تلوين الأجسام المضادة في Published: October 14, 2013 doi: 10.3791/50664

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Janet S. Duerr¹

¹Department of Biological Sciences, Ohio University

Summary

"تكسير الفريزر"، وهي طريقة لتعريض الأنسجة الداخلية للC. الخيطية ايليجانس إلى الأجسام المضادة للبروتين التعريب، ويتجلى.

Abstract

وصمة عار C. ايليجانس مع الأجسام المضادة، لا بد من تجاوزها بشرة منيعة نسبيا بالطرق الكيميائية أو الميكانيكية. "تكسير تجميد" هو أسلوب واحد يستخدم لسحب جسديا بشرة من الديدان الخيطية الديدان الخيطية عن طريق ضغط بين شريحتين ملتصقة، تجميدها، وسحب الشرائح على حدة. يوفر تجميد تكسير وسيلة بسيطة وسريعة للوصول إلى الأنسجة دون المعالجة الكيميائية، ويمكن استخدامها مع مجموعة متنوعة من مثبتات. ومع ذلك، فإنه يؤدي إلى فقدان العديد من العينات وضغط ميكانيكيا المطلوبة يشوه العينة. مطلوب الممارسة لتحقيق أقصى قدر من الانتعاش من العينات مع مورفولوجية جيدة. يمكن أن يكون الأمثل تجميد تكسير لشروط محددة التثبيت، والانتعاش من العينات، أو منخفضة تلطيخ غير محددة، ولكن ليس لجميع المعلمات في آن واحد. عن الأجسام المضادة التي تتطلب شروط التثبيت من الصعب جدا وتحمل العلاجات الكيميائية اللازمة لpermeabilize كيميائيا بشرة، المعاملهقد يكون من المفضل طن من الديدان الخيطية سليمة في الحل. إذا كانت الأجسام المضادة يتطلب الإصلاح أخف وزنا أو إذا كانت الشروط التثبيت الأمثل غير معروفة، ويوفر تجميد تكسير وسيلة مفيدة جدا لفحص الأجسام المضادة بسرعة ويمكن أن تسفر عن معلومات محددة توطين التحت خلوية والخلوية للمستضد من الفائدة.

Introduction

لتحديد توطين الخلوية والتحت خلوية من البروتينات، والعلماء وصفت تقليديا الأنسجة مع الأجسام المضادة المحددة للاعتراف على وجه التحديد خاصة البروتينات ^1. في بعض الكائنات الحية مثل نموذج C. ايليجانس، وكثيرا ما تم استبدال تلوين الأجسام المضادة عن طريق التقنيات الوراثية الجزيئية، والتي تسفر عن نتائج بسرعة أكبر. وتشمل هذه الكائنات مع تحويل بنيات تتكون من اندماج الجينات بين المروج والمناطق الترميز من الجينات في المصالح وبروتين الفلورية الخضراء. ومع ذلك، والتقنيات الجزيئية تخضع لعدد من الأعمال الفنية، بما في ذلك المشاكل مع معرفة المروج الحقيقي والتغيرات في التعبير عن ثوابت في عدد نسخ عالية (التقنيات المعتادة في C. ايليجانس) ^2،3. وبالتالي، وتلطيخ مع الأجسام المضادة لا تزال هدفا للعديد من العلماء دراسة وظيفة البروتين في الجسم الحي.

يمكن تلطيخ الأنسجة مع الأجسام المضادة يكون صعبا، إذ أنtibodies قد تعترف فقط المستضد خاصة في التشكل ^1. على سبيل المثال، قد الأجسام المضادة تعترف فقط المستضد التشويه والتحريف أو سليمة ثابتة بطريقة معينة وقد لا تتعرف على المستضد في الموقع. وتتفاقم مشكلة تلوين الأجسام المضادة في الديدان الخيطية من حقيقة أن بشرة من الديدان الخيطية يشكل حاجزا غير منفذ نسبيا، ومنع وصول الأجسام المضادة للأنسجة.

هناك العديد من الطرق المختلفة المستخدمة لتلوين الأجسام المضادة في C. ايليجانس (إعادة النظر في عملنا السابقة ^4). وصمة عار على حالها "الديدان"، وقد وضعت وسائل لتجميد وذوبان الجليد في تثبيتي الصعب نسبيا (الفورمالديهايد أو غلوتارالدهيد)، وتجميد أذاب دورات مساعدة للقضاء على بشرة للسماح الاختراق السريع من تثبيتي ^5. بعد التثبيت، تم permeabilized بشرة للسماح الاختراق من الأجسام المضادة، وشملت أساليب العلاج مع الاختزال، كولاجيناز، أو كليهما ^5-7. هذه رreatments الحفاظ على التشكل، ولكن في كثير من الأحيان انخفاض أو تدمير الاعتراف الأجسام المضادة. وتشمل الطرق البديلة تشريح ⁸ للسماح اختراق الأجسام المضادة.

"تكسير تجميد" هي طريقة واحدة للوصول إلى المناطق الداخلية من دودة شبه سليمة للسماح الضد تلطيخ ^9-10. تجميد تكسير يمكن القيام بها مع مجموعة متنوعة من الظروف التثبيت مع تجنب العلاجات كولاجيناز والحد منها. يتم وضع الديدان الخيطية بين اثنين من المواد اللاصقة والشرائح، والمجمدة، ومن ثم يتم فصل الشرائح، وترك معظم الديدان الخيطية على الشريحة السفلي وجزء كبير من إهاب على الشريحة العليا. يمكن وضعها في أسفل الشريحة تثبيتي، ويتم نقل الشريحة بأكملها مع الديدان الخيطية الالتزام من خلال إجراءات تلوين الأجسام المضادة. طريقة يفعل الحاضر اثنين صعوبات كبيرة. الأولى، فإنه من الصعب تطبيق المبلغ الصحيح من الضغط اللازم لتقسيم النيماتودا دون تشويه جدية منهم. الثانية، فإن العديد من الديدان لا سوف قوضع علامة على أي شريحة، وسيتم فقدان في تثبيتي أو يشطف. ومع ذلك، مع الشرائح والممارسة السليمة، فإن طريقة تسفر بسرعة الديدان الخيطية مع التشكل معقولة والتي يمكن استخدامها مع مجموعة واسعة من مثبتات والأجسام المضادة.

طريقة قد تختلف قليلا، وهذا يتوقف على الهدف من المجرب. إذا كان المطلوب تلطيخ من الديدان الخيطية واحد (على سبيل المثال لتحديد ما إذا كان المحولة واحدة غيرت تلوين الأجسام المضادة)، ثم ينزلق مع التصاق القصوى (ولكن أعلى تلوين الخلفية) يمكن استخدامها، مثل الشرائح المعدة المختبر مع متعدد الليزين إضافية (انظر أدناه). لالفورمالديهايد أو غلوتارالدهيد التثبيت، أعلى الشرائح التصاق (شرائح متعدد الليزين، أعد المختبر) وينبغي أن تستخدم، منذ الديدان الخيطية التمسك أكثر قليلا للمتعدد الليزين بعد هذه التثبيتات. إذا كان يتم إصلاح البرية من نوع الديدان الخيطية مع الميثانول و / أو الأسيتون، ثم ينزلق مع انخفاض التصاق وينبغي أن تستخدم أقل تلوين الخلفية (تجارية أو لترaboratory-أعدت الشرائح). إذا كان يتم استخدام مجموعة متنوعة من الأجسام المضادة ومثبتات في المختبر، ومجموعة مختارة من الشرائح قد يكون مستعدا في وقت مبكر وتخزينها لحين الحاجة إليها.

بعد أن تم تمكنت من الوصول إلى أنسجة الديدان الخيطية والإجراءات تلوين الأجسام المضادة اتباع الأساليب القياسية (مع حضانات يعد سمة من سمات الأنسجة بدلا من الخلايا ^1،11).

Protocol

ملاحظة: يتم عرض الخطوات بروتوكول متعددة مع خيارات لمجموعة المتابعة وإعداد تبعا لظروف معينة من التجربة. لهذه الحالات، يتم عرض خطوات بديلة ك A، B، C، الخ ويرد بروتوكول مع خطوات بديلة في الشكل 1.

1. إعداد الشرائح المغلفة متعدد الليزين

ثلاثة أنواع مختلفة من الشرائح يمكن استخدامها، وهذا يتوقف على المطلوب مفاضلة بين سهولة التحضير، التصاق النسبي، وغير محددة وملزمة من الأجسام المضادة. وترد تفاصيل عن بدائل إعداد الشريحة أدناه في الخطوات 1A-1C من أجل زيادة التصاق والتعقيد. الشرائح من خلال هذه الأساليب المختلفة التي أعدت يمكن استخدامها معا من أجل تجربة واحدة.

1A. لا إعداد الشرائح

توفير متعدد الليزين المغلفة الشرائح المتاحة تجاريا منخفضة التصاق وخلفية منخفضة.

1B. العلاقات العامة الشريحةeparation الأمثل للالميثانول الأسيتون التثبيت

التصاق متوسطة وخلفية منخفضة.

1. يعد حل متعدد الليزين لغمس شرائح: إضافة 400 ملغ من الوزن الجزيئي عالية جدا (150،000 - 300،000 د) بولي-L-يسين إلى 200 مل من الماء المقطر مزدوجة. إضافة 2 مل 10٪ الأسهم أزيد الصوديوم (تركيز النهائي 0.1٪) كمادة حافظة. تنبيه: الجافة أزيد الصوديوم هو رد الفعل وجميع أشكال سامة. ارتداء قناع وقفازات حين مسحوق وزنها لجعل الأسهم 10٪ في الماء المقطر مزدوجة.
2. مسح نهاية واحدة الشرائح زجاج بلوري مع مناديل خالية من الوبر، وإزالة اللطخات والجزيئات. وينبغي أن يتم هذا حتى على الشرائح التي تم شراؤها مع تسمية "precleaned".
3. مكان الشرائح للعودة إلى الوراء في حامل الشريحة، جرة coplin أو غيرها من الحاويات تلطيخ الشريحة، وحفظ حواف متجمد وحتى لا تتماشى تماما تماما (لجعل الانفصال أسهل في وقت لاحق). وضع حامل شريحة في دورق مع 70٪ من الإيثانول (الكحول كاشف الصف لا حاجة) مع 1٪ حمض الهيدروكلوريك في ديهدأ الماء أو ملء جرة تلطيخ لمستوى صقيع. صخرة الشرائح في حل مدة لا تقل عن 5 دقائق. تنبيه: هذا الحل هو تآكل، وارتداء القفازات. ملاحظة: هذا الحل يمكن إعادة استخدامها عدة مرات (تصل إلى عدة أشهر).
4. شطف الشرائح في تشغيل الماء المقطر لمدة 1 دقيقة.
5. الشرائح جافة تماما في بيئة خالية الغبار إما عن طريق وضع في فرن C 40-60 درجة لمدة 30-60 دقيقة أو بين عشية وضحاها عن طريق الحفاظ على درجة حرارة الغرفة.
6. احتضان الشرائح في حل متعدد الليزين (تغطي أجزاء unfrosted) على الروك لمدة 15 دقيقة.
7. تكرار تجفيف الشرائح.
8. تكرار متعدد الليزين حل الحضانة وخطوات التجفيف.
9. فصل الشرائح باستخدام جسم معدني نحيف مثل ملعقة وزنها رقيقة. في حالة الالتزام بشكل صحيح، فهي من الصعب فصل. ارتداء معدات السلامة المناسبة (نظارات السلامة) والعمل على مقاعد البدلاء ورقة أعلى (يتم التخلص منها بعد الاستخدام)، منذ قطع صغيرة من الزجاج قد يطير فضفاضة عندما يتم فصل الشرائح.
10. مخزن الشرائح في نظيفة(خالية من الغبار) مربع الشريحة عند 4 درجة مئوية لحين الحاجة إليها.

1C. الشريحة إعداد الأمثل لتثبيت الفورمالديهايد

أعلى التصاق ولكن خلفية عالية.

1. مكان الشرائح أعد مع طريقة 1B شقة في، طبق الفرن خالية من الغبار (مناسبة لتجفيف في الفرن) أو على سطح مجانية الغبار شقة (لتجفيف الهواء).
2. وضع قطرة 20-60 ميكرولتر من الحل متعدد الليزين في منتصف كل شريحة.
3. الشرائح الجافة تماما في الفرن أو في درجة حرارة الغرفة. سوف تترك وراءها متعدد الليزين الاهليليجات شاحب كما يتبخر. هذه الأشكال البيضاوية لاصقة جدا. للأسف، أنها تربط أيضا إلى الأجسام المضادة الأولية والثانوية، حتى بعد الحجب.
4. مخزن الشرائح في مربع الشريحة نظيفة (خالية من الغبار) في 4 درجات مئوية لحين الحاجة إليها.

2. إعداد الشرائح المجمدة النيماتودا

إعداد الديدان الخيطية لتلطيخ من قبل الشطف خالية تماما من البكتيريا باستخدام طريقة 2A (لوحات من الديدان الخيطية) أو2B (لالديدان الخيطية الفردية).

2A. إعداد الشرائح من لوحات من الديدان الخيطية

1. وضع قطعة مسطحة من المعدن على الجليد الجاف لprechill.
2. استخدام الماء المقطر وماصة الزجاج (يقلل فقدان الديدان) أو micropipette لشطف الديدان من لوحة NGM مع البكتيريا في أنبوب microfuge 1.5 مل. لوحات يمكن أن تكون متزامنة أو مختلطة الأعمار؛ لا تستخدم لوحات مع العديد من dauers (صعبة للقضاء) أو الديدان جوعا (زيادة تألق ذاتي) إلا عند الضرورة.
3. شطف الديدان 3-4X مع الماء المقطر حتى خالية من البكتيريا. (لتقليل الخسائر من الديدان استخدام نفس الزجاج ماصة.) لتكوير الديدان، وإما السماح لهم الجلوس على مقاعد البدلاء لمدة 3-5 دقيقة (لجمع معظمها البالغين في أسفل أنبوب) أو تدور 30 ​​ثانية في ~ 1،000 دورة في الدقيقة (~ 500 ز) في جهاز للطرد المركزي الطاولة (لجمع البالغين، يرقة، والأجنة).
4. إزالة معظم المياه من أنبوب مع الديدان، وترك حوالي ضعف حجم المياه كما الديدان (ولكن لا يقل عن 25 ميكرولتر اجمالى حجم).
5. لديهم عدد متساو من العادية (محو نظيفة ولكن لم يعالج متعدد الليزين) "أعلى" الشرائح المتاحة.
6. المكان ~ 25 ميكرولتر الديدان في الماء على "القاع" الشريحة الملتصقة ونشر السائلة التي تحتوي على الديدان على الجزء المركزي من الشريحة باستخدام الجانب من طرف ماصة.
7. اسمحوا الديدان تسوية لمدة 30 ثانية إلى 2 دقيقة. إذا كانت الشريحة غير لزجة بشكل مناسب، وسوف ينتهي من الديدان عصا كما اتصل الشريحة.
8. عقد الشريحة السفلي في يد واحدة ووضع الشريحة على الشريحة الأعلى أسفل ولكن حتى يتسنى لجميع الأجزاء بلوري ومتداخلة. السائل يجب الحفاظ على الشرائح بصرف النظر قليلا، حتى أن الديدان لا تزال تتحرك قليلا لا تدع الشرائح تنزلق فوق بعضها البعض - هذا يلوي الديدان.
9. اضغط بعناية على التوالى بانخفاض قبخفة على الشريحة الأعلى، وذلك باستخدام الابهام والسبابات من كل ناحية. مع كمية مثالية من الضغط، وعدد قليل من أكبر المنحرفين على حافة الشرائح تمزق، في حين أن معظم البالغين واليرقات سوف نتصل كل شريحة ولكن سوف تبقى على حالها.
10. على الفور وبدقة (دون الانزلاق) وضع الشرائح على قطعة من المعدن على الثلج الجاف. يجب أن تظهر الشرائح المجمدة خلال دقيقة واحدة. الحفاظ على الجليد الجاف لمدة 5 دقائق حتى تجمد تماما.
11. عند هذه النقطة، يمكن تخزين الشرائح في المربع المسمى في -80 درجة مئوية لعدة أيام. (إذا كان يتم الاحتفاظ بها أسابيع في -80 درجة مئوية، وتبدأ المياه لسامية بعيدا وسوف الديدان ليس وصمة عار، وكذلك). إذا تم تخزين الشرائح في -80 درجة مئوية، والسماح لهم 'الاحماء' على الجليد الجاف لمدة 10 دقيقة قبل تكسير.
12. انتقل إلى الخطوة 3 (التثبيت).

2B. إعداد الشرائح من الديدان الخيطية الفردية

1. وضع قطعة مسطحة من المعدن على الجليد الجاف لPRECالتل.
2. استخدام معول دودة لنقل الديدان الخيطية الفردية لقطرة من الماء على لوحة NGM لتحريرهم من البكتيريا. يجب أن تكون الديدان الخيطية (ق) تغذية جيدة لتقليل تألق ذاتي، إذا كان ذلك ممكنا. تكرار نقلها إلى بقع جديدة من الماء حسب الحاجة، حتى دودة (ق) هي خالية من البكتيريا.
3. تسمية الجانب متجمد من "القاع" الشرائح متعدد الليزين مع الحبر وشرائح مكان لا يمحى على العداد بجانب الحاويات مع الثلج الجاف، جنبا الملصق لأعلى. لديهم عدد متساو من أقل تمسكا "كبار" (غير المعالجة) الشرائح المتاحة.
4. وضع قطرة ميكرولتر 5-10 من الماء على منطقة أسفل الشريحة معاملة مزدوجة مع متعدد الليزين. استخدام حجم أكبر إذا نقل المزيد من الديدان، لمنع المياه من التبخر قبل الانتهاء.
5. نقل دودة (ق) إلى قطرة ماء مع اختيار دودة، وذلك باستخدام المجهر لمشاهدة الديدان تغرق لتلمس سطح الشريحة لزجة. نقل عدد قليل من واحد الدودة إلى ما يصل إلى 20 + الديدان من كل قطرة ماء.
6. عقد ق القاعLIDE في يد واحدة ووضع الشريحة على الشريحة الأعلى أسفل ولكن حتى يتسنى لجميع الأجزاء بلوري ومتداخلة.
7. على الفور وبدقة (دون الانزلاق أو ضغط) وضع الشرائح على قطعة من المعدن على الثلج الجاف. الحفاظ على الجليد الجاف لمدة 5-30 دقيقة. (لا تخزن هذه الشرائح على المدى الطويل، والشرائح يجف بسهولة.)
8. انتقل إلى الخطوة 3 (التثبيت).

3. تثبيت

مثبتات ضرورية ل'الإصلاح' مستضد في مكان في الخلية، إما عن طريق عجل ("تثبيت ضوء") أو عبر ربط ("التثبيت الصعب") للمستضد. التثبيت قد يعطل استضداد؛ الأجسام المضادة الأكثر شهرة تعمل بشكل أفضل مع شرط التثبيت معينة. عن الأجسام المضادة الجديدة، ينبغي اختبار مجموعة من الشروط التثبيت.

لأي تثبيت، فإن الخطوة الأولى هي جعل الفوسفات مخزنة محلول ملحي. الشرائح الإصلاح المقبل مع الديدان الخيطية لتلوين الأجسام المضادة باستخدام طريقة A (ضوءإصلاح باستخدام الميثانول والأسيتون) أو ب (الإصلاح أصعب باستخدام الفورمالدهيد أو غلوتارالدهيد).

1. إعداد العقيمة الحل 10X PBS (الفوسفات مخزنة المالحة) الأسهم عن طريق إضافة 80 غرام كلوريد الصوديوم، 2.0 غرام بوكل، 27.2 ز نا ₂ هبو ₄ • H ₂ 0، 2.4 غ KH ₂ PO _4، 20 مل 10٪ من الصوديوم الأسهم أزيد. لجعل هذا الحل الأوراق المالية، وتزن من الصوديوم مسحوق أزيد لجعل حل 10٪ في الماء المقطر مزدوجة. يحرك المياه المالحة مع الحرارة لطيف حتى يذوب. تنبيه: الجافة أزيد الصوديوم هو رد الفعل وجميع أشكال سامة. ارتداء قناع وقفازات عند التعامل مع أزيد الصوديوم الجافة أو الحلول.
2. دعونا المالحة بارد (تريس درجة الحموضة حساسة للحرارة)، ثم الرقم الهيدروجيني إلى 7.2 مع هيدروكسيد الصوديوم M 1-10. أعلى إلى 1 لتر مع الماء المقطر مزدوجة والأوتوكلاف لتعقيم. تخزينها في درجة حرارة الغرفة، وتمييع ل1x أخرى حسب الحاجة مع الماء المقطر مزدوجة العقيمة. تنبيه: هيدروكسيد الصوديوم هو الكاوية - ارتداء القفازات أثناء الاستخدام.

3A. الإصلاح الضوء باستخدام الميثانول الأسيتون

1. وضع الميثانول بنسبة 100٪، 100٪ الأسيتون، والفوسفات مخزنة المالحة 1X (PBS) في تلطيخ الجرار على الجليد لprechill لا يقل عن 10 دقيقة. تنبيه: الميثانول والأسيتون سامة، وارتداء القفازات.
2. تأخذ زوج من أسفل وأعلى الشرائح من الثلج الجاف، وتطور بسرعة بينهما، وتزج فورا "القاع" في الشريحة الميثانول الجليد الباردة لمدة 2 دقيقة. قد يتم تجاهل "أعلى" الشريحة.
3. نقل الشرائح من الميثانول إلى جليد الأسيتون الباردة لمدة 4 دقائق. إذا كان العديد من الشرائح والديدان، ومعظم (90٪) سوف تسقط في الإصلاح، حتى مع الشرائح أفضل إعداد. إذا تم إعداد الشرائح دودة واحدة بشكل صحيح، يجب أن تبقى الديدان الالتزام.
4. وضع أو تراجع الشرائح في جرة مع برنامج تلفزيوني (لشطف تثبيتي) وانتقل إلى الخطوة 4 (تلطيخ).

3B. الإصلاح الثابت باستخدام الفورمالدهيد أو غلوتارالدهيد

1. تمييع كاشف الصف الفورمالديهايد أو محلول غلوتارالدهيد في برنامج تلفزيوني 1X إلى 0،5-4٪ تركيز النهائي. مأخوذة (1.5 مل) أماهذ خزنها توج بإحكام في -20 إلى -30 ° C؛ تذويب مأخوذة على الجليد فقط قبل استخدام. ملاحظة: حلول الفورمالديهايد تتحلل بمرور الوقت ومع التعرض للهواء. تنبيه: الفورمالديهايد وغلوتارالدهيد سامة، وارتداء القفازات والعمل في غطاء محرك السيارة.
2. تأخذ زوج من أسفل وأعلى الشرائح من الثلج الجاف، وتطور بسرعة بينهما، ووضع على الفور "القاع" الشريحة مع الديدان في طبق مسطح مع غطاء. (الشريحة العليا يمكن التخلص منها).
3. ماصة على الفور 200 ميكرولتر تثبيتي السامة على مركز من مساحة الشريحة مع الديدان. سوف تثبيتي تجميد جزئي في مكان، ثم تذوب لتغطية منطقة أكبر من الشريحة.
4. إذا لم تتم تغطيتها الديدان تماما مع تثبيتي، وعلى الفور وبعناية إضافة المزيد من تثبيتي باستخدام micropipette. لا تسمح تثبيتي في التدفق على حافة الشريحة.
5. تغطية صحن مع غطاء وترك لمدة 10 دقيقة بين عشية وضحاها لفي درجة حرارة الغرفة. تأكد من ترطيب الطبق إذا حضانات تعد عه استخدام - وهذا يمكن أن يتم عن طريق إضافة مناديل مبللة خالية من الوبر مطوية إلى الطبق. لا تدع مناديل تلمس الشرائح.
6. بعد اكتمال التثبيت، ماصة بعناية تثبيتي مع الديدان فضفاضة في أنبوب 1.5 مل وتراجع الشريحة في جرة تلطيخ مع برنامج تلفزيوني.
7. تدور الأنبوب مع الديدان التي جاءت فضفاضة بسرعة عالية لمدة 30 ثانية لتكوير. شطف الديدان مرتين مع برنامج تلفزيوني، ثم معالجة بالتوازي مع الديدان على الشرائح (القيام الخطوات في أنابيب microfuge، بدلا من التركيز على الشرائح).
8. انتقل إلى الخطوة 4 (تلطيخ).

4. الأجسام المضادة تلطيخ

بروتوكول تلوين الأجسام المضادة مشابهة لبروتوكولات موحدة لأي نوع من الأنسجة على الشرائح. هذا البروتوكول هو نفسه بالنسبة لجميع الشرائح بغض النظر عن الإعداد في الخطوات 1-3.

1. إعداد الأجسام المضادة العازلة عن طريق خلط 700 مل من الماء المقطر مزدوجة، و 100 مل 10X PBS، 5 مل تريتون X-100 (النهائية 0.5٪)، 2 مل 0.5 M EDTA الرقم الهيدروجيني 8 (1 ملم النهائي)، 1 ز BSA (النهائية 0.1٪)، 5 مل 10٪ من الألف إلى الياء الصوديومالحل IDE (0.05٪ النهائي). الرقم الهيدروجيني إلى 7.2 مع حمض الهيدروكلوريك، ثم يضاف الماء المقطر المزدوج إلى 1 L؛ تخزينها في 4 درجة مئوية.
2. إعداد كتلة خلال إعادة تأسيس المصل حمار مع الماء المقطر المزدوج، ثم إضافة 5 مل مصل إلى 45 مل الضد العازلة (النهائي المصل 10٪).
3. إعداد حلول الضد الابتدائي والثانوي بحلول تمييع الضد في الضد العازلة زائد 1٪ BSA. التخفيفات الموصى بها 1:50-1:2،000 عن الأجسام المضادة الأولية و1:1،000-1:5،000 عن الأجسام المضادة الثانوية (Cy3or OG488 الأجسام المضادة حمار مترافق ضد الأنواع المستخدمة لرفع الأجسام المضادة الأولية).
4. إعداد الأوراق المالية دابي عن طريق خلط 2.5 ملغ / مل في الماء المقطر مزدوجة؛ متجر في 8 ميكرولتر مأخوذة المجمدة في -30 درجة مئوية. تنبيه: دابي هو صبغ الحمض النووي ملزم السامة، وارتداء القفازات أثناء وزنها والاستغناء إلى مأخوذة.
5. تحضير 10 مل تصاعد متوسطة عن طريق خلط 200 ملغ ن بروبيل غالات، 0.3 مل 1 M تريس الرقم الهيدروجيني 9، 2.7 مل من الماء المقطر مزدوجة في أنبوب 15 مل المخروطية. الحرارة عند 65 درجة مئوية لمدة حوالي 10 دقيقة حتى يذوب.إضافة 7 مل الجلسرين وقسامة 8 ميكرولتر من دابي ودوامة جيدا. قسامة المتوسطة إلى 1.5 مل أنابيب، والتفاف في احباط، وتخزينها في الظلام في 4 درجات مئوية (سواء الهواء والضوء تتحلل المتوسطة - إذا أصبح أكثر الأصفر، وتجاهل في النفايات عائلة السلمان). تنبيه: ن ن غالات هو رد الفعل المضادة للأكسدة، وارتداء قفازات حين وزنها.
6. نقل الشرائح إلى جرة تلطيخ مع كتلة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية (من الأفضل بين عشية وضحاها لإصلاح الثابت). تجنب المصافحة لتجنب فقدان الديدان.
7. نقل الشرائح لتلطيخ الجرة مع الأجسام المضادة الأولية أو مكان الشرائح في طبق مسطح ترطيب وأعلى مع كل الأجسام المضادة الأولية 100-500 ميكرولتر. احتضان الشرائح بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية دون أن تهتز.
8. بعد الأجسام المضادة الأولية الحضانة، ونقل الشرائح لتلطيخ جرة من برنامج تلفزيوني.
9. تحديد كتلة من خلال قمع اصطف مع ورق الترشيح وتخزينها في 4 درجة مئوية، وإذا العقيمة تصفيتها كل 1-2 أسابيع، كتلة يمكن إعادة استخدامها ل1 أشهر أو أكثر. وبالمثل، تصفية وحفظالأجسام المضادة الأولية في 4 درجات مئوية لإعادة استخدامها (لمدة تصل إلى 10 أو أكثر جولات من تلطيخ).
10. شطف الشرائح ثلاث مرات (~ 20 دقيقة لكل منهما) في المخزن الأجسام المضادة.
11. وضع الشرائح في الضد الثانوية في وعاء محكم ضوء تلطيخ واحتضان 4 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
12. نقل الشرائح لتلطيخ جرة من برنامج تلفزيوني. مرشح وحفظ الأجسام المضادة الثانوية في 4 درجات مئوية لإعادة استخدامها (لمدة تصل إلى 10 أو أكثر جولات من تلطيخ).
13. شطف الشرائح ثلاث مرات (~ 20 دقيقة لكل منهما) في المخزن الأجسام المضادة.
14. نقل الشرائح إلى برنامج تلفزيوني وترك في برنامج تلفزيوني (دقيقة ليلة وضحاها في 4 درجات مئوية) حتى جاهزة للتحميل.
15. العمل بسرعة على الشرائح الفردية، بحيث الديدان على الجبهة من الشريحة البقاء الرطب. إزالة شريحة واحدة من برنامج تلفزيوني، تجف الخلفي من الشريحة مع مسح خالية من الوبر، ومكان على منشفة ورقية.
16. المكان ~ 20 ميكرولتر من تصاعد متوسط ​​فوق الديدان بحيث هناك أجزاء متساوية تقريبا المتوسطة وبرنامج تلفزيوني على الشريحة والشريحة الميل بلطف لمزج الحلين. CAUTION: تصاعد المتوسطة هي سامة.
17. إمالة الشريحة حافة بلوري ذلك هو أقل والحل تجمع بالقرب من صقيع، ثم ضع حافة واحدة من 24 × 60 مم ساترة على الحل.
18. خفض بلطف ساترة للحد من فقاعات الهواء (التي تزيد تبيض وتعطيل يستعرضون). إذا تشكل فقاعات، ورفع حافة ساترة ببطء، ثم relower دون انزلاق ساترة عبر الديدان.
19. تجف بعناية قبالة الحافة الشريحة دون تحريك ساترة، عن طريق ضغط حواف مع مسح خالية من الوبر. يجب أن تكون على حافة جافة نسبيا من الشريحة المرئي في جميع أنحاء حافة ساترة
20. ختم ساترة مع 2-3 طبقات من طلاء الأظافر. يمكن وضعها في حامل الشرائح الشريحة المسطحة خلال إعداد وتخزين للحماية من ضوء. مرة واحدة وختم الشريحة جيدا وجافة ونظيفة ساترة والخلفي من الشريحة.
21. يمكن أن تبقى الشرائح مختومة جيدا في الظلام لعدة أيام في 4 درجات مئوية أو أسابيع في -20 درجة مئوية. على مدى فترات أطول، دابي ستاining من الحمض النووي ومعظم الأصباغ الخضراء (على سبيل المثال 488 نانومتر الإثارة) تتلاشى. ختم ساترة مع طلاء الأظافر أكثر حسب الحاجة، على سبيل المثال بعد استخدام أي عدسة الغمر النفط.

Representative Results

عندما يتم ضغط الديدان بشكل صحيح، متصدع، وبخفة ثابتة، يمكن تقريبا الدودة بأكمله تكون في متناول تلوين الأجسام المضادة (انظر الشكل 2). موقع نواة كما يتبين من تلطيخ دابي تشير إلى أي أجزاء من دودة سليمة عندما تتعرض الديدان لتثبيتي أصعب، مثل الفورمالديهايد، والتشكل من دودة قد تصبح مشوهة (كما رأينا من قبل ظهور مائج غير طبيعية من العضلات في أرقام 3A-D). مشكلة مشتركة أخرى هي تثبيت متفاوتة أو اختراق أنسجة معينة. ويرد مثال على ذلك في أرقام 3E-H، حيث اتسخت عضلة فقط في جزء من دودة، على الرغم من أن وجود تلطيخ الأخرى، بما في ذلك تلطيخ DNA، يشير إلى أن جزءا على الأقل من الجسم كان حاضرا ( أي ليس إزالتها خلال تجميد تكسير). نمط الناتجة من تلطيخ جزئية يمكن التعرف بسهولة مع الممارسة، بحيث distributi كاملعلى تلطيخ يمكن تحديد حتى لو يظهر أي دودة واحدة تلطيخ متفاوتة.

ويوضح المشاكل المشتركة واجه مع استخدام أي حالة تثبيت تكسير تجميد الرقم النهائي (الشكل 4). المشكلة الأكثر شيوعا هو التواء من العينة بسبب الحركة النسبية الشرائح اثنين خلال الضغط. حقيقة أن جسم الدودة والملتوية فقط الخلفي من البلعوم ويمكن رؤية من قبل التشكل من الأنسجة الملون. هذه الصورة تظهر أيضا مشكلة مع تلوين الخلفية، وذلك بسبب الأجسام المضادة التمسك بولي يسين طلاء الشريحة. نلاحظ، مع ذلك، أن جميع هذه الصور تم جمعها باستخدام الشرائح التي قدمت خلال أول محاولات تلوين الأجسام المضادة من الطلاب الجامعيين في دورة مختبر بيولوجيا الخلية. حتى مع الممارسة، فإن العديد من الديدان الفردية تظهر المشاكل رأينا في الشكل 4. ولكن، على أي شريحة واحدة، والديدان مثل تلك التي ظهرت في الشكلين 2 و 3 يمكن أن يكون founد وفحصها.

الشكل 1. الخطوط العريضة للإجراءات. تدفق الرسم البياني يشير إلى خطوات لتنفيذ الإجراء تكسير التجميد الكامل. يشار إلى بدائل لظروف متنوعة وتثبيت أعداد الديدان.

الشكل 2. والديدان الملون جيدا الثابتة طفيفة رؤساء اثنين من المنحرفين الكبار ثابتة مع الميثانول، الأسيتون والمسمى مع الأجسام المضادة متعددة والأصباغ: أ) الأجسام المضادة الأولية للدردشة (الكولين أسيتيل) والضد الثانوية CY3 مترافق، B) دابي (DNA الأزرق) ، C) ركازغون الأخضر 488 المضادة للGFP (بروتين الفلورية الخضراء)، D) يظهر تراكب (مع اثنين من علامات كوليني، CY3 المضادة للدردشة وCy5 المضادة للVAChT (نقل حويصلي أستيل) كما هو موضح باللون الأحمر). هذه السلالة المعدلة وراثيا (PS4657) يعبر عن الانصهار الترجمة بين GFP وAJM-1، وجدت في البلعوم تقاطعات القمي. الصور هي التوقعات القصوى لسلسلة من الصور متحد البؤر؛ شريط النطاق هو 50 ميكرون.

الرقم 3. الصور الثابتة البالغين التشوهات المرتبطة الفورمالديهايد. فورمالديهايد ملطخة CY3-phalloidin (يربط أكتين الخيطية)، دابي (DNA الأزرق)، وأوريغون الأخضر 488 المضادة للGFP. م) الأربعات من الجسم الخلفي عادل الفرج (أقصى اليسار) في نفس الديدان الخيطية، والتي تبين وبشكل غير طبيعي التشكل مائج بسبب التشويه فيduced قبل التثبيت. A) يظهر الأحمر phalloidin التشكل العضلات غير منتظمة قليلا. ب) النواة (الأزرق) وتنتشر بالتساوي في جميع أنحاء دودة. يظهر C) الأخضر وتوزيع CED-1 البروتين GFP :: الانصهار في الغشاء البلازمي لل خلية غمد الغدد التناسلية، مدفوعا المروج ليم-7 (سلالة MD701). D) يظهر تراكب هذه الأصباغ الثلاثة. EH) وصفها يمكن أن تختلف مع الأصباغ مختلفة على نفس الديدان الخيطية. E) Phalloidin (الحمراء) تسميات جزء فقط من العضلات على جانب واحد من دودة. F) النواة (الأزرق) موجودة في جميع أنحاء الدودة (على الرغم من شدة ملطخة متفاوتة). G) وOG488 المضادة للGFP تسميات الكولاجين-19 :: GFP في إهاب على جانب الدودة التي تفتقر إلى تلطيخ من الأنسجة العضلية أكثر مركزية، مشيرا إلى أن العضلات هي موجودة ولكنها غير تلطيخ على سطح واحد. H) يظهر تراكب من الأصباغ الثلاثة. الصور هي أقصىتوقعات امال من سلسلة من الصور متحد البؤر؛ الحانات هي مقياس 50 ميكرون.

الشكل 4. يرقة التشوهات المرتبطة ضغط. فورمالديهايد الثابتة ملطخة A) CY3-phalloidin (يربط أكتين الخيطية)، B) دابي (DNA الأزرق)، C) ولاية أوريغون الأخضر 488 المضادة للGFP، D) تراكب. تطور في الجسم فقط الخلفي من البلعوم هو واضح، حيث أن خلية مطرح الخضراء وبطني العصبية عبر الحبل على بقية الجسم. تلوين الخلفية عالية هي أيضا واضحة مع CY3-phallodin. هذه السلالة يعبر عن VHA-8 :: البروتين GFP الانصهار، وتقع في الغالب في الخلية مطرح. الصور هي التوقعات القصوى لسلسلة من الصور متحد البؤر التي امتدت إلى سطح الشريحة (مما يؤدي إلى ارتفاع تلوين الخلفية)؛ شريط النطاق هو 50 ميكرون.

Discussion

بروتوكول تكسير تجميد هي واحدة من عدة طرق لتلوين الأجسام المضادة في C. ايليجانس. وهو يوفر وسيلة بسيطة نسبيا وصمة عار الديدان، ولكن لا تتطلب الكواشف محددة وممارسة لأفضل النتائج. الخطوات الحاسمة (المبين في الشكل 1) ما يلي: 1) إعداد الشريحة (انظر الخطوات 1 و 2) ضغط يدوي من الديدان الخيطية (انظر الخطوات 2 و 3) التثبيت السريع (راجع الخطوة 3). أولا، لتحقيق أقصى قدر من الالتصاق من الديدان الخيطية على الشرائح، فمن الأفضل لإعداد الشرائح مع ارتفاع الوزن الجزيئي (بوليمر طويلة) متعدد الليزين، بدلا من الاعتماد على الشرائح المحضرة بشكل تجاري. والمغلفة الشرائح التجارية مع متعدد الليزين للسماح للخلايا التمسك، في حين تم تصميم الشرائح تكسير تجميد التمسك بشرة من الديدان الخيطية بأكمله. الثاني، إجراء للضغط الصحيح من الديدان بين الشرائح قبل تجميد أمر بالغ الأهمية. فإنه يتطلب اليدين وممارسة ثابتة للضغط على الشرائح معا باستخدام المبلغ الصحيح للالضغط بحيث الديدان الفردية الاتصال سواء الشرائح دون تدمير التشكل. إما كثيرا أو قليلا جدا ضغط يؤدي إلى زيادة فقدان الديدان أثناء التثبيت. هناك حاجة إلى مزيد من الرعاية لتحريك الشرائح على سطح المبرد الثلج الجاف لتجميد دون تحريك الشرائح بالنسبة إلى بعضها البعض. فإن أي اقتراح من هذا القبيل تسبب الديدان المسيل للدموع أو تحريف. الثالث، كما هو الحال مع أي تقنية التثبيت، يجب وضع الديدان المجمدة مباشرة في تثبيتي قبل إزالة الجليد. خلاف ذلك، مستضد قد نشر، وتوفير معلومات مضللة حول توطين التحت خلوية. إذا فعلت كل هذه الخطوات الحاسمة بشكل صحيح، للحصول على أفضل النتائج فإنه لا يزال من الضروري تفحص عدة شرائح الملون للعثور على الديدان مع أفضل التشكل.

جانب واحد لا مفر منه من هذه التقنية هو أن الديدان سوف يتم ضغطها في بعد واحد. الضغط هو أكثر ما يلفت الانتباه لدى البالغين، حيث القطر الظاهري للجسم جولة في محور ض قد تكون فقط 1-4عشر أن ينظر في س و ص محاور. هذا الضغط يميل إلى الانخفاض في اليرقات الصغيرة، ويمكن أن تكون ضئيلة في الأجنة. ويرجع ذلك إلى الطريقة التي تتحرك الديدان الخيطية تعيش أثناء إعداد الشرائح، الديدان الملون وغالبا ما تكون على الجانبين. هذا يحاكي التوجه من الديدان على أطباق أجار، مع خط الوسط الجانبي الكذب تمتد إلى أسفل منتصف الدودة الملون (أنظر الشكلين 2-4). وبالتالي، فإن ضغط عموما في البعد الأفقي. في حين أن هذا الواقع يجعل المجهر الفلورسنت القياسية أسهل (أكثر من عينة سيكون التركيز في نفس الوقت)، فهذا يعني أن إعادة البناء 3-D لن تكون دقيقة.

كما هو الحال مع أي تلطيخ الضد، فمن المهم للتحقق خصوصية ملزمة. في معظم الأنواع، ويتم ذلك عن طريق فرض ضوابط مثل تقارب المستنفدة الضد الخاص بك أو استخدام أي الابتدائية. في C. ايليجانس، وسائل أكثر تحديدا من التحقق من وجود خصوصية تتوفر في كثير من الأحيان. المسوخ فارغة لهذا الجين والبروتين من الفائدة تقديمعنصر تحكم ممتازة لتلطيخ خصوصية. ينبغي أن تكون ثابتة على حد سواء سلالات في ظل ظروف مماثلة قبل المقارنة، منذ تلطيخ عادة ما تعتمد التثبيت. إذا لم يكن هناك متحولة فارغة متوفرا، ثم أنه من السهل نسبيا في C. ايليجانس إلى انخفاض مستويات البروتين مع رني (الحمض النووي الريبي تثبيط ¹²⁾ والبحث عن تلطيخ انخفضت في رني الديدان المعالجة.

غالبا ما تظهر الأجسام المضادة تلطيخ غير محددة، حتى لو تنقية تقارب مع المستضد. في كثير من الأحيان، تثبيت الضوء باستخدام الميثانول والأسيتون (التي إصلاح البروتينات التي كتبها عجل لهم بدلا من يشابك منهم) يعطي أقل تلطيخ غير محددة من الفورمالديهايد أو غلوتارالدهيد (التي تولد أكثر الحواتم البديل بسبب المتنوعة عبر ربط) ^1،11. ومع ذلك، في C. ايليجانس تلطيخ غير محددة أمر شائع جدا تحت أي ظرف التثبيت، وخاصة في القناة الهضمية. إذا تم أعرب المستضد الخاص في القناة الهضمية، ثم وهذا تلطيخ غير محددة قد تخفي staini المحددة الخاصة بكنانوغرام. إذا هي المسوخ فارغة المتاحة للبروتين الخاص بك، ثم الديدان ثابتة مع هذه الطريقة يمكن استخدامها لبصلتها تستنزف المصل الخاص بك. منذ استضداد يعتمد على الظروف التثبيت، والديدان التي تستخدمها لتستنزف الأجسام المضادة الخاصة بك ينبغي أن تكون على استعداد في نفس الطريقة كما في البرية من نوع الديدان كنت تلطيخ. بعد جولة واحدة من استنزاف تلطيخ غير محددة، متحولة والبرية من نوع الديدان يمكن أن تكون ملطخة بالتوازي مع المصل المنضب لعنصر تحكم ممتازة. جولة إضافية من استنزاف مع المسوخ يمكن القيام به حسب الضرورة.

هذه التقنية مفيدة جدا لاختبار الأجسام المضادة الجديدة لتلطيخ محددة في إطار مجموعة من الشروط. قد تكون هذه الأجسام المضادة الناتجة ضد C. ايليجانس البروتينات أو الأجسام المضادة الناتجة ضد بروتينات حفظها من الأنواع الأخرى. في حين أن هذا الأسلوب يعطي أفضل التشكل مع الديدان الخيطية الثابتة طفيفة، وهو بسيط نسبيا لمحاولة مجموعة من مثبتات لتحديد أي ظروف، إن وجدت، وإعطاء نتيجة محددةق. خلافا لأساليب أخرى لتثبيت الثابت باستخدام الفورمالدهيد أو غلوتارالدهيد، الأنزيمية أو الحد من العلاجات ليست هناك حاجة لإعداد العينة. منذ هذه العلاجات قد يقلل استضداد، وهذا يزيد من القدرة على تحديد الأجسام المضادة المحددة وشروط التثبيت الأمثل لها. إذا كانت الظروف الصعبة التثبيت تعمل بشكل أفضل، ويمكن المجرب ثم أنتقل إلى أساليب أجريت على الديدان سليمة للحصول على أفضل مورفولوجيا (تلخيص عملنا في السابق ^4). إذا تثبيت ضوء يحفظ استضداد، ثم يمكن استخدام هذه التقنية لجميع تلطيخ لمزيد من المجهر الضوئي.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
poly-L-lysine slide (ESCO brand)	Fisher	12-545-78	Sigma brand slides also suitable
poly-L-lysine hydrobromide	Sigma	P1524	IMPORTANT: Brand and high molecular weight of polylysine critical
single frosted edge slides	Fisher	48312-002	Other brands are suitable
sodium azide	Sigma	S2002-25G	TOXIC, wear gloves and mask while weighing out powder to make 10% stock. Wear gloves when pipeting stock solution
coplin staining jar	VWR	47751-792	Other brands are suitable
5-slide mailer	Electron Microscopy Science	71549-01	One of many different brands of small slide holder, suitable for staining
Paraformaldehyde	VWR	MK262159	IMPORTANT: Regular formalin solutions (37% formaldehyde) are NOT suitable. Either 1) Dissolve crysatlaline paraformaldehyde in phosphate buffer and store in small aliquots frozen. Or 2) buy electron microscopy grade paraformaldehyde in aliquots. TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.
Glutaraldehyde solution, 25% in water	Sigma	G 5882	IMPORTANT: purchase electron microscopy grade glutaraldehyde in ampules; TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.
Triton X-100	VWR	EM-9410	Other brands are suitable
Bovine Serum Albumin	Fisher	ICN820451	Other brands are suitable
Donkey Serum, lyophilized	Jackson Immunoresearch	017-000-121	Other brands are suitable
Cy3 Donkey anti-Mouse IgG multi-labeling	Jackson Immunoresearch	715-165-150	This company is recommended for high quality multi-label (affinity depleted) antibodies. Select appropriate dye and antigen (animal used to raise primary antibody).
n-propyl gallate	Fisher	ICN10274750	Other brands are suitable
DAPI, 4’,6’-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride	Sigma	D 9542	TOXIC. Wear gloves and dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure
Whatman #1 15 cm diameter filters	Fisher	09805G
Coverslip #1 1/2 rectangle 24 x 60 mm	VWR	48393-252	#1 1/2 thickness is optically best
Microscope slide folder	VWR	48429-092	Other brands are suitable