El biarsenical FlAsH tintes y ReAsH se unen específicamente a los motivos tetracysteine en proteínas y selectiva puede etiquetar las proteínas en células vivas. Recientemente, esta estrategia de etiquetado se ha utilizado para desarrollar sensores para diferentes conformaciones de las proteínas o los estados oligoméricos. Se describe el mecanismo de etiquetado y métodos para analizar cuantitativamente vinculante.
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Artículo de método
ReAsH / Flash etiquetado y análisis de imágenes de las proteínas en las células del sensor Tetracysteine
En este artículo
Resumen
Resumen
Las proteínas fluorescentes y tintes son herramientas esenciales para el estudio de proteínas tráfico, localización y función en las células. Mientras que las proteínas fluorescentes como la proteína verde fluorescente (GFP) han sido ampliamente utilizados como socios de la fusión de las proteínas para hacer un seguimiento de las propiedades de una proteína de interés 1, los acontecimientos recientes más pequeñas etiquetas permiten nuevas funcionalidades de las proteínas que se examinarán en las células, como el cambio conformacional y proteínas de asociación 2, 3. Un sistema de etiqueta pequeña implica un motivo tetracysteine (CCXXCC) genéticamente insertado en una proteína diana, que se une a colorantes biarsenical, ReAsH (fluorescente de color rojo) y Flash (de color verde fluorescente), con una alta especificidad, incluso en las células vivas 2. El sistema de TC / biarsenical tinte ofrece mucho menos restricciones estéricas de la proteína de acogida de proteínas fluorescentes que ha permitido a varios nuevos métodos para medir el cambio en la conformación y las interacciones proteína-7.4. Recientemente hemos desarrollado una nueva aplicación de etiquetas de TC como sensores de oligomerización en células que expresan huntingtina mutante, que cuando mutan agregados en las neuronas en la enfermedad de Huntington 7. Huntingtina fue etiquetado con dos tintes fluorescentes, una una proteína fluorescente para seguir la localización de proteínas, y la segunda, una etiqueta de TC, que sólo vincula a los tintes biarsenical en monómeros. Por lo tanto, los cambios en la colocalización entre la proteína y la reactividad tinte biarsenical contenido habilitado oligómero submicroscópicas que se asigna espacio dentro de las células. Aquí se describe cómo etiquetar TC-etiquetados proteínas fusionadas a una proteína fluorescente (Cherry, las buenas prácticas agrarias o PPC) con flash o ReAsH en vivo las células de mamíferos y la forma de cuantificar la fluorescencia de dos colores (cereza / Flash, PPC / Flash o GFP / ReAsH combinaciones).
Protocolo
1. Preparación de las células para el etiquetado con ReAsH / Flash
- Utilizando los métodos estándar de cultivo celular para la línea celular de interés, preparar un cultivo de células adheridas directamente en una diapositiva de células imágenes en vivo listo para la transfección.
- Transfectar el plásmido que contenía TC-etiquetado de genes de interés en función de su método de transfección de la elección.
Tenga en cuenta que es importante la utilización de controles positivos y negativos para evaluar el grado de unión específica a las etiquetas de TC y evaluar de forma bleedthrough de fluorescencia entre los cana....
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Discusión
El enfoque de la localización de la etiqueta de proteínas con una proteína fluorescente y propiedades conformacionales con un tinte segunda ofrece un gran potencial para el mapeo en diferentes conformaciones de las proteínas se acumulan en las células y los eventos que cambian la dinámica de la conformación de la proteína. ReAsH / Flash se utilizó por primera vez como un sensor en el celular de plegamiento de las proteínas celulares de los mamíferos del ácido retinoico-proteína de unión I 4. En este ejemplo, .......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por becas de DMH y TDM (NHMRC subvenciones para proyectos). DMH es un compañero Grimwade, financiado por la Fundación Miegunyah.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
| 8 y μ-diapositivas | Ibidi | 80826 | Consideramos que estos cámara de diapositivas para ser especialmente útil para el cultivo de células para la imagen. |
| TC-Flash II en las células de detección de etiqueta Tetracysteine Kit * * * fluorescencia verde de células vivas imágenes | Invitrogen | T34561 (flash) o T34562 (ReAsH) | |
| Solución salina equilibrada de Hanks | Invitrogen | 14175-103 | |
| 2,3-dimercapto-1-propanol | Sigma-Aldrich | D1129-5ML | |
| 1,2-etanoditiol | Sigma-Aldrich | 02390-25ML |
Referencias
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Ann. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281, 269-2672 (1998).
- Uttamapinant, C.
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Reimpresiones y permisos
Etiquetas
Etiquetado con tetraciste namarcaje con colorante biarsenicalimagen con FlAsH y ReAsHan lisis por microscop a confocalcuantificaci n con Image Jdetecci n de oligomerizaci n de prote nasimagen de c lulas vivasfusi n de prote nas fluorescentesespecificidad de la etiqueta TCmodelo de la enfermedad de Huntington
