay, S., Bucana, C. D., Eve, B. Y., Fidler, I. J. Intravesical Liposomal Muramyl Tripeptide Phosphatidylethanolamine Treatment of Human Bladder Carcinoma Growing in Nude Mice. J Interferon Cytokine Res. 15, 585-592 (1995).
- Mohamedali, K. A., Kedary, D., Sweeney, P., Kamaty, A., Davisy, D. W., Evey, B. Y., Huangy, S., Thorpez, P. E., Dinney, C. P., Rosenblum, M. G. The Vascular-targeting Fusion toxin VEGF121/rGel Inhibits the Growth of Orthotopic Human Bladder Carcinoma Tumors. Neoplasia. 7, 912-920 (2005).
- Slaton, J. W., Perrotte, P., Inoue, K., Dinney, C. P., Fidler, I. J. Interferon-α-mediated Down-Regulation of Angiogenesis-related Genes and Therapy of Bladder Cancer Are Dependent on Optimization of Biological Dose and Schedule. Clinical Cancer Research. 5, 2726-2734 (1999).
- Yokoyama, T., Huard, J., Pruchnic, R., Yoshimura, N., Qu, Z., Cao, B., De Groat, W. C., Kumon, H., Chancellor, M. B. Muscle-Derived Cell Transplantation and Differentiation into Lower Urinary Tract Smooth Muscle. Urology. 57, 826-831 (2001).
- Chan, E., Patel, A., Heston, W., Larchian, W. Mouse Orthotopic Models for Bladder Cancer Research. BJU International. 104, 1286-1291 (1988).
- Russell, P. J., Jelbart, M., Wills, E., Singh, S., Wass, J., Witherspoon, J., Raghavan, D. Establishment and characterization of a new human bladder cancer cell line showing features of squamous and glandular differentiation. Int. J. Cancer. 41, 74-74 (1988).
- Ahlering, T. E., Dubeau, L., Jones, P. A. A new in vivo model to study invasion and metastasis of human bladder carcinoma. Cancer Res. 41, 6660-6660 (1987).
- Heaney, J. A., Omellas, E. P., Daly, J. J., Lin, J. C., Rout, G. R. In vivo growth of human bladder cancer cell lines. Invest. Urol. 15, 380-380 (1978).
- Hadaschik, B., Black, P., Sea, J., Metwalli, A., Fazli, L., Dinney, C., Gleave, M., So, A. A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumor inoculation and bioluminescence imaging. BJU International. 100, 1377-1384 (2007).
