Antibody colorazione in Published: October 14, 2013 doi: 10.3791/50664

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Janet S. Duerr¹

¹Department of Biological Sciences, Ohio University

Summary

"Freeze-cracking," un metodo per esporre i tessuti interni del nematode C. elegans di anticorpi per la localizzazione delle proteine, è dimostrata.

Abstract

Per macchiare C. elegans con anticorpi, la cuticola relativamente impermeabile devono essere aggirati con metodi chimici o meccanici. "Freeze-cracking" è un metodo utilizzato per estrarre fisicamente la cuticola da nematodi comprimendo nematodi tra due diapositive aderenti, il congelamento, e tirando le diapositive a parte. Freeze-fessurazione fornisce un modo semplice e rapido per ottenere l'accesso ai tessuti senza trattamenti chimici e può essere utilizzato con una varietà di fissativi. Tuttavia, porta alla perdita di molti dei campioni e la compressione richiesta distorce meccanicamente il campione. La pratica è necessaria per massimizzare il recupero di campioni con buona morfologia. Freeze-fessurazione può essere ottimizzato per le condizioni specifiche di fissazione, recupero di campioni, o bassa colorazione non specifica, ma non per tutti i parametri contemporaneamente. Per gli anticorpi che richiedono condizioni di fissazione molto duri e tollerano i trattamenti chimici necessari per permeabilize chimicamente la cuticola, treatment di nematodi intatte in soluzione può essere preferito. Se l'anticorpo richiede una correzione chiara o se le condizioni ottimali di fissaggio sono sconosciute, liofilizzazione di cracking fornisce un modo molto utile per saggiare rapidamente l'anticorpo e può produrre specifiche informazioni di localizzazione subcellulare e cellulare per l'antigene di interesse.

Introduction

Per determinare la localizzazione cellulare e subcellulare di proteine, gli scienziati hanno tradizionalmente etichettati tessuti con anticorpi selezionati per riconoscere specificamente particolari proteine ^​​1. In alcuni organismi modello come C. elegans, colorazione anticorpale è stato spesso sostituito da tecniche genetiche molecolari, che danno risultati più rapidamente. Questi includono organismi trasformante con costrutti costituiti da fusioni geniche tra il promotore e regioni codificanti del gene di interesse e proteina fluorescente verde. Tuttavia, le tecniche molecolari sono soggette a una serie di manufatti, compresi i problemi connessi conoscere il vero promotore e cambiamenti nell'espressione di costrutti ad alto numero di copie (le usuali tecniche di C. elegans) ^2,3. Pertanto, la colorazione con anticorpi rimane un obiettivo per molti scienziati che studiano la funzione delle proteine ​​in vivo.

Colorazione tessuti con anticorpi può essere difficile, in quanto untibodies possono riconoscere solo la loro antigene in una particolare conformazione ^1. Ad esempio, gli anticorpi possono riconoscere solo antigene denaturato o intatta fissato in modo particolare e non possono riconoscere l'antigene in situ. Il problema di colorazione anticorpale nei nematodi è aggravata dal fatto che la cuticola del nematode forma una barriera relativamente impermeabile, bloccando l'accesso di anticorpi ai tessuti.

Ci sono diversi metodi utilizzati per la colorazione degli anticorpi in C. elegans (recensito nel nostro precedente lavoro ^4). Per macchiare intatti 'vermi, «metodi sono stati sviluppati per congelare e scongelare in un fissativo relativamente dura (formaldeide o glutaraldeide), i cicli di gelo-disgelo contribuiscono a rompere la cuticola per consentire una rapida penetrazione del fissativo ^5. Dopo la fissazione, la cuticola stata permeabilizzate per consentire la penetrazione dell'anticorpo; metodi inclusi il trattamento con agenti riducenti, collagenasi, o entrambi ^5-7. Queste treatments conservati morfologia, ma spesso ridotti o distrutti riconoscimento anticorpale. Metodi alternativi includono dissezione ⁸ per consentire la penetrazione anticorpo.

"Freeze-cracking" è un modo per ottenere l'accesso all'interno del verme semi-intatte per consentire colorazione anticorpale ^9-10. Freeze-fessurazione può essere eseguita con una varietà di condizioni di fissaggio evitando trattamenti collagenasi e di riduzione. I nematodi sono posti tra due adesivi diapositive, congelati e quindi i vetrini sono separati, lasciando la maggior parte del nematode sul vetrino fondo e gran parte della cuticola sulla slitta superiore. La slitta inferiore può essere posizionato in fissativo e l'intera diapositiva da nematodi aderito viene trasferita attraverso la procedura di colorazione anticorpale. Il metodo non presentano due grandi difficoltà. In primo luogo, è difficile applicare la giusta quantità di pressione necessaria per dividere i nematodi senza deformarli seriamente. In secondo luogo, molti dei vermi non sarà stick a uno scivolo, e sarà perso nel fissativo o risciacqui. Tuttavia, con le diapositive e prassi corrette, il metodo rapidamente produrre nematodi con ragionevole morfologia che può essere utilizzato con una vasta gamma di fissativi e anticorpi.

Il metodo può essere leggermente variato, a seconda della porta dello sperimentatore. Se si desidera una colorazione di singoli nematodi (ad esempio per determinare se un singolo trasformante ha modificato colorazione anticorpale), poi scivola con adesione massima (ma superiore colorazione di fondo) può essere utilizzato, ad esempio diapositive-laboratorio preparati con polilisina supplementare (vedi sotto). Per formaldeide o fissazione glutaraldeide, diapositive di adesione superiori (slides polilisina-laboratorio preparati) devono essere utilizzati, dal momento che i nematodi aderiscono più male di polilisina dopo queste fissazioni. Se wild-type nematodi sono stati fissati con metanolo e / o acetone, poi scivola con l'adesione sempre più in basso la colorazione di fondo deve essere utilizzato (commerciale oppure lvetrini aboratory preparati). Se una varietà di anticorpi e fissativi sono utilizzati nel laboratorio, una selezione di diapositive può essere preparato in anticipo e conservato fino al momento dell'uso.

Dopo l'accesso al tessuto nematode è stata acquisita, le procedure di anticorpi colorazione seguono metodi standard (con incubazione più caratteristici dei tessuti, piuttosto che le cellule ^1,11).

Protocol

NOTA: Più passaggi di protocollo vengono presentati con opzioni per set-up e la preparazione a seconda delle specifiche condizioni dell'esperimento. Per questi casi, passaggi alternativi vengono presentati come A, B, C, ecc Il protocollo con la procedura alternativa è illustrato in Figura 1.

1. Preparazione di diapositive Polilisina rivestite

Tre diversi tipi di diapositive possono essere utilizzati a seconda del compromesso desiderato tra facilità di preparazione, relativa adesione, e il legame non specifico dell'anticorpo. Dettagli di alternative preparazione dei vetrini sono riportati alla procedura 1A-1C in ordine crescente di adesione e complessità. Preparato da questi diversi metodi possono essere utilizzati insieme per un singolo esperimento.

1A. Nessuna preparazione del vetrino

Disponibili in commercio polilisina rivestita diapositive forniscono bassa adesione e basso fondo.

1B. Presentazione preparation ottimale per la fissazione metanolo, acetone

Adesione media e bassa priorità bassa.

1. Preparare una soluzione di polilisina per immergendo i vetrini: Aggiungere 400 mg di peso molecolare molto elevato (150.000 - 300.000 D) poli-L-lisina per 200 ml di acqua distillata. Aggiungere 2 ml di 10% di sodio azide magazzino (concentrazione finale 0,1%) come conservante. ATTENZIONE: secco sodio azide è reattivo e tutte le forme sono tossici. Indossare una maschera e guanti, mentre la polvere di peso per rendere il 10% stock in acqua bidistillata.
2. Pulire singolo end lastre di vetro smerigliato con salviette privo di lanugine, macchie rimozione e particelle. Questo dovrebbe essere fatto anche su vetrini acquistati con la denominazione "predepurata".
3. Collocare i vetrini back-to-back in un supporto di diapositive, vaschetta Coplin o altro contenitore di diapositive colorazione, mantenendo i bordi satinati e non del tutto perfettamente allineate (per rendere più facile la separazione in seguito). Mettere titolare fetta in coppa con il 70% di etanolo (alcool grado reagente non necessario) con 1% di HCl in diacqua calmato o compilare vaschetta di colorazione a livello di glassa. Roccia vetrini in soluzione per un minimo di 5 min. ATTENZIONE: Questa soluzione è corrosiva, indossare guanti. NOTA: Questa soluzione può essere riutilizzato più volte (fino a diversi mesi).
4. Sciacquare i vetrini in acqua distillata per 1 min.
5. Diapositive asciugare completamente in un ambiente privo di polvere o mettendo in forno a 40-60 ° C per 30-60 minuti o mantenendo notte a temperatura ambiente.
6. Incubare i vetrini in soluzione polilisina (che comprende parti unfrosted) il rocker per 15 min.
7. Ripetere l'asciugatura dei vetrini.
8. Ripetere polilisina soluzione di incubazione e fasi di essiccazione.
9. Separare le diapositive utilizzando un oggetto metallico sottile come una spatola di pesatura sottile. Se sono correttamente rispettate, sono difficili da separare. Indossare appropriato equipaggiamento di sicurezza (occhiali) e lavorare su carta da banco (deve essere scartata dopo l'uso), dal momento che piccoli frammenti di vetro possono volare sciolto quando le diapositive sono separati.
10. Conservare i vetrini in pulito(Privo di polvere), box scorrevole a 4 ° C fino al momento dell'uso.

1C. Far scorrere una preparazione ottimale per la fissazione di formaldeide

Massima adesione ma di alta sfondo.

1. Collocare i vetrini preparati con il metodo 1B appartamento in una pirofila-safe senza polvere (per l'asciugatura in forno) o su una superficie piatta priva di polvere (per l'essiccazione all'aria).
2. Mettere una goccia 20-60 ml di soluzione di polilisina al centro di ogni diapositiva.
3. Diapositive asciugare completamente in forno oppure a temperatura ambiente. Il polilisina si lascerà alle spalle ovali pallidi man mano che evapora. Questi ovali sono molto adesivo. Purtroppo, anche legano agli anticorpi primari e secondari, anche dopo il blocco.
4. Conservare i vetrini in pulito casella di scorrimento (senza polvere) a 4 ° C fino al momento dell'uso.

2. Preparazione del congelato Nematode Slides

Preparare nematodi per la colorazione da risciacquo completamente privo di batteri utilizzando il metodo 2A (per le piastre di nematodi) o2B (per singoli nematodi).

2A. Preparazione delle diapositive da lastre di nematodi

1. Posizionare un pezzo di metallo in ghiaccio secco a pre-raffreddamento.
2. Utilizzare acqua distillata e una pipetta di vetro (diminuisce la perdita di vermi) o micropipetta per sciacquare i vermi da piastra NGM con i batteri in una provetta per microcentrifuga da 1,5 ml. Le piastre possono essere sincronizzati o mescolati età, non utilizzare piatti con molti dauers (difficili da decifrare) o vermi affamati (aumento di autofluorescenza) a meno necessario.
3. Sciacquare i vermi a 3 4x con acqua distillata fino priva di batteri. (Per diminuire la perdita di vermi utilizzare la stessa pipetta di vetro.) Per far sedimentare i vermi, né lasciarli seduti in panchina per 3-5 minuti (per raccogliere lo più gli adulti sul fondo della provetta) o girare 30 secondi a ~ 1.000 giri (~ 500 g) in una centrifuga da tavolo (per raccogliere gli adulti, larva, ed embrioni).
4. Rimuovere la maggior parte dell'acqua dal tubo di vermi, lasciando circa il doppio del volume di acqua come vermi (ma almeno 25 pl di volume totale).
5. Avere un numero uguale di regolari (ripulito ma non trattati polilisina) slides "top" disponibili.
6. Posto ~ 25 microlitri vermi in acqua su "basso" scivolo aderente e diffondere il liquido contenente i vermi sulla porzione centrale della slitta utilizzando il lato della punta della pipetta.
7. Lasciate che i vermi accontentarsi di 30 sec a 2 min. Se la diapositiva è opportunamente appiccicoso, le estremità dei vermi si attaccano come contattare la diapositiva.
8. Tenere la slitta inferiore in una mano e posizionare la slitta superiore sul vetrino fondo in modo che tutte le parti gelate ma si sovrappongono. Il liquido dovrebbe mantenere le diapositive leggermente divaricate, in modo che i vermi ancora si muovono leggermente Non lasciate che i vetrini scivolare uno sopra l'altro -. Questa stravolge i vermi.
9. Premere delicatamente verso il basso sleggermente sulla slitta superiore, utilizzando il pollice e l'indice di ciascuna mano. Con la quantità ideale di pressione, alcune delle più grandi ermafroditi sul bordo delle slitte si romperà, mentre la maggior parte degli adulti e delle larve saranno contattare ciascun vetrino ma rimarrà intatta.
10. Immediatamente e accuratamente (senza scivolare) mettere i vetrini sul pezzo di metallo in ghiaccio secco. I vetrini devono apparire congelato entro un minuto. Continuate a ghiaccio secco per 5 minuti fino al completo congelati.
11. A questo punto, i vetrini possono essere conservati in un contenitore etichettato a -80 ° C per diversi giorni. (Se sono tenuti settimane a -80 ° C, l'acqua inizierà a sublimare via e vermi non macchia pure). Se i vetrini vengono conservati a -80 ° C, far loro 'riscaldano' in ghiaccio secco per 10 minuti prima di cracking.
12. Passare al punto 3 (fissazione).

2B. Preparazione di diapositive di singoli nematodi

1. Posizionare un pezzo di metallo in ghiaccio secco a preccollina.
2. Utilizzare un pick worm per trasferire singoli nematodi ad una goccia d'acqua su una piastra NGM per liberarli dai batteri. Nematode (s) deve essere ben nutrito per diminuire autofluorescenza, se possibile. Ripetere il trasferimento di nuove macchie di acqua se necessario fino a vite senza fine (s) sono privi di batteri.
3. Etichettare lato opaco dei "peggiori" scivola polilisina con indelebili scivoli inchiostro e posto sul bancone accanto al contenitore con ghiaccio secco, etichetta verso l'alto. Avere un numero uguale di meno aderente "top" (non trattati) slides disponibili.
4. Collocare un 5-10 microlitri goccia d'acqua sulla regione della slitta inferiore doppio trattato con polilisina. Utilizzare il volume maggiore se il trasferimento più vermi, per evitare che l'acqua evapori prima del completamento.
5. Trasferire il worm (s) alla goccia d'acqua con il pick verme, utilizzando il microscopio a guardare come i vermi affondano a toccare la superficie del vetrino appiccicosa. Trasferimento da un minimo di un worm di ben 20 + vermi a goccia.
6. Tenere le s fondolide in una mano e posizionare la slitta superiore sul vetrino fondo in modo che tutte le parti gelate ma si sovrappongono.
7. Immediatamente e con attenzione (senza scivolare o comprimere) mettere le diapositive sul pezzo di metallo in ghiaccio secco. Tenere in ghiaccio secco per 5-30 min. (Non conservare queste diapositive a lungo termine, come le diapositive facilmente asciugare.)
8. Passare al punto 3 (fissazione).

3. Fissazione

Fissativi sono necessarie per 'fix' l'antigene nel posto nella cella, da una precipitante ("fissazione luce") o cross-linking ("fissazione duro") l'antigene. Fissazione può interrompere antigenicità; anticorpi più conosciuti funzionano meglio con una particolare condizione di fissazione. Per i nuovi anticorpi, una serie di condizioni di fissaggio deve essere testato.

Per qualsiasi fissaggio, il primo passo è quello di rendere soluzione salina tamponata con fosfato. Prossime diapositive fix nematodi per gli anticorpi colorazione utilizzando il metodo A (lucefissare con metanolo e acetone) o B (fix più difficile con formaldeide o glutaraldeide).

1. Preparare una sterile 10x PBS (tampone fosfato) stock soluzione aggiungendo 80 g di NaCl, 2,0 g KCl, 27,2 g di Na ₂ HPO ₄ • H ₂ 0, 2,4 g di KH ₂ PO _4, 20 ml al 10% di sodio azide magazzino. Per rendere questa soluzione, pesare sodio azide polvere per rendere soluzione al 10% in acqua bidistillata. Mescolare salina con calore dolce fino alla dissoluzione. ATTENZIONE: secco sodio azide è reattivo e tutte le forme sono tossici. Indossare una maschera e guanti quando si lavora con azide di sodio secco o soluzioni.
2. Sia salina fredda (Tris pH è sensibile alla temperatura), quindi il pH a 7.2 con 1-10 M NaOH. Top a 1 L con acqua bidistillata e autoclave per la sterilizzazione. Conservare a temperatura ambiente e portare a 1x, se necessario, con acqua distillata doppio sterile. ATTENZIONE: NaOH è caustico - indossare guanti durante l'uso.

3A. Fix luce utilizzando metanolo-acetone

1. Mettere metanolo 100%, 100% acetone, e 1x tampone fosfato salino (PBS) in vaschette per colorazione di pre-raffreddamento in ghiaccio per almeno 10 min. ATTENZIONE: metanolo e acetone sono tossici, indossare i guanti.
2. Prendete un paio di inferiore e superiore diapositive dal ghiaccio secco, rapidamente li torcere a parte, e immergere subito la diapositiva "dal basso" in ghiaccio metanolo freddo per 2 min. La slitta "top" può essere scartata.
3. Trasferire i vetrini da metanolo per ghiaccio acetone freddo per 4 min. Se i vetrini avevano molti vermi, la maggior parte (90%) si cadere nella correzione, anche con le diapositive meglio preparati. Se i vetrini singoli vermi sono stati adeguatamente preparati, i vermi dovrebbero rimanere aderito.
4. Posizionare o immergere i vetrini nel vaso con PBS (per risciacquare fissativo) e passare al punto 4 (colorazione).

3B. Fix duro con formaldeide o glutaraldeide

1. Diluire grado di formaldeide reagente o soluzione di glutaraldeide in PBS 1x a concentrazione finale 0,5-4%. Aliquote (1,5 ml) may essere conservato ben chiuso a -20 a -30 ° C; scongelare aliquote su ghiaccio poco prima dell'uso. NOTA: Le soluzioni di formaldeide degradano nel tempo e con l'esposizione all'aria. ATTENZIONE: formaldeide e glutaraldeide sono tossici, indossare guanti e lavorare nel cappuccio.
2. Prendete un paio di inferiore e superiore diapositive dal ghiaccio secco, rapidamente li torcere a parte, e collocare immediatamente l'slide "basso" con i vermi nel piatto piatto con coperchio. (La slitta superiore può essere scartato).
3. Pipettare immediatamente 200 microlitri fissativo tossico sul centro della superficie del vetrino con vermi. Il fissativo sarà parzialmente congelare sul posto, poi sciogliere per coprire una regione più ampia della diapositiva.
4. Se i vermi non sono totalmente coperti con fissativo, immediatamente e accuratamente aggiungere più fissativo utilizzando una micropipetta. Non permettere fissativo di scendere oltre il bordo della diapositiva.
5. Coprire il piatto con un coperchio e lasciar riposare per 10 minuti durante la notte a temperatura ambiente. Assicurarsi che il piatto viene umidificata se incubazione più lunghi are usata - questo può essere fatto con l'aggiunta di salviette filacciosi bagnato piegati al piatto. Non lasciate che le salviettine toccare le diapositive.
6. Dopo la fissazione è completa, pipetta accuratamente il fissativo con i vermi sciolti in una provetta da 1,5 ml e immergerlo in una vaschetta di colorazione con PBS.
7. Gira il tubo con i vermi che venivano sciolti ad alta velocità per 30 secondi a pellet. Risciacquare i vermi due volte con PBS, poi elaborare in parallelo con i vermi sui vetrini (facendo passi in provette per microcentrifuga, piuttosto che sui vetrini).
8. Passare al punto 4 (colorazione).

4. Anticorpo colorazione

Il protocollo di colorazione anticorpale è simile ai protocolli standard per qualsiasi tessuto su vetrini. Questo protocollo è uguale per tutte le diapositive indipendentemente dalla preparazione nei passaggi 1-3.

1. Preparare Antibody Buffer miscelando 700 ml di acqua bidistillata, 100 ml 10x PBS, 5 ml di Triton X-100 (0,5% finale), 2 ml di 0,5 M EDTA pH 8 (1 mM finale), 1 g BSA (0,1% finale), 5 ml 10% az sodiosoluzione ide (0,05% finale). pH a 7.2 con HCl, quindi aggiungere acqua bidistillata a 1 L; conservare a 4 ° C.
2. Preparare Block ricostituendo siero asino con acqua bidistillata, quindi aggiungendo siero 5 ml a 45 ml di tampone di anticorpo (siero finale 10%).
3. Preparare primarie e secondarie soluzioni di anticorpi diluendo nel tampone dell'anticorpo più 1% BSA. Diluizioni consigliate sono 1:50-1:2,000 per gli anticorpi primari e 1:1,000-1:5,000 per anticorpi secondari (Cy3or OG488 anticorpi asino coniugati contro le specie utilizzate per sollevare anticorpo primario).
4. Preparare DAPI magazzino mescolando 2,5 mg / ml in acqua bidistillata; negozio in 8 microlitri aliquote congelate a -30 ° C. ATTENZIONE: DAPI è un colorante legame al DNA tossici, indossare i guanti durante la pesatura e dosaggio in aliquote.
5. Preparare 10 ml Piano di montaggio, mescolando 200 mg n-propile gallato, 0.3 ml di 1 M Tris pH 9, 2.7 ml di acqua distillata in una provetta da 15 ml. Riscaldare a 65 ° C per circa 10 minuti fino a completa dissoluzione.Aggiungere 7 ml di glicerolo e un'aliquota 8 ml di DAPI e vortex bene. Medio Aliquota in provette da 1,5 ml, avvolgere in un foglio, e conservare al buio a 4 ° C (sia aria e luce degradano il medium - se diventa più giallo, scartare nei rifiuti Biohazard). ATTENZIONE: n-propil gallato è un reattivo anti-ossidante, indossare guanti durante la pesatura.
6. Trasferire i vetrini in una vaschetta di colorazione con il blocco per 1 ora a temperatura ambiente o una notte a 4 ° C (durante la notte preferibile per il disco fisso). Evitare di agitazione per evitare di perdere i vermi.
7. Trasferire i vetrini per la colorazione vaso con anticorpo primario o mettere i vetrini appartamento in un piatto umidificata e top ciascuno con 100-500 anticorpo primario microlitri. Incubare i vetrini una notte a 4 ° C senza agitazione.
8. Dopo l'anticorpo primario incubazione, trasferimento scivola alle macchie barattolo di PBS.
9. Filtro di blocco tramite imbuto foderato con carta da filtro e conservare a 4 ° C; se sterili filtrati ogni 1-2 settimane, Block può essere riutilizzato per uno o più mesi. Allo stesso modo, filtrare e salvareanticorpo primario a 4 ° C per il riutilizzo (fino a 10 o più giri di colorazione).
10. Sciacquare i vetrini tre volte (~ 20 min ciascuna) in tampone dell'anticorpo.
11. Porre i vetrini in anticorpo secondario in un contenitore a tenuta di luce di colorazione e incubare 4 ore a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C.
12. Trasferire i vetrini per la colorazione barattolo di PBS. Filtro e salvare anticorpo secondario a 4 ° C per il riutilizzo (fino a 10 o più giri di colorazione).
13. Sciacquare i vetrini tre volte (~ 20 min ciascuna) in tampone dell'anticorpo.
14. Trasferire i vetrini di PBS e lasciate in PBS (minuti per una notte a 4 ° C) fino al momento di montare.
15. Lavorare rapidamente sulle singole diapositive, in modo che i vermi sulla parte anteriore del vetrino rimanere bagnato. Rimuovere un vetrino dal PBS, asciugare retro del vetrino con un libero di lanugine pulire, e posto su un tovagliolo di carta.
16. Luogo ~ 20 ml di mezzo di montaggio sopra i vermi in modo che non vi siano parti approssimativamente uguali medie e PBS sulla trasparenza e l'inclinazione scorrevole delicatamente per miscelare le due soluzioni. CAUTION: Montaggio medio è tossico.
17. Tilt diapositiva bordo in modo smerigliato è più basso e la soluzione raccoglie nei pressi di glassa, poi mettere un bordo di 24 x 60 mm coprioggetto sulla soluzione.
18. Abbassare delicatamente il vetrino per ridurre al minimo le bolle d'aria (che aumentano il candeggio e interrompono la visione). Se si formano bolle, sollevare il bordo del vetrino lentamente, poi relower senza scivolare il vetrino di tutti i vermi.
19. Asciugare con cura il bordo della diapositiva senza spostare il vetrino, comprimendo i bordi con un libero di lanugine pulire. Il bordo relativamente secco del vetrino deve essere visibile in tutto il bordo del vetrino
20. Sigillare il vetrino con 2-3 strati di smalto. I vetrini possono essere collocati in un portavetrini piatto durante la preparazione e la conservazione al riparo dalla luce. Una diapositiva è ben sigillato e asciutto, pulire il vetrino e posteriore della diapositiva.
21. Vetrini ben sigillati possono essere conservati al buio per giorni a settimane, 4 ° C oa -20 ° C. Più di periodi più lunghi, DAPI staining del DNA e la maggior parte dei coloranti verdi (ad esempio 488 nm di eccitazione) dissolvenza. Richiudere il vetrino con più smalto, se necessario, ad esempio, dopo l'utilizzo di qualsiasi obiettivo immersione in olio.

Representative Results

Quando i vermi sono adeguatamente compressi, incrinato, e leggermente fissi, praticamente l'intero worm può essere accessibile a colorazione anticorpale (vedi figura 2). La posizione dei nuclei come indicato dalla colorazione DAPI indica quali parti del verme sono intatti Quando i vermi sono sottoposti ad un fissativo più duro, come la formaldeide, la morfologia della vite senza fine può essere distorta (come si vede dalla comparsa innaturale ondulata del muscoli nelle figure 3a-D). Un altro problema comune è la fissazione irregolare o penetrazione di particolari tessuti. Un esempio di questo è mostrato nelle Figure 3E-H, dove il muscolo è colorato solo in una porzione del verme, nonostante il fatto che la presenza di altra colorazione, compresa colorazione del DNA, indica che almeno parte del corpo era presente ( cioè, non rimosso durante freeze-cracking). Il risultante pattern di colorazione parziale può essere facilmente identificato con la pratica, in modo che l'intero DISTRIBUZIONEsu colorazione può essere determinata anche se ogni singolo verme mostra una colorazione uniforme.

I problemi più comuni riscontrati con congelamento di cracking con qualsiasi condizione di fissaggio sono illustrate nella figura finale (Figura 4). Il problema più comune è la torsione del campione dovuta al moto relativo dei due vetrini durante la compressione. Il fatto che il corpo del verme è ritorto immediatamente posteriore della faringe può essere visto dalla morfologia dei tessuti macchiati. Questa immagine mostra anche il problema con colorazione di fondo, dovuto anticorpo attaccarsi alla poli-lisina rivestimento diapositiva. Si noti, tuttavia, che tutte queste immagini sono stati raccolti utilizzando slides fatte durante i primi tentativi di anticorpi colorazione di studenti in un corso di laboratorio di biologia cellulare. Anche con la pratica, molti singoli worm mostrerà i problemi visti in Figura 4. Tuttavia, in qualsiasi diapositiva, vermi come quelli visti nelle figure 2 e 3 possono essere fond ed esaminati.

Figura 1. Schema di procedure. Diagramma di flusso che indica passaggi per eseguire la procedura di congelamento di cracking completo. Sono indicati Alternative per varie metodiche di fissazione e numeri di vermi.

Figura 2. Fissi leggermente, worm ben colorate, capi di due ermafroditi adulti fissati con metanolo-acetone ed etichettati con più anticorpi e coloranti.: A) anticorpo primario per chattare (colina acetiltransferasi) e anticorpo secondario Cy3-coniugato, B) DAPI (DNA blu) , C) Oregon verde 488-anti-GFP (green fluorescent protein), D) mostra la sovrapposizione (con due marcatori colinergici, Cy3 anti-Chat e Cy5-anti-VAChT (trasportatore vescicolare dell'acetilcolina) indicato in rosso). Questo ceppo transgenico (PS4657) esprime una fusione traduzione tra GFP e AJM-1, che si trova a faringee giunzioni apicali. Le immagini sono proiezioni massime di serie di immagini confocale, barra della scala è di 50 micron.

Figura 3. Immagini distorsioni Formaldeide associata. Formaldeide adulti fissi colorati con Cy3-falloidina (lega actina filamentosa), DAPI (blu DNA), e Oregon verde 488-anti-GFP. DC) Fours del corpo appena posteriore della vulva (estrema sinistra) nello stesso nematode, mostrando una morfologia ondulata innaturale a causa della distorsione indotto da fissazione. A) Red-phalloidin mostra morfologia muscolare leggermente irregolare. B) Nuclei (blu) siano ripartite uniformemente il worm. C) verde mostra la distribuzione di un CED-1 proteina :: GFP di fusione nella membrana plasmatica della cellule guaina gonadica, guidato dal lim-7 promotore (ceppo MD701). D) Indica la sovrapposizione di questi tre coloranti. EH) Etichettatura può variare con differenti coloranti sullo stesso nematode. E) falloidina (rosso) etichette solo una parte di il muscolo su un lato del verme. F) Nuclei (blu) sono presenti in tutto il verme (sebbene macchiato con intensità irregolare). G) La OG488-anti-GFP etichette collagene-19 :: GFP nella cuticola su un lato di verme che manca la colorazione del tessuto muscolare più centrale, che indica che il muscolo è presente ma non colorazione su una superficie. H) Indica la sovrapposizione dei tre coloranti. Le immagini sono maxproiezioni IMAL di serie di immagini confocale; barre di scala sono 50 micron.

Figura 4. Larva distorsioni compressione associata. Formaldeide fisso macchiato di A) Cy3-falloidina (lega actina filamentosa), B) DAPI (blu DNA), C), Oregon-Green 488-anti-GFP, D) overlay. La torsione del corpo immediatamente posteriore della faringe è evidente, come la cella di escrezione verde e ventrale cavo croce nervo sul resto del corpo. Alta la colorazione di fondo è evidente anche con Cy3-phallodin. Questo ceppo esprime una VHA-8 :: proteina GFP fusion, situato prevalentemente nella cella escretore. Le immagini sono proiezioni massime di serie di immagini confocale che esteso alla superficie del vetrino (che porta alla colorazione con fondo elevato); barra della scala è di 50 micron.

Discussion

Il protocollo di congelamento di cracking è uno dei diversi metodi per la colorazione degli anticorpi in C. elegans. Esso fornisce un modo relativamente semplice per colorare i vermi, ma richiede reagenti specifici e pratica per ottenere risultati ottimali. Passaggi critici (descritti nella Figura 1) includono: 1) preparazione del vetrino (vedi punti 1 e 2) la compressione manuale dei nematodi (vedere i passi 2 e 3) di fissaggio rapido (vedi punto 3). In primo luogo, per massimizzare l'adesione dei nematodi alle diapositive, è meglio preparare le diapositive con alto peso molecolare (lungo polimero) polilisina, invece di basarsi su vetrini preparati commercialmente. Diapositive commerciali sono rivestiti con polilisina per permettere alle cellule di aderire, mentre le diapositive-freeze di cracking sono progettati per aderire alla cuticola di interi nematodi. In secondo luogo, la procedura per la corretta compressione dei vermi tra i vetrini prima del congelamento è critica. Richiede mani e pratica costante per premere i vetrini insieme utilizzando la giusta quantità dipressione in modo che i singoli vermi contattare i due scorrevoli senza distruggere la loro morfologia. Troppo o troppo poco compressione porta ad una maggiore perdita di vermi durante la fissazione. Ulteriore attenzione è necessaria per spostare le diapositive sul ghiaccio superficie refrigerata secco per congelamento senza spostare le diapositive uno rispetto all'altro. Qualsiasi movimento causerà il worm per strappare o torsione. In terzo luogo, come con qualsiasi tecnica di fissazione, i vermi congelati devono essere inseriti direttamente nel fissativo prima dello sbrinamento. In caso contrario, l'antigene può diffondere, fornendo informazioni fuorvianti sulla localizzazione subcellulare. Se questi passaggi critici sono tutti fatti correttamente, per i migliori risultati, è comunque necessario acquisire più vetrini colorati per trovare vermi con la migliore morfologia.

Un aspetto inevitabile di questa tecnica è che i vermi verranno compressi in una dimensione. La compressione è più evidente negli adulti, in cui il diametro apparente del corpo rotondo in z può essere solo 1-4th quello visto nelle direzioni x ed y assi. Questa compressione tende a diminuire in piccole larve, e può essere trascurabile in embrioni. A causa del modo in cui i nematodi vivono si muovono durante la preparazione del vetrino, i vermi sono spesso macchiati sui loro lati. Questo imita l'orientamento di vermi sui piatti di agar, con la linea mediana laterale sdraiato estende fino alla metà del worm colorato (vedi figure 2-4). Pertanto, la compressione è generalmente nella dimensione laterale. Anche se questo rende di fatto microscopia a fluorescenza standard di facile (più del campione sarà a fuoco contemporaneamente), ciò significa che il 3-D ricostruzioni non saranno accurati.

Come con qualsiasi colorazione anticorpo, è importante controllare la specificità di legame. Nella maggior parte delle specie, questo è fatto da controlli quali affinità impoveriscono vostro anticorpo o con nessun primaria. In C. elegans, mezzi più specifici di controllo per la specificità sono spesso disponibili. Null mutanti per il gene e la proteina di interesse fornisconoun controllo eccellente per la colorazione specificità. Entrambi i ceppi devono essere fissati in condizioni identiche prima del confronto, dal momento che la colorazione è di solito la fissazione dipendente. Se nessun mutante nullo è disponibile, allora è relativamente facile in C. elegans di diminuire i livelli di proteine ​​con RNAi (RNA inibizione ¹²⁾ e cercare diminuzione colorazione in RNAi vermi trattati.

Anticorpi policlonali spesso mostrano la colorazione non specifica, anche se purificati per affinità con l'antigene. Spesso, fissazione luce utilizzando metanolo e acetone (che fissano le proteine ​​precipitando loro invece di reticolazione) dà la colorazione non specifica inferiore formaldeide o glutaraldeide (che generano più epitopi varianti dovute a vario cross-linking) ^1,11. Tuttavia, in C. elegans colorazione non specifica è molto comune in ogni condizione di fissazione, soprattutto nell'intestino. Se il vostro antigene viene espresso nell'intestino, allora questa colorazione non specifica può mascherare il vostro staini specificong. Se mutanti nulli sono disponibili per la vostra proteina, poi vermi fissati con questo metodo possono essere utilizzati per affinità esaurire la vostra siero. Poiché antigenicità dipende dalle condizioni di fissazione, i vermi che si utilizza per esaurire la vostra anticorpo deve essere preparato nello stesso modo come i vermi wild-type si sta colorazione. Dopo un ciclo di esaurimento delle aspecifica, mutanti e wild-type vermi può essere tinto in parallelo con il siero impoverito per un controllo eccellente. Ulteriori giro di esaurimento con mutanti può essere fatto come necessario.

Questa tecnica è molto utile per testare nuovi anticorpi per colorazione specifica sotto una varietà di condizioni. Questi possono essere anticorpi generati contro C. elegans proteine ​​o anticorpi generati contro proteine ​​conservate da altre specie. Mentre questo metodo fornisce la migliore morfologia da nematodi fissi leggerezza, è relativamente semplice da provare una gamma di fissativi per determinare quali condizioni, se del caso, dare risultato specificos. A differenza di altri metodi di fissaggio rigido utilizzando formaldeide o glutaraldeide, enzimatici o riducendo trattamenti non sono necessari per la preparazione del campione. Poiché questi trattamenti possono diminuire antigenicità, questo aumenta la capacità di identificare anticorpi specifici e le loro condizioni di fissazione ottimali. Se le condizioni di fissazione dure funzionano meglio, lo sperimentatore può quindi girare a metodi effettuati su vermi intatti per ottenere una migliore morfologia (sintetizzato nel nostro precedente lavoro ^4). Se fissazione luce conserva antigenicità, allora questa tecnica può essere utilizzata per tutte le ulteriori colorazione per microscopia ottica.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
poly-L-lysine slide (ESCO brand)	Fisher	12-545-78	Sigma brand slides also suitable
poly-L-lysine hydrobromide	Sigma	P1524	IMPORTANT: Brand and high molecular weight of polylysine critical
single frosted edge slides	Fisher	48312-002	Other brands are suitable
sodium azide	Sigma	S2002-25G	TOXIC, wear gloves and mask while weighing out powder to make 10% stock. Wear gloves when pipeting stock solution
coplin staining jar	VWR	47751-792	Other brands are suitable
5-slide mailer	Electron Microscopy Science	71549-01	One of many different brands of small slide holder, suitable for staining
Paraformaldehyde	VWR	MK262159	IMPORTANT: Regular formalin solutions (37% formaldehyde) are NOT suitable. Either 1) Dissolve crysatlaline paraformaldehyde in phosphate buffer and store in small aliquots frozen. Or 2) buy electron microscopy grade paraformaldehyde in aliquots. TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.
Glutaraldehyde solution, 25% in water	Sigma	G 5882	IMPORTANT: purchase electron microscopy grade glutaraldehyde in ampules; TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.
Triton X-100	VWR	EM-9410	Other brands are suitable
Bovine Serum Albumin	Fisher	ICN820451	Other brands are suitable
Donkey Serum, lyophilized	Jackson Immunoresearch	017-000-121	Other brands are suitable
Cy3 Donkey anti-Mouse IgG multi-labeling	Jackson Immunoresearch	715-165-150	This company is recommended for high quality multi-label (affinity depleted) antibodies. Select appropriate dye and antigen (animal used to raise primary antibody).
n-propyl gallate	Fisher	ICN10274750	Other brands are suitable
DAPI, 4’,6’-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride	Sigma	D 9542	TOXIC. Wear gloves and dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure
Whatman #1 15 cm diameter filters	Fisher	09805G
Coverslip #1 1/2 rectangle 24 x 60 mm	VWR	48393-252	#1 1/2 thickness is optically best
Microscope slide folder	VWR	48429-092	Other brands are suitable