Summary
Il biarsenical coloranti Flash e ReAsH legano specificamente ai motivi tetracysteine di proteine e in modo selettivo le proteine etichetta in cellule vive. Recentemente questa strategia di etichettatura è stato utilizzato per sviluppare sensori per le diverse conformazioni delle proteine o stati oligomerici. Abbiamo descritto l'approccio di etichettatura e di metodi per analizzare quantitativamente vincolanti.
Abstract
Proteine fluorescenti e coloranti sono strumenti essenziali per lo studio del traffico di proteine, la localizzazione e la funzione delle cellule. Mentre le proteine fluorescenti come il verde proteina fluorescente (GFP) sono stati ampiamente utilizzati come partner di fusione di proteine per monitorare le proprietà di una proteina di interesse 1, i recenti sviluppi con piccole etichette consentono nuove funzionalità di proteine da esaminare nelle cellule, come il cambiamento conformazionale e proteine-associazione 2, 3. Un sistema di tag piccola comporta un motivo tetracysteine (ccxxcc) geneticamente inserito in una proteina bersaglio, che si lega ai coloranti biarsenical, ReAsH (rosso fluorescente) e Flash (verde fluorescente), con elevata specificità anche nelle cellule vive 2. Il TC / biarsenical sistema colorante offre vincoli molto meno sterico alla proteina ospite di proteine fluorescenti che ha permesso a numerosi nuovi approcci per misurare il cambiamento conformazionale e interazioni proteina-proteina 4-7. Abbiamo recentemente sviluppato una nuova applicazione di tag TC come sensori di oligomerizzazione nelle cellule che esprimono huntingtina mutata, che se mutato aggregati nei neuroni a Huntington malattia 7. Huntingtina era taggati con due coloranti fluorescenti, una una proteina fluorescente per tenere traccia posizione di proteine, e la seconda un tag TC che lega solo coloranti biarsenical in monomeri. Quindi, i cambiamenti colocalizzazione tra proteine e biarsenical reattività colorante abilitato contenuto submicroscopiche oligomero di essere mappate spazialmente all'interno delle cellule. Qui, descriviamo come etichettare TC-tagged proteine fuse ad una proteina fluorescente (Cherry, GFP o CFP) con il flash o ReAsH in vivo le cellule di mammifero e come quantificare i due fluorescenza di colore (ciliegio / Flash, CFP / Flash o GFP / combinazioni ReAsH).
Protocol
1. Preparazione delle cellule per l'etichettatura con ReAsH / Flash
- Usando metodi standard di coltura cellulare per la linea cellulare di interesse, preparare una coltura di cellule aderenti direttamente in una diapositiva dal vivo imaging cellulare pronto per la trasfezione.
- Trasfezione vostro plasmide contenente TC-tagged gene di interesse in base al metodo di trasfezione di scelta.
Nota è importante utilizzare i controlli positivi e negativi per valutare l'entità del legame specifico ai tag TC e per valutare bleedthrough di fluorescenza tra i canali al momento del ritiro microscopio confocale. Quindi, per due colori (per esempio Flash / Cherry o ReAsH / o CFP ReAsH / GFP combinazioni), assicurano i campioni sono preparati per singoli colori (es. proteina fluorescente da soli o, se possibile, una proteina TC-tagged legato a Flash / ReAsH ma senza fluorescente proteine)
- Uno o due giorni dopo la transfezione, risciacquare delicatamente le cellule con 300 ml di pre-riscaldato (a 37 ° C) HBSS.
- Immergere delicatamente le cellule con 1 mM Flash (o ReAsH) in 300 ml di HBSS preriscaldata e 10 mM 1,2-ethanedithiol (EDT).
E 'importante aggiungere EDT prima di aggiungere Flash / ReAsH e fare il tampone appena prima di aggiungerlo alle cellule. Incubare per esattamente 30 minuti a 37 ° C nel tessuto culturale incubatore. Nella nostra esperienza i tempi di incubazione più lungo aumenta significativamente la fluorescenza di fondo. Nuovi costrutti dovrebbe essere ottimizzato per l'etichettatura di tempo e Flash / ReAsH concentrazione (0.5-2 mM).
- Aspirare delicatamente etichettatura soluzione dalle cellule e quindi sostituire con 300 microlitri HBSS preriscaldata + 250 mM 2,3-dimercaptopropanol (BAL) per 15 minuti a 37 ° C.
- Rimuovere soluzione di lavaggio mediante aspirazione dolce e sostituire con 300 microlitri HBSS preriscaldata.
Dopo questo lavaggio, le cellule possono essere fissati con paraformaldeide (15 min con il 3,2% di soluzione), anche se abbiamo trovato che questo aumenta la fluorescenza non specifica biarsenical colorante. Quindi di solito l'immagine cellule vive a temperatura ambiente. (Si noti che la fissazione delle cellule prima dell'etichettatura previene il legame biarsenical colorante.)
2. Imaging le cellule su un microscopio confocale
- Al microscopio confocale, impostare i parametri per l'imaging del fluorofori individuali (vedi tabella 1) e assicurarsi che non vi è bleedthrough trascurabile tra i canali. Ciò può essere ottenuto controllando fluorofori individuale (in campioni di controllo) contro ogni diversa impostazione di acquisizione fluorescenti per fluorescenza. Regolazione della lunghezza d'onda di emissione può aiutare a minimizzare bleedthrough (anche se questo può anche ridurre il rapporto segnale / rumore).
- Anche regolare le impostazioni del fotomoltiplicatore in modo che la fluorescenza massima nel campione non saturare il rivelatore. (Questo può essere rilevato con il Q-LUT impostazione sul confocale Leica SP2). Una volta che le migliori impostazioni di imaging sono determinati, non modificare nessuno di loro tra i campioni.
- Altre impostazioni si utilizzano in genere (anche se questi possono essere ottimizzati) sono una velocità di scansione di 200 Hz e raccogliere 4 medie di linea e un diametro foro stenopeico di 1 unità Airy. Il diametro del foro può essere ampliata in caso di segnale / rumore è un problema, tuttavia, questo può causare una perdita di imaging.
- Raccogliere le immagini confocale a 12-bit (o superiore) formato, se possibile. 12-bit in formato cattura una più ampia gamma dinamica di valori (0-4095) per ogni pixel l'intensità di 8-bit (0-255). Questo è importante per garantire il più ricco set di dati vengono registrati, che massimizza la qualità di analisi quantitativa dei dati.
- Raccogliere le immagini per il canale proteina fluorescente (Cherry, GFP o CFP) e anche per il canale biarsenical colorante (Flash o ReAsH) per tutti i campioni.
3. Analisi dei dati
- Installare il software ImageJ sul computer 8. http://rsbweb.nih.gov/ij/
- Assicurarsi che la versione di ImageJ ha i seguenti plugin:
- ImageJ aperto, e se si utilizza una versione precedente alla v1.32c, fare clic sulle seguenti opzioni per abilitare più immagini da aprire in una sola volta (che può essere fatto tenendo premuto il tasto di controllo mentre si fa clic su file diversi):
- Aprire le immagini di interesse in ImageJ.
ImageJ automaticamente definire le intensità dei pixel massimi e minimi che vengono visualizzati sullo schermo per ogni immagine separatamente. Dato che le diverse immagini avranno dintensità dei pixel ifferent, questo significa che le immagini visualizzate non sono paragonabili come appaiono. - Per garantire le immagini aperte sono tutti sulla stessa scala, è possibile definire fisicamente superiore e più bassa intensità di pixel da visualizzare (questo non cambierà il contenuto effettivo dei dati delle immagini come sarebbe il caso di qualche altro software). Questi valori possono essere impostati con il seguente menu:
- Un approccio alternativo è quello di lavorare con gli stack, che mette insieme tutte le immagini in un file e verrà automaticamente scala (per la visualizzazione), tutte le immagini in stack per la stessa scala. Il modo più semplice per lavorare con i dati è quello di convertire ogni canale ad una pila. Così, per il canale proteina fluorescente convertire tutti a stack come mostrato. È possibile selezionare facilmente un canale sovrapponendo tutte le immagini contenenti un nome comune (ad esempio "ch00") nel titolo.
- Ora convertire tutte le immagini aperte ad 8-bit per l'analisi. Questo effettivamente riscalare la gamma visto in una serie 0-255 (che definisce 8-bit).
IMPORTANTE: Non salvare sopra l'originale a 12-bit (o superiore) formato o si perderanno contenuto informativo. Si noti che alcuni pacchetti software in grado di visualizzare solo immagini a 8 bit in modo da questo formato è utile per creare figure, ecc
- Salva una copia in una nuova cartella chiamata "8-bit convertito" utilizzando la funzione "Salva con nome ..." opzione.
- Un metodo per esaminare l'entità del legame colorante biarsenical in una intera immagine è quella di eseguire un pixel tracciato di correlazione intensità. Questo complotti ogni valore di pixel in un canale rispetto al valore di pixel corrispondente in un secondo canale. Quindi una posizione di pixel ad alta nel PCP fluorescenza sarà anche ad alto contenuto di fluorescenza ReAsH se c'è alta vincolante.
- Per analizzare il pixel co-correlazione, assicurarsi che la 8-bit ReAsH e Cerulean / GFP immagini sono aperti in ImageJ.
- Aprire il "Correlatore Immagine" plugin come di seguito indicato. Selezionare "Image1", come lo stack ReAsH o Flash e "Image2", come lo stack proteina fluorescente.
- Lo stack risultante non può visualizzare informazioni dettagliate - questo è normale. Salva la pila in una nuova cartella chiamata "dispersione" e dargli lo stesso nome di file come il campione si riferisce (ad esempio "Flash-ciliegia tracciato di correlazione")
- Per visualizzare i dati significativamente si può fare una delle due opzioni. In primo luogo trasformare i dati in modo che sia in formato log. Poi ridimensionare visivamente i dati come segue:
- In alternativa, è possibile ridimensionare visivamente i dati per mostrare solo valori bassi (ad esempio 1-255) e visualizzare i dati utilizzando una LUT speciale. Una LUT (Look Up Table) rappresenta una tabella di colori assegnati ad ogni valore di pixel in un'immagine . Questo può essere usato per definire uno schema pseudocolori per un'immagine ed è utile per definire alcune caratteristiche in un'immagine. Per creare un semplice clic personalizzati LUT su "editor di LUT" e fare uno nuovo come quello mostrato (che possono essere salvati e utilizzati successivamente).
- Impostare la luminosità / contrasto vanno da 0-255 (come descritto al punto 13 della presente sentenza). Per "bloccare" l'immagine, come a quella visualizzata sullo schermo, l'immagine può essere convertita in formato RGB che salva un valore a 8 bit per ognuno dei colori rosso, verde e blu di ogni pixel.
Per copiare e incollare le immagini ad altri programmi per prima cosa aprire le immagini a 8-bit o 16-bit. Come descritto al punto 14 della presente sentenza, assegnare un sistema di colori LUT all'immagine. Per PCP, assegnare la LUT "Cyan", come descritto di seguito ...
- Selezionare l'immagine e copiarlo negli appunti, selezionare ...
4. Rappresentante dei risultati:
Il successo di cellule etichettatura con coloranti biarsenical dipende da alcuni parametri chiave. In primo luogo, i tempi della etichettatura con coloranti è cruciale. Abbiamo scoperto che lunghi periodi di etichettatura (più di 30 minuti) si traduce in un elevato livello di colorazione aspecifica di fondo. Fig. 1 mostra un tipico risultato di una wild-type forma di frammento huntingtina (25Q) unito alla Cerulean PCP derivato contenente un tag TC come descritto in precedenza 7. Questo campione è stato macchiato per 30 minuti con ReAsH e non c'è sfondo minimo nel campione manca il tag di TC. Abbiamo scoperto che la fissazione delle cellule con sfondo paraformaldeide aumenta mentre fissaggio con metanolo abroga la fluorescenza del tag proteina fluorescente. Quindi dove possibile, l'immagine del cellule vive. E 'importante notare inoltre che la fissazione preventival'etichettatura con coloranti biarsenical impedisce loro legame, presumibilmente a causa di modifiche del TC motivo.
Un altro fattore critico per risultati costanti è la densità delle cellule. Abbiamo trovato critiche a celle di immagine che vengono liberamente distribuiti e, inoltre, che ampia aggregazione può portare a colorazione irregolare dei coloranti biarsenical in celle diverse.
Figura 1. Tetracysteine tag e colorazione ReAsH in cellule vive transfettate con huntingtina (exon1-25Q)-Cerulean fusioni. Il tag TC si trova all'incrocio tra la huntingtina Cerulean-fusione (come descritto in 7). Il tracciato di correlazione di intensità dei pixel consente una valutazione delle differenze di ReAsH vincolanti per tutta la cellula e può essere utilizzato per mappare i cambiamenti in ReAsH vincolante a causa di cambiamento conformazionale o interazioni ligando.
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Discussion
L'approccio alla localizzazione etichetta proteina con una proteina fluorescente e le proprietà conformazionali con un colorante secondo offre un grande potenziale per la mappatura in cui diverse conformazioni delle proteine nelle cellule maturano e gli eventi che cambiano le dinamiche della conformazione delle proteine. ReAsH / Flash per la prima volta utilizzato come in-cell sensore per folding delle proteine dei mammiferi cellulari retinoico-binding protein I 4. In questo esempio, il Flash associato a un tag TC cellulare progettato in acido retinoico-binding protein avevo ridotto rendimento di fluorescenza in forma piegata relativo alla forma spiegato, e il ripiegamento potrebbe essere rintracciato in E. coli cellule. Più di recente ripiegamento delle proteine e di auto-associazione è stata dimostrata in proteine modello con schermo bipartito tetracysteine 6. In questo esempio, le coppie dicysteine distale su peptidi modello sono stati portati in prossimità dal legame di due peptidi contenenti coppie dicysteine, o dalla piegatura di un peptide che ricostituisce un motivo per il legame funzionale tetracysteine coloranti biarsenical. Abbiamo preso questo approccio un ulteriore passo avanti per lo sviluppo di sensori che distinguono monomeri da oligomeri a causa del tag TC diventando occluso dal colorante biarsenical obbligatorio in tutte le forme oligomeriche 7.
Nonostante il potenziale delle etichette TC e coloranti biarsenical come reporter per i cambiamenti conformazionali e di associazione, la metodologia soffre di avere un relativamente basso rapporto segnale / rumore del segnale rispetto a proteine fluorescenti a causa di fondo di base fluorescenza 9. Quindi negli sforzi per sviluppare sensori conformazione varrebbe la pena di testare alcuni degli altri approcci etichettatura più recenti in fase di sviluppo, come ad esempio un sistema progettato ligasi fluoroforo che coniuga derivati della cumarina ad un amino-acido 13 sequenza peptidica 3.
L'analisi presentata qui può essere ulteriormente estesa per esaminare dove le differenze all'interno delle cellule si verificano nel legame di ReAsH / Flash per la proteina di interesse. Per fare questo, le immagini possono essere suddivisi in sub-regioni attraverso la creazione di regioni di interesse (ROI) e convertirli in maschere per filtrare le diverse parti di immagine (questo può essere fatto in ImageJ). Quindi, dal confronto tra le trame di intensità dei pixel dovrebbe essere possibile valutare statisticamente le differenze tra subregioni intracellulare utilizzando i sensori.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato da borse di DMH e TDM (NHMRC sovvenzioni per progetti). DMH è membro Grimwade, finanziato dal Trust Miegunyah.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-well μ-slides | Ibidi | 80826 | We find these chamber slides to be particularly useful for culturing cells for imaging. |
| TC-FlAsH II In-cell Tetracysteine Tag Detection Kit *green fluorescence* *for live-cell imaging | Invitrogen | T34561 (FlAsH) or T34562 (ReAsH) | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14175-103 | |
| 2,3-Dimercapto-1-propanol | Sigma-Aldrich | D1129-5ML | |
| 1,2-Ethanedithiol | Sigma-Aldrich | 02390-25ML |
References
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