Summary
De biarsenical kleurstoffen Flash en ReAsH binden specifiek aan tetracysteine motieven in eiwitten en kan selectief label eiwitten in levende cellen. Onlangs is dit de etikettering strategie is gebruikt om sensoren voor verschillende eiwitten conformaties of oligomere staten te ontwikkelen. Beschrijven we de etikettering van aanpak en methoden om kwantitatief te analyseren bindend.
Abstract
Fluorescerende eiwitten en kleurstoffen zijn essentiële hulpmiddelen voor de studie van proteïne mensenhandel, lokalisatie en functie in cellen. Terwijl fluorescerende eiwitten zoals groene fluorescentie eiwit (GFP) zijn uitgebreid gebruikt als fusiepartners om eiwitten aan de eigenschappen van een eiwit van belang een, recente ontwikkelingen track met kleinere labels in staat stellen nieuwe functionaliteiten van eiwitten worden onderzocht in cellen, zoals conformationele verandering en eiwit-vereniging 2, 3. Een kleine tag-systeem omvat een tetracysteine motief (CCXXCC) genetisch ingebracht in een doelwit eiwit, dat bindt aan biarsenical kleurstoffen, ReAsH (rood fluorescerend) en Flash (green fluorescent), met een hoge specificiteit, zelfs in levende cellen 2. De TC / biarsenical dye-systeem biedt veel minder sterische beperkingen op de host eiwit dan fluorescerende eiwitten die in staat heeft gesteld een aantal nieuwe benaderingen van conformationele verandering en eiwit-eiwit interacties 4-7 te meten. We hebben onlangs een nieuwe toepassing van TC tags als sensoren van oligomerisatie in cellen die mutant huntingtine, die, wanneer gemuteerd aggregaten in neuronen in de ziekte van Huntington 7. Huntingtine werd getagd met twee fluorescente kleurstoffen, een een fluorescerend eiwit bewerkt om locatie volgen, en de tweede een TC-tag die alleen biarsenical kleurstoffen bindt in monomeren. Vandaar dat veranderingen in de colocalization tussen eiwit en biarsenical kleurstof reactiviteit ingeschakeld submicroscopische oligomeer inhoud ruimtelijk in kaart worden gebracht in de cellen. Hier beschrijven we hoe de TC-gemerkte eiwitten gefuseerd met een fluorescerend eiwit (Cherry, GFP of GVB) met Flash of ReAsH in levende zoogdiercellen en hoe je de twee kleuren fluorescentie (Cherry / Flash, GVB / Flash of GFP / kwantificeren label ReAsH combinaties).
Protocol
1. De voorbereiding van cellen voor het labelen met ReAsH / Flash
- Met behulp van standaard celcultuurmethoden voor uw cellijn van belang zijn, voor te bereiden van een cultuur van hechtende cellen direct in een live-cell imaging slide klaar voor transfectie.
- Transfecteren uw plasmide dat TC-gelabeld gen van belang op basis van uw transfectie methode van keuze.
Nota is het belangrijk om positieve en negatieve controles te gebruiken om de mate van specifieke binding te beoordelen aan de TC tags en te beoordelen voor de bleedthrough van fluorescentie tussen de kanalen bij het verzamelen van confocale microfoto. Vandaar dat voor de twee kleuren (bijv. Flash / Cherry of ReAsH / GVB of ReAsH / GFP-combinaties), zorgen voor monsters worden voorbereid op een kleur (bijvoorbeeld TL-eiwit alleen of indien mogelijk een TC-gelabeld eiwit gebonden aan Flash / ReAsH, maar met geen fluorescerende eiwit)
- Een tot twee dagen na transfectie, voorzichtig spoelen van de cellen met 300 pi voorverwarmde (bij 37 ° C) HBSS.
- Voorzichtig onderdompelen van de cellen met 1 uM Flash (of ReAsH) in 300 pi van de voorverwarmde HBSS en 10 uM 1,2-ethanedithiol (EDT).
Het is belangrijk om eerst toe te voegen EDT voor het toevoegen van Flash / ReAsH en de buffer te maken net voor de toe te voegen aan de cellen. Incubeer gedurende precies 30 min bij 37 ° C in weefselkweek incubator. In onze ervaring langere incubatietijd aanzienlijk verhoogt de achtergrond fluorescentie. Nieuwe constructen moet ook worden geoptimaliseerd voor het labelen van tijd en Flash / ReAsH concentratie (0,5-2 uM).
- Zuig voorzichtig etikettering oplossing van cellen en vervolgens te vervangen door 300 ul voorverwarmde HBSS + 250 uM 2,3-dimercaptopropanol (BAL) gedurende 15 minuten bij 37 ° C.
- Verwijder de wasoplossing door behoedzame aspiratie en met 300 ul voorverwarmde HBSS te vervangen.
Na deze wasbeurt, kunnen de cellen worden vastgesteld met paraformaldehyde (15 min met 3,2%-oplossing), maar we hebben gemerkt dat deze niet-specifieke biarsenical kleurstof fluorescentie toeneemt. Vandaar dat we meestal het imago van de cellen wonen bij kamertemperatuur. (Merk op dat fixatie van cellen voor de etikettering voorkomt biarsenical kleurstof bindend.)
2. Beeldvorming van de cellen op een confocale microscoop
- Op de confocale microscoop, parameters instellen voor de beeldvorming van de individuele fluoroforen (zie tabel 1) en ervoor te zorgen dat er is te verwaarlozen bleedthrough tussen de kanalen. Dit kan worden bereikt door het controleren van de individuele fluoroforen (in control monsters) tegen elkaar verschillende fluorescerende overname instelling voor fluorescentie. Instellen van de emissie golflengte kan helpen om bleedthrough minimaliseren (hoewel dit ook kan de signaal / ruis te verminderen).
- Ook aanpassen van de fotomultiplicator instellingen, zodat de maximale fluorescentie in de steekproef niet de detector te verzadigen. (Dit kan worden gedetecteerd met behulp van de Q-LUT omgeving op de SP2 Leica confocale). Zodra de beste imaging-instellingen worden bepaald, niet veranderen een van hen tussen de monsters.
- Andere instellingen die we gebruiken meestal (hoewel deze kan worden geoptimaliseerd) zijn een scansnelheid van 200 Hz en het verzamelen van 4 lijn gemiddelden en een pinhole diameter van een Airy-eenheid. De pinhole diameter kan worden uitgebreid als signaal / ruis is een probleem, maar dit kan resulteren in een verlies van beeldvorming.
- Verzamel de confocale beelden in 12-bit (of hoger) formaat indien mogelijk. 12-bit formaat vangt een groter dynamisch bereik van de waarden (0-4.095) voor elke pixel de intensiteit dan de 8-bit (0-255). Dit is belangrijk voor het waarborgen van de rijkste dataset is opgenomen, dat maximaliseert de kwaliteit van de kwantitatieve data-analyse.
- Verzamel beelden voor het fluorescerende eiwit kanaal (Cherry, GFP of GVB) en ook voor de biarsenical kleurstof kanaal (Flash of ReAsH) voor alle monsters.
3. Analyse van de gegevens
- Installeer de software ImageJ op uw computer 8. http://rsbweb.nih.gov/ij/
- Zorg ervoor dat uw versie van ImageJ de volgende plugins:
- Open ImageJ, en als het gebruik van een versie ouder dan v1.32c, klikt u op de volgende opties om meerdere beelden worden geopend in een keer (die kan worden gedaan door de control-toets ingedrukt terwijl u klikt op de verschillende files):
- Open de beelden van belang in ImageJ.
ImageJ zal automatisch bepalen van de maximale en minimale pixel intensiteiten die worden weergegeven op het scherm voor elk beeld afzonderlijk. Gezien het feit dat verschillende beelden zullen d hebbenAllerlei mensen pixel intensiteiten, betekent dit dat de weergegeven beelden zijn niet te vergelijken zoals ze worden weergegeven. - Om ervoor te zorgen dat de geopende afbeeldingen zijn allemaal op dezelfde schaal, dan kunt u fysiek definiëren de bovenste en onderste pixel intensiteiten worden bekeken (dit zal niet veranderen de feitelijke gegevens de inhoud van de beelden zoals het geval in sommige andere software). Deze waarden kunnen worden ingesteld onder de volgende menu:
- Een alternatieve benadering is om te werken met stapels, die alle beelden brengt samen in een bestand en wordt automatisch schaal (voor het bekijken van) alle beelden in de stapel op dezelfde schaal. De eenvoudigste manier om te werken met de gegevens om te zetten elk kanaal om een stack. Zo is voor het fluorescerende eiwit kanaal allemaal bekeerd zijn tot stack zoals afgebeeld. U kunt een kanaal eenvoudig selecteren door het stapelen van alle afbeeldingen met een gewone naam (bv "ch00") in de titel.
- Nu zetten alle geopende afbeeldingen naar 8-bits voor analyse. Dit ook daadwerkelijk het herschalen bekeken serie in een 0-255 range (die definieert 8-bit).
BELANGRIJK: niet opslaan opzichte van de originele 12-bit (of hoger) formaat of je zal informatie-inhoud te verliezen. Merk op dat sommige software pakketten alleen 8-bits beelden weer te geven, zodat dit formaat is handig voor het maken van figuren, etc.
- Een kopie opslaan in een nieuwe map genaamd "8-bit omgezet" met behulp van het "Opslaan als ..." optie.
- Een methode om de mate van biarsenical kleurstof verbindend in al een hele beeld te onderzoeken is het uitvoeren van een pixel intensiteit correlatie plot. Deze percelen elke pixel waarde in een kanaal ten opzichte van de overeenkomstige pixelwaarde in een tweede kanaal. Vandaar dat een pixel positie hoog in het GVB fluorescentie zal ook hoog in ReAsH fluorescentie als er sprake is hoog bindend.
- Voor het analyseren van de pixel co-correlatie, zorg ervoor dat de 8-bit ReAsH en Cerulean / GFP beelden geopend in ImageJ.
- Open de "Image Correlator" plugin zoals hieronder aangegeven. Selecteer "Image1" als de ReAsH of Flash-stack en "Image2" als het fluorescerende eiwit stack.
- De resulterende stapel kan geeft geen gedetailleerde informatie - dit is normaal. Sla de stapel in een nieuwe map genaamd "scatterplots" en geef het dezelfde bestandsnaam als het monster het verwijst naar (bijvoorbeeld "Flash-cherry correlatie plot")
- Om de gegevens zinvol kun je een van de twee opties. Eerst transformeren van de data, zodat deze in log-formaat. Dan visueel herschalen van de gegevens als volgt:
- U kunt ook visueel herschalen de gegevens zodat alleen lage waarden (bijv. 1-255) en de gegevens met behulp van een speciale LUT weer te geven. Een LUT (Look Up Table) is een tabel van de kleuren die voor elke pixel waarde die wordt toegekend in een beeld . Dit kan gebruikt worden om een pseudokleur regeling voor een afbeelding te definiëren en is nuttig voor het definiëren van bepaalde functies in een afbeelding. Om een aangepaste LUT klik op "LUT-editor" te creëren en maken een nieuwe, zoals de een weergegeven (dit kan worden opgeslagen en later gebruikt).
- De helderheid / contrast range 0-255 (zoals beschreven in stap 13 hierboven). Om "lock in" het beeld zoals dat op het scherm getoond, kan het beeld worden omgezet naar RGB formaat dat een 8-bit waarde voor elk van de rode, groene en blauwe kleur van elke pixel bespaart.
Te kopiëren en te plakken beelden naar andere programma's open je eerst de 8-bit of 16-bits afbeeldingen. Zoals beschreven in stap 14 hierboven, wijst u een LUT kleurenschema op de afbeelding. Voor het GVB, wijs de "Turquoise" LUT zoals hieronder beschreven ...
- Selecteer de afbeelding en te kopiëren naar het klembord, kies ...
4. Representatieve resultaten:
Het succes van etikettering cellen met biarsenical kleurstoffen is afhankelijk van een paar belangrijke parameters. Ten eerste de timing van de etikettering met kleurstoffen is cruciaal. We hebben ontdekt dat lange periodes van etikettering (meer dan 30 min) resulteert in een hoge mate van niet-specifieke achtergrond kleuring. Fig. 1 toont een typisch resultaat voor een wild-type vorm van huntingtin fragment (25Q) gefuseerd aan het GVB afgeleide Cerulean met een TC-tag zoals eerder is beschreven 7. Dit monster werd gekleurd voor 30 min met ReAsH en er is een minimale achtergrond in het monster zonder de TC tag. We hebben gemerkt dat de vaststelling van cellen met paraformaldehyde verhoogt achtergrond terwijl bevestiging met methanol de fluorescentie van het fluorescerende eiwit tag heft. Vandaar dat we waar mogelijk het imago van de cellen te wonen. Het is belangrijk om ook vooraf rekening mee dat fixatiede etikettering met biarsenical kleurstoffen verhindert hun binding, waarschijnlijk als gevolg van wijzigingen van de TC motief.
Een andere kritische factor voor consistente resultaten is de dichtheid van de cellen. We hebben gemerkt dat het cruciaal om de afbeelding cellen die los worden verspreid en ook dat uitgebreide klonteren kan leiden tot ongelijke kleuring van de biarsenical kleurstoffen in verschillende cellen.
Figuur 1. Tetracysteine tags en ReAsH kleuring in levende cellen getransfecteerd met huntingtin (exon1-25Q)-Cerulean fusies. De TC tag is gelegen op het kruispunt van de huntingtin-Cerulean fusie (zoals beschreven in 7). De pixel intensiteit correlatie plot maakt een evaluatie van verschillen in ReAsH binding in de cel en kan gebruikt worden om veranderingen in de ReAsH binding als gevolg van conformationele verandering of ligand interacties kaart.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De aanpak van label eiwit lokalisatie met een fluorescerend eiwit en conformationele eigenschappen met een tweede kleurstof biedt veel mogelijkheden voor in kaart brengen van waar verschillende conformaties van eiwitten opbouwen in cellen en evenementen die de dynamiek van eiwit conformatie te veranderen. ReAsH / Flash werd voor het eerst gebruikt als een in-cel-sensor voor het vouwen van eiwitten van de zoogdieren cellulaire retinoïnezuur-bindend eiwit I 4. In dit voorbeeld is de FLASH gebonden aan een TC tag ontworpen in cellulair retinoïnezuur-bindend eiwit had ik fluorescentie opbrengst verlaagd in de gevouwen vorm ten opzichte van de uitgevouwen vorm, en de vouwen kunnen worden bijgehouden in E. coli-cellen. Meer recent eiwitvouwing en zelf-associatie werd aangetoond in het model van eiwitten door bipartiete tetracysteine weer te geven 6. In dit voorbeeld werden distale dicysteine paren van het model peptides gebracht dicht bij de binding van twee peptiden die dicysteine paren, of door het vouwen van een peptide dat reconstitutes een functionele tetracysteine motief voor de binding biarsenical kleurstoffen. We hebben deze benadering een stap verder door het ontwikkelen van sensoren die monomeren onderscheiden van oligomeren als gevolg van de TC-tag worden afgesloten van biarsenical kleurstof bindend in alle oligomere vormen 7.
Ondanks het potentieel van TC tags en biarsenical kleurstoffen als reporters voor conformationele veranderingen en van vereniging, de methodologie lijdt aan het hebben van een relatief lage signaal / ruis-signaal in vergelijking met fluorescerende eiwitten als gevolg van de baseline achtergrond fluorescentie 9. Vandaar dat bij de inspanningen om bouw-sensoren te ontwikkelen zou de moeite waard om enkele van de andere nieuwere etikettering benaderingen worden ontwikkeld, zoals een aangelegde fluorofoor ligase systeem dat coumarinederivaten conjugaten om een 13 aminozuur peptide sequentie 3 te testen.
De hier gepresenteerde analyse kan verder worden uitgebreid om na te gaan waar in de cellen verschillen optreden in de binding van ReAsH / knipperen om het eiwit van belang. Om dit te doen, kunnen de beelden worden verdeeld in subregio's door het creëren van regio's of interest (ROI) en ze te converteren naar maskers om de verschillende delen van het beeld (dit kan allemaal worden gedaan in ImageJ) filter. Vandaar dat, door vergelijking van de pixel intensiteit percelen moet het mogelijk zijn om statistisch te evalueren verschillen tussen de intracellulaire subregio's met behulp van de sensoren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door subsidies aan DMH en TDM (NHMRC projectsubsidies). DMH is een Grimwade Fellow, gefinancierd door de Miegunyah Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-well μ-slides | Ibidi | 80826 | We find these chamber slides to be particularly useful for culturing cells for imaging. |
| TC-FlAsH II In-cell Tetracysteine Tag Detection Kit *green fluorescence* *for live-cell imaging | Invitrogen | T34561 (FlAsH) or T34562 (ReAsH) | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14175-103 | |
| 2,3-Dimercapto-1-propanol | Sigma-Aldrich | D1129-5ML | |
| 1,2-Ethanedithiol | Sigma-Aldrich | 02390-25ML |
References
- Tsien, R. Y.
- Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281, 269-2672 (1998).
- Uttamapinant, C. A fluorophore ligase for site-specific protein labeling inside living cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 10914-10919 (2010).
- Ignatova, Z., Gierasch, L. M. Monitoring protein stability and aggregation in vivo by real-time fluorescent labeling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 523-528 (2004).
- Coleman, B. M. Conformational detection of prion protein with biarsenical labeling and FlAsH fluorescence. Biochem. Biophys. Res. Commun. 380, 564-568 (2009).
- Luedtke, N. W., Dexter, R. J., Fried, D. B., Schepartz, A. Surveying polypeptide and protein domain conformation and association with FlASH and ReAsH. Nat. Chem. Biol. 3, 779-784 (2007).
- Ramdzan, Y. M. Conformation sensors that distinguish monomeric proteins from oligomers in live cells. Chem. Biol. 17, 371-379 (2010).
- Abramoff, M. agelhaes, PJ, S. J. R. am
- Hearps, A. The biarsenical dye Lumio exhibits a reduced ability to specifically detect tetracysteine-containing proteins within live cells. J. Fluor. 17, 593-597 (2007).
- Adams, S. R. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications. J. Am. Chem. Soc. 124, 6063-6076 (2002).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Meth. 2, 905-909 (2005).
