Summary
Rato injeção parede da bexiga é uma abordagem útil para estudo de células da bexiga ortotopicamente-tronco e biologia do câncer. Este método de microcirurgia delicada pode ser dominada com técnica cuidadosa e prática.
Abstract
Rato injeção parede da bexiga é uma técnica útil para estudar fenômenos ortotopicamente bexiga, incluindo células-tronco, o músculo liso, e biologia do câncer. Antes de iniciar as injeções, a área cirúrgica deve ser limpa com água e sabão e solução anti-séptica. Equipamentos cirúrgicos devem ser esterilizadas antes do uso e entre cada animal. Cada rato é colocado sob anestesia isoflurano inalado (2-5% para a indução, 1-3% para manutenção) e sua bexiga exposta, fazendo uma incisão mediana abdominal com uma tesoura. Se a bexiga está cheia, é parcialmente descompactado pelo gentil espremendo entre dois dedos. A suspensão de células de interesse é intramurally injetado na parede da cúpula da bexiga usando uma agulha de calibre 29 ou 30 e 1 cc ou menor seringa. A ferida é então fechada com grampos de sutura eo mouse permitiu recuperar em uma almofada de aquecimento. Injeção de parede da bexiga é uma técnica de microcirurgia delicada que pode ser dominada com a prática.
Protocol
1. Injeção do mouse parede da bexiga
Escolha da tensão do mouse, idade e sexo é ditada por necessidades experimental. Nós usamos ratos entre 8 e 12 semanas de idade, uma vez que esta é uma janela de maturidade imunológica antes de senescência. Como orientação geral, os ratos devem chegar pelo menos uma semana antes da manipulação experimental, a fim de evitar o stress induzido por fatores de confusão.
- Limpe a superfície da mesa cirúrgica com água e sabão.
- Limpe a superfície da mesa cirúrgica com Swipes Cide ou toalhetes anti-séptico.
- Autoclave instrumentos cirúrgicos limpos antes da sua utilização na cirurgia.
- Além disso, esterilizar instrumentos cirúrgicos com esterilizador talão quente imediatamente antes do uso, bem como entre os animais durante a cirurgia.
- 100 seringas limpas mL Hamilton e 29 ou 30 gauge (1 / 2 polegada de comprimento) agulhas por aspiração repetida e injeção com álcool absoluto antes da primeira utilização e, ao final do procedimento cirúrgico definitivo.
- Lave e enxágüe com seringas esterilizadas Hamilton tampão fosfato entre cada animal.
- Anestesiar ratos, colocando-os em uma câmara de indução isoflurano, com o conjunto de isoflurano entre 2-5%.
- Uma vez que a anestesia geral é alcançado, retire o rato da câmara e coloque na posição supina com uma almofada debaixo quente para ajudar a manter a temperatura corporal normal.
- Obter anestesia de manutenção, colocando o focinho do animal em um bocal contendo vaporizar isoflurano (titulado de 1-3%, conforme necessário para manter a anestesia apropriado).
- Raspar a pele abdominal com clippers.
- Use um descartáveis, cortina cirúrgica estéril para cobrir o ânus para evitar a contaminação fecal durante a cirurgia.
- Use um segundo descartáveis, cortina cirúrgica estéril para cobrir o campo cirúrgico (abdome inferior).
- Prep abdômen com três pedaços de Betadine-gaze. Repita este passo três vezes.
- Usando um microscópio de dissecação para ampliação, faça uma menor incisão mediana abdominal com uma tesoura.
- Expor a bexiga.
- Se a bexiga está cheia, descompactá-lo parcialmente por uma pressão descendente suave na cúpula.
- Injetar a solução de amostra (até 50 mL), usando uma agulha de calibre 29 ou 30 e seringa, na parede da cúpula da bexiga (injeção intramural), com o bisel da agulha voltado para cima.
- Empurre o êmbolo da seringa para injetar a solução de amostra na parede da bexiga. A bolha bem localizada é uma indicação do sucesso de injeção das células na parede da bexiga.
- Retire a seringa, fechar a incisão com grampos de sutura e permitir que o mouse para se recuperar em uma almofada de aquecimento.
2. Resultados representativos:
A bolha bem localizada que não líquido de vazamento e permanece estável em tamanho é uma indicação do sucesso de injeção das células na parede da bexiga (Figura 1). Análise histológica pode ser realizada para confirmar a presença das células injetadas na parede da bexiga.
Figura 1. Exemplo de injeção de sucesso da parede da bexiga usando tinta nanquim para ilustração.
Figura 2. Esquemática de procedimentos experimentais.
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Discussion
Rato injeção parede da bexiga permite a implantação de células específicas em áreas definidas da parede da bexiga. Esta técnica tem amplas aplicações para os modelos do rato do cancro da bexiga, o músculo liso, e biologia das células estaminais. Por definição, mouse injeção de parede da bexiga facilita a introdução de câncer de bexiga ou de células-tronco em um local ortotópico assim que o seu crescimento e diferenciação pode ser estudado em um contexto fisiologicamente relevantes anatômicas. Na verdade, Dinney et al. descrita pela primeira vez esta técnica para estudar o câncer humano ortotópico xenoenxertos bexiga em ratos nus 1.
Enquanto a técnica de injeção de parede da bexiga tem sido utilizada em um número de câncer de bexiga e estudos com células-tronco 1-9, não é o único método utilizado. Muitos cientistas têm tentado implantar células de câncer de bexiga em ratos nus por via subcutânea, intraperitoneal ou injeção intravenosa, mas esses modelos não apresentam tumorigenicidade previsível e propriedades metastático que permitir a seleção de linhagens de células in vivo em 11-13. Além disso, há uma série de modelos de cancro da bexiga, que contam com a inoculação transuretral de camundongos com células tumorais 14. A teoria postula líder de carcinogênese da bexiga que se espalham tumor ocorre por "semeadura" do urotélio normal por células cancerosas derramado no córrego urinário de outras partes do trato urinário. A partir desta perspectiva, a inoculação transuretral, o que resulta na exposição do urotélio às células cancerosas do lado luminal da bexiga, pode ser mais relevante do que fisiologicamente injeção parede da bexiga. No entanto, a inoculação transuretral não pode direcionar onde as células irá implantar-se dentro da bexiga.
Em contraste, a implantação do tumor de bexiga ortotópica por injeção parede da bexiga pode produzir consistentemente tumores localizados na parede da bexiga. Assim, este método também pode ser aplicado em estudos de músculo liso e biologia de células-tronco 3, 5, 9.
Nesta técnica, o tamanho da agulha e seringa são críticos. Descobrimos que ½ polegada de comprimento, 29 e 30 agulhas são os melhores para injeção de parede da bexiga. Agulhas já não têm mais espaço morto que pode contribuir para inóculos desperdiçado e volumes de injeção menos precisos. Agulhas mais amplo (28 gauge ou inferior) são difíceis de injectar, e levar a agulha grandes faixas que facilmente extrude material injetado. Usamos 100 seringas microlitro Hamilton porque permitem administração altamente precisas de volumes desejados. Além disso, as células e os resíduos são facilmente agregados e agregada no final da agulha durante a injecção. Assim, a suspensão celular deve ser bem misturada antes de ser arrastado para seringa e da seringa e agulha deve ser repetidamente lavados com soro fisiológico estéril entre cada injeção. Descobrimos que o mínimo, o volume exato injetável é de aproximadamente 10 microlitros. Não mais do que cerca de 50 microlitros pode ser injetado na parede da bexiga de rato, devido ao pequeno tamanho do tecido injetado. Injeção usando tinta da Índia pode ser usado por novatos para ajudar a confirmar que eles estão usando a técnica adequada. A curva de aprendizagem para pessoas experientes com os procedimentos do mouse é curto. Injeções parede da bexiga pode ser realizada com quase 100% as taxas de sucesso depois de apenas ratos 5-10. Prevemos que até mesmo para os trabalhadores não estão familiarizados com microcirurgia do mouse, as taxas de sucesso muito alta devem ser alcançáveis dentro de 10-15 camundongos. Camundongos falha de injeção pode ser usado como controles negativos.
Em conclusão, a injeção de parede da bexiga pode resultar na entrega altamente segmentados de células para os locais definidos na bexiga, tornando-o uma opção altamente atrativa para os estudos da biologia da bexiga. No entanto, esta técnica tem uma curva de aprendizagem associadas e requer tempo e prática para dominar.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Agradecemos o apoio de uma bolsa-piloto do Fundo de Investigação Stanford Pediátrica e K08DK087895-01 do NIDDK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane (Aerrane) | Baxter Internationl Inc. | NDC 10019-773-60 | |
| 29 or 30 gauge needles | Hamilton Co | 7803-06 or 7803-07 | |
| 100 microliter syringe | Hamilton Co | 7656-01 |
References
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