Tinción de anticuerpos en C. Elegans Uso de "Freeze-Cracking"

Summary

"Freeze-craqueo," un método para exponer los tejidos internos del nematodo C. elegans a anticuerpos para la localización de proteínas, se demuestra.

Abstract

Para la tinción de C. elegans con anticuerpos, la cutícula relativamente impermeable deben ser anuladas por métodos químicos o mecánicos. "Freeze-cracking" es un método utilizado para extraer físicamente la cutícula de los nematodos mediante la compresión de nematodos entre dos diapositivas adherentes, la congelación, y tirando de las diapositivas aparte. Freeze-craqueo proporciona una manera simple y rápida para obtener acceso a los tejidos sin tratamiento químico y se puede utilizar con una variedad de fijadores. Sin embargo, conduce a la pérdida de muchas de las muestras y la compresión requerida distorsiona mecánicamente la muestra. Se requiere práctica para maximizar la recuperación de muestras con buena morfología. Freeze-craqueo puede ser optimizado para condiciones específicas de fijación, de recuperación de muestras, o bajo la tinción no específica, pero no para todos los parámetros a la vez. Para los anticuerpos que requieren fijación de condiciones muy duras y toleran los tratamientos químicos necesarios para permeabilizar químicamente la cutícula, treatmenpuede ser preferido t de nematodos intactas en solución. Si el anticuerpo requiere una solución más ligero o si las condiciones óptimas de fijación son desconocidos, congelar-craqueo proporciona una manera muy útil para ensayar rápidamente el anticuerpo y puede proporcionar información específica de localización subcelular y celular para el antígeno de interés.

Introduction

Para determinar la localización celular y subcelular de las proteínas, los científicos han denominado tradicionalmente tejidos con anticuerpos seleccionados para reconocer específicamente las proteínas particulares ^1. En algunos organismos modelo como C. elegans, tinción de anticuerpos a menudo ha sido sustituido por técnicas genéticas moleculares, que dan resultados más rápidamente. Estos incluyen los organismos de transformación con constructos que consisten en fusiones de genes entre el promotor y las regiones codificantes del gen de interés y la proteína fluorescente verde. Sin embargo, las técnicas moleculares están sujetas a una serie de art....

Protocol

NOTA: los pasos de protocolo múltiple se presentan con opciones para la puesta a punto y preparación en función de las condiciones específicas del experimento. Para estos casos, pasos alternativos se presentan como A, B, C, etc El protocolo con pasos alternativos se describe en la Figura 1.

1. Preparación del portaobjetos recubiertos Polilisina

Se dispone de tres tipos diferentes de diapositivas, dependiendo del equilibrio deseado entre la facilidad de preparación, la adhesión relativa y la unión no específica del anticuerpo. Detalles de alternativas de preparación de portaobjetos se da....

Results

Cuando los gusanos se comprimen correctamente, agrietados, y ligeramente fijos, prácticamente todo el gusano puede ser accesible para la tinción de anticuerpos (ver Figura 2). La ubicación de los núcleos, como se indica por la tinción DAPI indica qué partes del gusano están intactos Cuando los gusanos se someten a un fijador más duro, tal como formaldehído, la morfología del gusano puede distorsionarse (como se ve por la aparición no natural ondulado de la músculos de las figuras 3A-D)........

Discussion

El protocolo de congelación de craqueo es uno de varios métodos para la tinción de anticuerpos en C. elegans. Proporciona una manera relativamente fácil de manchar los gusanos, pero requiere de reactivos específicos y práctica para obtener resultados óptimos. Los pasos críticos (descritos en la Figura 1) son: 1) la preparación de diapositivas (consulte los pasos 1 y 2) la compresión manual de los nematodos (consulte los pasos 2 y 3) de fijación rápida (ver paso 3). En primer lugar, para maximiz.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
portaobjetos de poli-L-lisina (marca ESCO)	Fisher	12-545-78	Los portaobjetos de la marca Sigma también son adecuados
el hidrobromuro de poli-L-lisina	Sigma	P1524	IMPORTANTE: Marca y alto peso molecular de los portaobjetos de borde esmerilado único crítico de polilisina
	Fisher	48312-002	Otras marcas son adecuadas
azida de sodio	Sigma	S2002-25G	TOXIC, use guantes y mascarilla mientras pesa el polvo para hacer un 10% de caldo. Use guantes cuando pipetee la solución madre
frasco de tinción coplin	VWR	47751-792	Otras marcas son adecuadas
Sobre de 5 portaobjetos	Microscopía Electrónica Science	71549-01	Una de las muchas marcas diferentes de portaobjetos pequeño, adecuado para teñir
Paraformaldehído	VWR	MK262159	IMPORTANTE: Las soluciones regulares de formalina (37% de formaldehído) NO son adecuadas. 1) Disolver el paraformaldehído crisatlano en tampón de fosfato y almacenar en pequeñas alícuotas congeladas. O 2) comprar paraformaldehído de grado de microscopía electrónica en alícuotas. TÓXICO -use guantes; Deseche el exceso de plumón del fregadero con agua.
Solución de glutaraldehído, 25% en agua	Sigma	G 5882	IMPORTANTE: comprar glutaraldehído de grado de microscopía electrónica en ampollas; TÓXICO -use guantes; Deseche el exceso de plumón del fregadero con agua.
Triton X-100	VWR	EM-9410	Otras marcas son adecuadas
Albúmina sérica bovina	Fisher ICN820451		Otras marcas son adecuadas
Suero de burro, liofilizado	Jackson Immunoresearch	017-000-121	Otras marcas son adecuadas
Cy3 Donkey anti-Mouse IgG multi-marcaje	Jackson Immunoresearch	715-165-150	Esta empresa está recomendada para anticuerpos multi-etiqueta (afinidad depleida) de alta calidad. Seleccione el colorante y el antígeno apropiados (animal utilizado para producir anticuerpos primarios).
galato de n-propilo	Fisher	ICN10274750	Otras marcas son adecuadas
DAPI, 4',6'-diamidino-2-fenilindol diclorhidrato	Sigma	D 9542	TOXIC. Use guantes y dispense en pequeñas alícuotas y se mueva para minimizar la exposición
Whatman #1 filtros de 15 cm de diámetro	Fisher	09805G
Coverslip #1 1/2 rectángulo 24 x 60 mm	VWR	48393-252	#1 1/2 de grosor es ópticamente mejor
Carpeta de portaobjetos de microscopio	VWR	48429-092	Otras marcas son adecuadas