Summary
"Freeze-craqueo," un método para exponer los tejidos internos del nematodo C. elegans a anticuerpos para la localización de proteínas, se demuestra.
Abstract
Para la tinción de C. elegans con anticuerpos, la cutícula relativamente impermeable deben ser anuladas por métodos químicos o mecánicos. "Freeze-cracking" es un método utilizado para extraer físicamente la cutícula de los nematodos mediante la compresión de nematodos entre dos diapositivas adherentes, la congelación, y tirando de las diapositivas aparte. Freeze-craqueo proporciona una manera simple y rápida para obtener acceso a los tejidos sin tratamiento químico y se puede utilizar con una variedad de fijadores. Sin embargo, conduce a la pérdida de muchas de las muestras y la compresión requerida distorsiona mecánicamente la muestra. Se requiere práctica para maximizar la recuperación de muestras con buena morfología. Freeze-craqueo puede ser optimizado para condiciones específicas de fijación, de recuperación de muestras, o bajo la tinción no específica, pero no para todos los parámetros a la vez. Para los anticuerpos que requieren fijación de condiciones muy duras y toleran los tratamientos químicos necesarios para permeabilizar químicamente la cutícula, treatmenpuede ser preferido t de nematodos intactas en solución. Si el anticuerpo requiere una solución más ligero o si las condiciones óptimas de fijación son desconocidos, congelar-craqueo proporciona una manera muy útil para ensayar rápidamente el anticuerpo y puede proporcionar información específica de localización subcelular y celular para el antígeno de interés.
Introduction
Para determinar la localización celular y subcelular de las proteínas, los científicos han denominado tradicionalmente tejidos con anticuerpos seleccionados para reconocer específicamente las proteínas particulares 1. En algunos organismos modelo como C. elegans, tinción de anticuerpos a menudo ha sido sustituido por técnicas genéticas moleculares, que dan resultados más rápidamente. Estos incluyen los organismos de transformación con constructos que consisten en fusiones de genes entre el promotor y las regiones codificantes del gen de interés y la proteína fluorescente verde. Sin embargo, las técnicas moleculares están sujetas a una serie de artefactos, incluyendo problemas con conocer la verdadera promotor y cambios en la expresión de los constructos en el número de copias alto (las técnicas habituales en C. elegans) 2,3. Por lo tanto, la tinción con anticuerpos sigue siendo un objetivo para muchos científicos que estudian la función de proteínas in vivo.
La tinción con anticuerpos tejidos puede ser difícil, ya que untibodies sólo podrán reconocer su antígeno en una determinada conformación 1. Por ejemplo, los anticuerpos pueden reconocer sólo antígeno desnaturalizado o intactos fija de una manera particular y pueden no reconocer el antígeno in situ. El problema de la tinción de anticuerpos en los nematodos se ve agravada por el hecho de que la cutícula del nematodo forma una barrera relativamente impermeable, bloqueando el acceso de los anticuerpos a los tejidos.
Hay varios métodos diferentes utilizados para la tinción de anticuerpos en C. elegans (revisado en nuestros trabajos anteriores 4). Para la tinción intactas "gusanos, 'se desarrollaron métodos para congelar y descongelar en un fijador relativamente duro (formaldehído o glutaraldehído), los ciclos de congelación-descongelación ayudan a romper la cutícula para permitir una rápida penetración del fijador 5. Después de la fijación, la cutícula se permeabilizaron para permitir la penetración del anticuerpo; métodos incluyen el tratamiento con agentes, colagenasa, o tanto la reducción de 5-7. Estos treatments conservan la morfología, pero a menudo reducen o destruyen el reconocimiento de anticuerpos. Los métodos alternativos incluyen la disección 8 para permitir la penetración de anticuerpos.
"Freeze-cracking" es una forma de obtener acceso al interior del gusano semi-intacta para permitir la tinción de anticuerpos 9-10. Freeze-craqueo se puede realizar con una variedad de condiciones de fijación, evitando tratamientos de colagenasa y de reducción. Los nematodos se colocan entre dos adhesivos diapositivas, congeladas, y luego las diapositivas se separan, dejando la mayor parte del nematodo en el portaobjetos inferior y gran parte de la cutícula en la diapositiva superior. La corredera inferior se puede colocar en fijador y toda la diapositiva con nematodos adheridas se transfiere a través del procedimiento de tinción de anticuerpos. El método no presentan dos dificultades principales. En primer lugar, es difícil aplicar la cantidad correcta de presión necesaria para dividir los nematodos sin deformar gravemente ellos. En segundo lugar, muchos de los gusanos no se smarque a cualquiera de diapositivas, y se perderá en el fijador o enjuagues. Sin embargo, con los portaobjetos y la práctica adecuados, el método producirá rápidamente nematodos con morfología razonable que se puede utilizar con una amplia variedad de fijadores y anticuerpos.
El método se puede variar ligeramente, dependiendo de la meta del experimentador. Si se desea tinción de los nematodos individuales (por ejemplo, para determinar si un único transformante ha alterado la tinción de anticuerpos), a continuación, se desliza con la adhesión máxima (pero mayor tinción de fondo) se puede utilizar, tales como diapositivas preparadas en el laboratorio con polilisina adicional (ver más abajo). Para formaldehído o glutaraldehído fijación, toboganes más altos de adhesión (diapositivas polylysine preparadas en el laboratorio) deben ser usados, ya que los nematodos se adhieren más mal a la polilisina después de estas fijaciones. Si los nematodos de tipo salvaje se fijaron con metanol y / o acetona, y luego se desliza con una menor adherencia y la tinción de fondo más baja se debe utilizar (comercial o de ldiapositivas aboratory preparados). Si una variedad de anticuerpos y fijadores están siendo utilizados en el laboratorio, una selección de diapositivas se puede preparar con anticipación y se almacena hasta que se necesita.
Después de acceso al tejido nematodo se ha adquirido, los procedimientos de tinción de anticuerpos siguen métodos estándar (con incubaciones más largas característicos de los tejidos en lugar de células de 1,11).
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Protocol
NOTA: los pasos de protocolo múltiple se presentan con opciones para la puesta a punto y preparación en función de las condiciones específicas del experimento. Para estos casos, pasos alternativos se presentan como A, B, C, etc El protocolo con pasos alternativos se describe en la Figura 1.
1. Preparación del portaobjetos recubiertos Polilisina
Se dispone de tres tipos diferentes de diapositivas, dependiendo del equilibrio deseado entre la facilidad de preparación, la adhesión relativa y la unión no específica del anticuerpo. Detalles de alternativas de preparación de portaobjetos se dan a continuación en los pasos 1A-1C con el fin de aumentar la adhesión y la complejidad. Los portaobjetos preparados por estos diferentes métodos se pueden utilizar juntos para un solo experimento.
1A. Sin preparación de los portaobjetos
Diapositivas polylysine recubierto disponibles en el mercado ofrecen poca adherencia y bajo fondo.
1B. Pr Slideeparation óptima para la fijación de metanol-acetona
Adherencia media y baja de fondo.
- Prepare una solución de polilisina para mojar las diapositivas: Añadir 400 mg de muy alto peso molecular (150,000 - 300,000 D) poli-L-lisina a 200 ml de agua destilada doble. Añadir 2 ml de 10% de azida de sodio de stock (concentración final 0,1%) como conservante. PRECAUCIÓN: seco azida sódica es reactivo y todas las formas son tóxicos. Usar mascarilla y guantes mientras que el polvo de pesaje para hacer 10% stock en agua doblemente destilada.
- Limpie finales único portaobjetos de vidrio esmerilado, con paños libres de pelusa, la eliminación de manchas y partículas. Esto debe hacerse incluso en portaobjetos adquiridos con la designación "prefiltrado."
- Lugar desliza-back-to-back en un soporte de diapositivas, tarro de Coplin u otro recipiente de tinción de portaobjetos, manteniendo los bordes esmerilados y no del todo perfectamente alineados (para hacer la separación posterior más fácil). Coloque titular de la rebanada en el vaso de precipitados con etanol al 70% (alcohol de grado reactivo no es necesario) con 1% de HCl en diagua aquietada o del recipiente de tinción a nivel de escarcha. Roca diapositivas en solución durante un mínimo de 5 min. PRECAUCIÓN: Esta solución es corrosivo, usar guantes. NOTA: Esta solución puede ser reutilizado varias veces (hasta varios meses).
- Enjuagar los portaobjetos con agua corriente destilada durante 1 min.
- Diapositivas seque por completo en un ambiente libre de polvo, ya sea mediante la colocación en un horno de 40 a 60 ° C durante 30-60 minutos, o al mantener durante toda la noche a temperatura ambiente.
- Incubar los portaobjetos en solución de polilisina (que cubre partes no congelado) en eje de balancín de 15 min.
- Repita secado de diapositivas.
- Repita polilisina incubación de la solución y etapas de secado.
- Separe las diapositivas utilizando un objeto de metal delgado, como una espátula delgada pesa. Si están adecuadamente adheridos, que son difíciles de separar. Usar equipo de seguridad adecuado (gafas de seguridad) y el trabajo en el papel superior del banco (a ser desechados después de su uso), ya que los pequeños trozos de vidrio pueden volar suelta cuando se separan las diapositivas.
- Diapositivas de las tiendas en limpio(Libre de polvo) caja de portaobjetos a 4 ° C hasta que se necesite.
1C. Deslice una óptima preparación para la fijación de formaldehído
Mayor adherencia, pero de alta de fondo.
- Colocar los portaobjetos preparados con plana método 1B en una fuente de horno-seguro y libre de polvo (para el secado en horno) o sobre una superficie plana y libre de polvo (por secado al aire).
- Coloque una gota de 20-60 l de la solución de polilisina en el centro de cada diapositiva.
- Diapositivas seque por completo en el horno oa temperatura ambiente. La polilisina dejará atrás óvalos pálidos ya que se evapora. Estos óvalos son muy adhesivo. Desafortunadamente, también se unen a los anticuerpos primarios y secundarios, incluso después de bloqueo.
- Diapositivas en tienda a limpiar la caja del carro (libre de polvo) a 4 ° C hasta que se necesite.
2. Preparación de Frozen Nematodo Diapositivas
Preparar los nematodos para la tinción por completo enjuague libre de bacterias, utilizando el método 2A (para placas de nematodos) o2B (por nematodos individuales).
2A. Preparación de las placas de placas de nematodos
- Coloque una pieza plana de metal en hielo seco para preenfriar.
- Use agua destilada y una pipeta de vidrio (disminuye la pérdida de gusanos) o micropipeta para enjuagar los gusanos de la placa de NGM con bacterias en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Las placas se pueden sincronizar o mezclan las edades, no utilizar placas con muchos dauers (difíciles de roer) o gusanos hambrientos (aumento de autofluorescencia) a menos que sea necesario.
- Enjuague los gusanos 3-4x con agua destilada hasta que quede libre de bacterias. (Para disminuir la pérdida de gusanos utilizar la misma pipeta de vidrio.) Para sedimentar los gusanos, o bien dejar que ellos se sientan en el banquillo durante 3-5 minutos (para recoger en su mayoría adultos, en el fondo del tubo) o girar 30 segundos a ~ 1000 rpm (~ 500 g) en una centrífuga de mesa (para recoger los adultos, larvas y embriones).
- Eliminar la mayor parte del agua del tubo con gusanos, dejando alrededor de dos veces el volumen de agua como gusanos (pero al menos 25 l volumen total).
- Tener un número igual de regulares (limpio, pero no tratados polilisina borradas) diapositivas "top" disponibles.
- Place ~ 25 mu l gusanos en el agua de la diapositiva adherente "de abajo", y difundir el líquido que contiene los gusanos sobre la porción central de la diapositiva con el lado de la punta de la pipeta.
- Deje que los gusanos se conforme con 30 segundos a 2 minutos. Si la tapa está apropiadamente pegajosa, los extremos de los gusanos se adhieren, ya que en contacto con el portaobjetos.
- Mantenga la corredera inferior en una mano y colocar la placa superior sobre la corredera inferior de modo que todos, pero las partes congeladas se superponen. El líquido debe mantener las diapositivas ligeramente separadas, de modo que los gusanos todavía se mueven ligeramente No deje que los portaobjetos se deslizan una sobre la otra -. Este tuerce los gusanos.
- Con cuidado, presione hacia abajo sligeramente en el carro superior, utilizando los dedos pulgar e índice de cada mano. Con la cantidad ideal de presión, algunos de los más grandes de hermafroditas en el borde de las diapositivas se rompa, mientras que la mayoría de los adultos y las larvas se comunicará con cada diapositiva, pero se mantendrá intacto.
- Inmediatamente y con cuidado (sin deslizamiento) poner las diapositivas en la pieza de metal en hielo seco. Las diapositivas deben aparecer congelado dentro de un minuto. Mantener en hielo seco durante 5 minutos hasta su congelación a fondo.
- En este punto, las diapositivas se pueden almacenar en una caja etiquetada a -80 ° C durante varios días. (Si se mantienen semana a -80 ° C, el agua comenzará a sublimar de distancia y los gusanos no mancha así). Si las diapositivas se almacenan a -80 ° C, dejar que 'calientan' en hielo seco durante 10 min antes de agrietarse.
- Continúe en el paso 3 (la fijación).
2B. Preparación de las placas de nematodos individuales
- Coloque una pieza plana de metal en hielo seco para PRECcolina.
- Utilice una selección sin fin de transferir los nematodos individuales a una gota de agua sobre una placa de NGM para liberarlos de las bacterias. Nematodo (s) debe estar bien alimentado para disminuir la autofluorescencia, si es posible. Repita la transferencia a nuevos puntos de agua como sea necesario hasta que el gusano (s) están libres de bacterias.
- Etiquete lado esmerilado de las diapositivas polylysine "fondo" con tinta y coloque los portaobjetos imborrables en mostrador al lado de recipiente con hielo seco, con la etiqueta hacia arriba. Tener un número igual de "top" menos adherente diapositivas (no tratadas) disponibles.
- Coloque un 5-10 l gota de agua en la región de la corredera inferior doble tratada con polilisina. Utilice el volumen más grande si la transferencia de más gusanos, para evitar que el agua se evapore antes de la terminación.
- Transferir el gusano (s) a la gota de agua con la selección gusano, utilizando el microscopio para ver como los gusanos se hunden hasta tocar la superficie de deslizamiento pegajoso. Traslado tan sólo un gusano a un máximo de 20 + gusanos por gota.
- Mantenga las s de fondoLiDE en una mano y colocar la placa superior sobre la corredera inferior de modo que todos, pero las partes congeladas se superponen.
- Inmediatamente y con cuidado (sin deslizarse o comprimir) poner las diapositivas en la pieza de metal en hielo seco. Mantener en hielo seco durante 5-30 min. (No guarde estas diapositivas a largo plazo, como las diapositivas se secan con facilidad.)
- Continúe en el paso 3 (la fijación).
3. Fijación
Los fijadores son necesarias para "arreglar" el antígeno en su lugar en la célula, ya sea por precipitación ("fijación de luz") o reticulación ("fijación dura") el antígeno. La fijación puede alterar la antigenicidad; anticuerpos más conocidos funcionan mejor con una condición de fijación particular. Para los nuevos anticuerpos, una amplia gama de condiciones de fijación debe ser probado.
Para toda fijación, el primer paso es hacer una solución salina tamponada con fosfato. Diapositivas fix Siguiente nematodos para la tinción de anticuerpos utilizando el método A (luzfijar usando metanol y acetona) o B (más difícil arreglo mediante formaldehído o glutaraldehído).
- Prepare una solución 10x PBS (tampón fosfato salino) stock estériles, añadiendo 80 g de NaCl, 2,0 g KCl, 27,2 g de Na 2 HPO 4 • H 2 0, 2,4 g de KH 2 PO 4, 20 ml 10% de sodio azida de valores. Para que esta solución madre, pesar polvo azida de sodio para hacer una solución al 10% en agua doblemente destilada. Revuelva la solución salina con calor suave hasta que se disuelva. PRECAUCIÓN: seco azida sódica es reactivo y todas las formas son tóxicos. Usar mascarilla y guantes cuando se trabaja con azida de sodio seco o soluciones.
- Deje enfriar salino (Tris pH es sensible a la temperatura), entonces el pH a 7,2 con 1-10 M NaOH. De arriba a 1 L con agua destilada dos veces y autoclave para esterilizar. Guárdelo a temperatura ambiente y se diluye a 1x, según sea necesario con agua estéril bidestilada. PRECAUCIÓN: NaOH es cáustico - usar guantes durante el uso.
3A. Fix luz utilizando metanol-acetona
- Ponga 100% de metanol, 100% de acetona, y 1x tampón fosfato salino (PBS) en recipientes de tinción en hielo para preenfriar durante al menos 10 min. PRECAUCIÓN: El metanol y acetona son tóxicas, use guantes.
- Tome un par de inferior y superior se desliza desde el hielo seco, rápidamente gire aparte, y sumerja inmediatamente la diapositiva "de abajo" en metanol enfriado con hielo durante 2 min. El tobogán "top" se puede desechar.
- Transfiera los portaobjetos de metanol para hielo acetona fría durante 4 min. Si las diapositivas tenían muchos gusanos, la mayoría (90%) se caerá en la revisión, incluso con los toboganes más preparados. Si se desliza gusano individuales fueron preparados adecuadamente, los gusanos deben permanecer adheridos.
- Coloque o sumergir los portaobjetos en el frasco con PBS (para enjuagar fijador) y vaya al paso 4 (manchas).
3B. Fix duro utilizando formaldehído o glutaraldehído
- Diluir formaldehído grado reactivo o solución de glutaraldehído en PBS 1X a una concentración final de 0,5-4%. Las alícuotas (1,5 ml) may pueden almacenar bien tapado a -20 a -30 º C; descongelar alícuotas en el hielo justo antes de usar. NOTA: soluciones de formaldehído se degradan con el tiempo y con la exposición al aire. PRECAUCIÓN: el formaldehído y el glutaraldehído son tóxicos, usar guantes y trabajar en la campana.
- Tome un par de inferior y superior se desliza desde el hielo seco, rápidamente gire aparte, e inmediatamente colocar el carro de "abajo" con los gusanos en el plato plano con tapa. (El carro superior puede ser descartado).
- Inmediatamente pipetear 200 l fijador tóxico sobre el centro de la zona de la corredera con gusanos. El fijador se congela parcialmente en su lugar, a continuación, fundirse para cubrir una región más grande de la corredera.
- Si los gusanos no están totalmente cubiertas con fijador, inmediatamente y con cuidado agregar más fijador utilizando una micropipeta. No permita fijador fluya sobre el borde de la corredera.
- Cubra el plato con una tapa y se deja durante 10 minutos a toda la noche a temperatura ambiente. Asegúrese de que el plato se humidifica si incubaciones más largas are utilizado - esto se puede hacer mediante la adición de toallitas húmedas sin pelusa dobladas al plato. No dejes que las toallitas se tocan las diapositivas.
- Después de la fijación se haya completado, la pipeta cuidadosamente el fijador con gusanos sueltos en un tubo de 1,5 ml y se moje la diapositiva en una cubeta de tinción con PBS.
- Haga girar el tubo con gusanos que se soltaron a alta velocidad durante 30 segundos para sedimentar. Enjuague las lombrices dos veces con PBS, y luego procesar en paralelo con los gusanos en las diapositivas (haciendo pasos en tubos de microcentrífuga, en lugar de en las diapositivas).
- Continúe con el paso 4 (manchas).
4. Tinción de anticuerpos
El protocolo de tinción de anticuerpos es similar a los protocolos estándar para cualquier tejido en portaobjetos. Este protocolo es el mismo para todas las diapositivas independientemente de la preparación en los pasos 1-3.
- Preparar Tampón de Anticuerpo mediante la mezcla de 700 ml de agua doblemente destilada, 100 ml de PBS 10X, 5 ml de Triton X-100 (0,5% final), 2 ml de 0,5 M de EDTA pH 8 (1 mM final), 1 g de BSA (0,1% final), 5 ml de 10% de sodio AZsolución ide (0,05% final). pH a 7,2 con HCl, a continuación, agregue el agua doblemente destilada a 1 L; se almacenan a 4 ° C.
- Preparar Bloquear mediante la reconstitución de suero de burro con agua doblemente destilada, a continuación, la adición de 5 ml de suero a 45 ml de tampón de anticuerpo (suero final de 10%).
- Preparar soluciones de anticuerpos primarios y secundarios mediante la dilución de anticuerpo en tampón de anticuerpo más 1% de BSA. Diluciones recomendadas son 1:50-1:2,000 para los anticuerpos primarios y 1:1,000-1:5,000 de secundaria de anticuerpos (anticuerpos de burro conjugados Cy3or OG488 contra las especies que se utilizan para aumentar el anticuerpo primario).
- Preparar DAPI stock de mezcla 2,5 mg / ml en agua doblemente destilada, tienda en 8 ml de alícuotas congeladas a -30 ° C. PRECAUCIÓN: DAPI es un colorante de unión a ADN tóxico, use guantes mientras pesaje y dosificación en alícuotas.
- Preparar 10 ml de medio de montaje mediante la mezcla de 200 mg de galato de n-propilo, 0,3 ml de 1 M Tris, pH 9, 2,7 ml de agua doblemente destilada en un tubo cónico de 15 ml. Se calienta a 65 ° C durante aproximadamente 10 min hasta que se disuelva.Añadir 7 ml de glicerol y una alícuota de 8 l de DAPI y agitar bien. Alícuota medio en tubos de 1,5 ml, envolver en papel de aluminio, y almacenar en oscuridad a 4 ° C (el aire y la luz degrada el medio - si se vuelve más amarillo, desechar los residuos de riesgo biológico). PRECAUCIÓN: galato de n-propilo es un anti-oxidante reactivo, usar guantes durante el pesaje.
- Transferencia de diapositivas para un tarro de tinción con Bloquear durante 1 hora a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C (durante la noche preferible para fijar duro). Evite agitar para evitar gusanos perdedoras.
- Transferencia desliza a las manchas frasco con anticuerpos primaria o coloque los portaobjetos en una placa plana humidificado y de arriba, cada uno con 100 a 500 l de anticuerpo primario. Incubar los portaobjetos durante la noche a 4 ° C sin agitación.
- Después de la incubación del anticuerpo primario, la transferencia se desliza a las manchas frasco de PBS.
- Filtro de bloque a través de embudo forrado con papel de filtro y se almacenan a 4 ° C; si estériles filtradas cada 1-2 semanas, Block se puede reutilizar para 1 o más meses. Del mismo modo, filtrar y guardaranticuerpo primario a 4 ° C para su reutilización (hasta 10 o más rondas de manchas).
- Enjuagar los portaobjetos tres veces (~ 20 min cada uno) en tampón de anticuerpos.
- Coloque los portaobjetos en anticuerpo secundario en un recipiente de tinción hermético a la luz y se incuba 4 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C.
- Transferencia desliza a las manchas frasco de PBS. Filtrar y guardar anticuerpo secundario a 4 ° C para su reutilización (hasta 10 o más rondas de manchas).
- Enjuagar los portaobjetos tres veces (~ 20 min cada uno) en tampón de anticuerpos.
- Transferencia desliza a PBS y dejar en PBS (minutos a la noche a 4 ° C) hasta que esté listo para montar.
- Trabaje con rapidez en las diapositivas individuales, por lo que los gusanos en la parte delantera de la corredera se quedan mojados. Eliminar una diapositiva de la PBS, secar parte posterior de la diapositiva con un paño que no suelte pelusa, y colóquelo sobre una toalla de papel.
- Place ~ 20 l de medio de montaje sobre los gusanos para que no haya partes aproximadamente iguales medianas y PBS en la diapositiva y diapositiva inclinación suavemente para mezclar las dos soluciones. CAUTION: Montaje medio es tóxico.
- Diapositiva Inclinación borde para esmerilado es menor y la solución reúne cerca de glaseado, a continuación, colocar un borde de 24 x 60 mm cubreobjetos en solución.
- Baje suavemente el cubreobjetos para minimizar las burbujas de aire (que aumentan el blanqueo y perturban la visión). Si se forman burbujas, levantar el borde del cubreobjetos lentamente, a continuación, relower sin deslizamiento el cubreobjetos a través de los gusanos.
- Secar cuidadosamente el borde de la diapositiva sin mover el cubreobjetos, comprimiendo los bordes con un paño que no suelte pelusa. El borde relativamente seco de la corredera debe ser visible en todo el borde del cubreobjetos
- Sellar el cubreobjetos con 2-3 capas de esmalte de uñas. Las diapositivas se pueden colocar en un soporte de diapositivas plana durante la preparación y el almacenamiento para protegerlo de la luz. Una vez diapositiva está bien sellado y seco, limpiar el cubreobjetos y la parte posterior de la corredera.
- Diapositivas bien sellados se pueden mantener en la oscuridad durante días a 4 ° C o semanas a -20 ° C. Más de períodos más largos, sta DAPInando de ADN y la mayoría de los tintes verdes (por ejemplo, 488 nm de excitación) se desvanecen. Vuelva a sellar el cubreobjetos con más de esmalte de uñas, según sea necesario, por ejemplo, después de usar cualquier lente de inmersión en aceite.
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Representative Results
Cuando los gusanos se comprimen correctamente, agrietados, y ligeramente fijos, prácticamente todo el gusano puede ser accesible para la tinción de anticuerpos (ver Figura 2). La ubicación de los núcleos, como se indica por la tinción DAPI indica qué partes del gusano están intactos Cuando los gusanos se someten a un fijador más duro, tal como formaldehído, la morfología del gusano puede distorsionarse (como se ve por la aparición no natural ondulado de la músculos de las figuras 3A-D). Otro problema común es la fijación irregular o la penetración de tejidos particulares. Un ejemplo de esto se muestra en las Figuras 3E-H, donde el músculo se tiñe sólo en una parte del tornillo sin fin, a pesar del hecho de que la presencia de otra tinción, incluyendo la tinción de ADN, indica que al menos parte del cuerpo estaba presente ( es decir, no se elimina durante la congelación-cracking). El patrón resultante de tinción parcial se puede identificar fácilmente con la práctica, de modo que toda la DISTRIBUCIel de la tinción se puede determinar aún si un solo gusano muestra la tinción desigual.
Los problemas más comunes encontrados con la congelación de craqueo utilizando cualquier condición de fijación se ilustran en la figura final (Figura 4). El problema más común es la torsión de la muestra debido al movimiento relativo de las dos correderas durante la compresión. El hecho de que el cuerpo del gusano se tuerce justo posterior de la faringe puede ser visto por la morfología de los tejidos teñidos. Esta imagen también muestra el problema con la tinción de fondo, debido a anticuerpo se pegue a la poli-lisina recubrimiento de la diapositiva. Tenga en cuenta, sin embargo, que todas estas imágenes fueron obtenidos mediante diapositivas realizadas durante los primeros intentos de tinción de anticuerpos de estudiantes en un curso de laboratorio de biología celular. Incluso con la práctica, muchos gusanos individuales mostrar los problemas observados en la Figura 4. Sin embargo, en cualquier una diapositiva, gusanos como los que se observan en las Figuras 2 y 3 pueden ser fundacionesD y examinado.
Figura 1. Esquema de los procedimientos. Diagrama de flujo que indica los pasos para llevar a cabo el procedimiento de congelación y el agrietamiento completo. Alternativas para variadas condiciones de fijación y el número de gusanos se indican.
Figura 2. Ligeramente fijos, gusanos y teñidos con los jefes de dos adultos hermafroditas fijadas con metanol-acetona y marcadas con anticuerpos múltiples y colorantes:. A) de anticuerpos primaria para hablar (colina acetiltransferasa) y anticuerpo secundario conjugado con Cy3, B) DAPI (ADN azul) , C) mineralgon Verde 488-anti-GFP (proteína verde fluorescente), D) muestra la superposición (con dos marcadores colinérgicos, Cy3 anti-chat y Cy5-anti-VAChT (transportador vesicular de acetilcolina) que se muestra en rojo). Esta cepa transgénica (PS4657) expresa una fusión de traducción entre GFP y AJM-1, que se encuentra en la faringe uniones apicales. Las imágenes son proyecciones máximas de serie de imágenes de confocal, barra de escala es de 50 micras.
Figura 3. Imágenes fijas adultos distorsiones de formaldehído-asociado. Formaldehído teñidas con Cy3-phalloidin (une actina filamentosa), DAPI (ADN azul), y Oregon Green 488-anti-GFP. AD) Fours del cuerpo justo por detrás de la vulva (a la izquierda) en el mismo nematodo, que muestra una morfología poco natural ondulado debido a la distorsión enproducido por la fijación. a) Rojo-faloidina muestra la morfología del músculo ligeramente irregular. B) Los núcleos (azul) se distribuyen uniformemente a lo largo del tornillo sin fin. C) verde muestra la distribución de una proteína de fusión GFP :: CED-1 en la membrana plasmática de la célula gonadal vaina, dirigido por el promotor Lim-7 (cepa MD701). d) muestra la superposición de estos tres colorantes. EH) Etiquetado puede variar con diferentes colorantes en el mismo nematodo. E) faloidina (rojo) Etiquetas de sólo una parte de el músculo en un lado del gusano. F) Los núcleos (azul) están presentes en todo el gusano (aunque se tiñeron con intensidad desigual). G) El OG488-anti-GFP etiquetas 19 de colágeno :: GFP en la cutícula en un lado de el gusano que carece de tinción del tejido muscular más central, lo que indica que el músculo está presente pero no la tinción en una superficie. H) Muestra la superposición de los tres colorantes. Las imágenes son maxproyecciones IMAL de serie de imágenes de confocal, barras de escala son 50 micras.
Figura 4. Larva distorsiones de compresión asociada. Formaldehído fijo manchada con A) Cy3-phalloidin (se une actina filamentosa), B) DAPI (ADN azul), C) Oregon-Green 488-anti-GFP, D) de superposición. El giro en el cuerpo justo posterior de la faringe es aparente, como la célula excretora verde y transversal cordón nervioso ventral sobre el resto del cuerpo. Alta tinción de fondo también es evidente con Cy3-phallodin. Esta cepa expresa una proteína :: VHA-8 de fusión GFP, que se encuentra predominantemente en la célula excretora. Las imágenes son proyecciones máximas de serie de imágenes confocal que se extendía a la superficie de la diapositiva (que conduce a alta tinción de fondo); barra de escala es de 50 micras.
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Discussion
El protocolo de congelación de craqueo es uno de varios métodos para la tinción de anticuerpos en C. elegans. Proporciona una manera relativamente fácil de manchar los gusanos, pero requiere de reactivos específicos y práctica para obtener resultados óptimos. Los pasos críticos (descritos en la Figura 1) son: 1) la preparación de diapositivas (consulte los pasos 1 y 2) la compresión manual de los nematodos (consulte los pasos 2 y 3) de fijación rápida (ver paso 3). En primer lugar, para maximizar la adherencia de los nematodos a las diapositivas, lo mejor es preparar diapositivas de alto peso molecular (polímero de largo) polilisina, en lugar de confiar en muestras preparadas comercialmente. Diapositivas comerciales están recubiertos con polilisina para permitir que las células se adhieran, mientras se desliza por congelación de craqueo están diseñados para adherirse a la cutícula de los nematodos enteras. En segundo lugar, el procedimiento para la compresión correcta de los gusanos entre las diapositivas antes de la congelación es crítico. Se requiere manos y la práctica constantes para presionar las diapositivas juntos utilizando la cantidad correcta dela presión para que los gusanos individuales en contacto los dos carros sin destruir su morfología. Ya sea demasiada o muy poca compresión conduce a una mayor pérdida de gusanos durante la fijación. Se necesita más atención para mover las diapositivas sobre la superficie enfriada con hielo seco para congelar sin mover las diapositivas uno con relación a otro. Cualquier movimiento hará que los gusanos que destruyen o tuercen. En tercer lugar, como con cualquier técnica de fijación, los gusanos congelados deben ser colocados directamente en fijador antes de descongelar. De lo contrario, el antígeno puede difundir, el suministro de información engañosa sobre la localización subcelular. Si estos pasos críticos son todo hecho correctamente, para obtener mejores resultados sigue siendo necesario para escanear varias diapositivas manchadas de encontrar gusanos con la mejor morfología.
Un aspecto inevitable de esta técnica es que los gusanos se pueden comprimir en una dimensión. La compresión es más notable en los adultos, en los que el diámetro aparente del cuerpo redondo en el eje Z puede ser sólo uno-cuatroª que se observa en los X e Y-ejes. Esta compresión tiende a disminuir en las larvas más pequeño, y puede ser insignificante en los embriones. Debido a la forma en que los nematodos vivos se mueven durante la preparación de los portaobjetos, los gusanos son teñidas a menudo en sus lados. Esto imita la orientación de gusanos en platos de agar, con la línea media lateral acostado se extiende por el centro del gusano manchado (véanse las Figuras 2-4). Por lo tanto, la compresión es generalmente en la dimensión lateral. Mientras que esto hace en realidad microscopía de fluorescencia estándar más fácil (más de la muestra estará en foco simultáneamente), significa que reconstrucciones 3-D no será exacta.
Como con cualquier tinción de anticuerpos, es importante para comprobar la especificidad de la unión. En la mayoría de las especies, esto se hace mediante controles tales como afinidad agotamiento de su anticuerpo o sin usar primaria. En C. elegans, medios más específicos de la comprobación de la especificidad están a menudo disponibles. Mutantes nulos para el gen y la proteína de interés proporcionanun excelente control de la especificidad de la tinción. Ambas cepas deben fijarse en las mismas condiciones antes de la comparación, ya que la tinción es generalmente la fijación dependiente. Si no hay ningún mutante nulo está disponible, entonces es relativamente fácil en C. elegans para disminuir los niveles de proteína con RNAi (inhibición del ARN 12) y buscar tinción disminuido en gusanos tratados RNAi.
Los anticuerpos policlonales a menudo muestran la tinción no específica, incluso si se purificó por afinidad con el antígeno. A menudo, la fijación de luz usando metanol y acetona (el que se fijan las proteínas mediante precipitación de ellos en lugar de reticulación de ellos) da la tinción no específica más baja que el formaldehído o glutaraldehído (que generan más epítopos de variantes debido a la variada reticulación) 1,11. Sin embargo, en C. elegans tinción no específica es muy común en cualquier condición de fijación, especialmente en el intestino. Si el antígeno se expresa en el intestino, a continuación, esta tinción no específica puede enmascarar su staini específicang. Si mutantes nulos están disponibles para su proteína, a continuación, gusanos fijos con este método se pueden utilizar para afinidad agotar su suero. Desde antigenicidad depende de las condiciones de fijación, los gusanos que se utilizan para agotar su anticuerpo deben estar preparados de la misma manera como los gusanos de tipo salvaje está tinción. Después de una ronda de agotamiento de la tinción no específica, mutante y de tipo salvaje gusanos pueden ser manchados en paralelo con el suero agotado para un excelente control. Ronda adicional de agotamiento con mutantes se puede hacer según sea necesario.
Esta técnica es muy útil para probar nuevos anticuerpos para la tinción específica bajo una variedad de condiciones. Estos pueden ser anticuerpos generados contra C. elegans proteínas o anticuerpos generados contra las proteínas conservadas de otras especies. Mientras que este método ofrece la mejor morfología con nematodos ligeramente fijos, es relativamente fácil de tratar una gama de fijadores para determinar qué condiciones, en su caso, dar resultado específicos. A diferencia de otros métodos para la fijación del disco utilizando formaldehído o glutaraldehído, enzimática o reducción de los tratamientos no son necesarios para la preparación de la muestra. Dado que estos tratamientos pueden disminuir la antigenicidad, esto aumenta la capacidad de identificar anticuerpos específicos y sus condiciones óptimas de fijación. Si las condiciones de fijación de los discos funcionan mejor, el experimentador puede entonces recurrir a métodos realizados sobre gusanos intactas para obtener una mejor morfología (resumidos en nuestros trabajos anteriores 4). Si la fijación de la luz conserva la antigenicidad, entonces esta técnica se puede utilizar para todas las manchas más para microscopía de luz.
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Disclosures
El autor declara que no tiene intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
El financiamiento fue proporcionado por la NSF CCLI # 0633618 y la Universidad de Ohio. Algunas cepas fueron proporcionados por el Centro de Genética Caenorhabditis. El estudiante de posgrado Reetobrata Basu aparece en el video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| poly-L-lysine slide (ESCO brand) | Fisher | 12-545-78 | Sigma brand slides also suitable |
| poly-L-lysine hydrobromide | Sigma | P1524 | IMPORTANT: Brand and high molecular weight of polylysine critical |
| single frosted edge slides | Fisher | 48312-002 | Other brands are suitable |
| sodium azide | Sigma | S2002-25G | TOXIC, wear gloves and mask while weighing out powder to make 10% stock. Wear gloves when pipeting stock solution |
| coplin staining jar | VWR | 47751-792 | Other brands are suitable |
| 5-slide mailer | Electron Microscopy Science | 71549-01 | One of many different brands of small slide holder, suitable for staining |
| Paraformaldehyde | VWR | MK262159 | IMPORTANT: Regular formalin solutions (37% formaldehyde) are NOT suitable. Either 1) Dissolve crysatlaline paraformaldehyde in phosphate buffer and store in small aliquots frozen. Or 2) buy electron microscopy grade paraformaldehyde in aliquots. TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water. |
| Glutaraldehyde solution, 25% in water | Sigma | G 5882 | IMPORTANT: purchase electron microscopy grade glutaraldehyde in ampules; TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water. |
| Triton X-100 | VWR | EM-9410 | Other brands are suitable |
| Bovine Serum Albumin | Fisher | ICN820451 | Other brands are suitable |
| Donkey Serum, lyophilized | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | Other brands are suitable |
| Cy3 Donkey anti-Mouse IgG multi-labeling | Jackson Immunoresearch | 715-165-150 | This company is recommended for high quality multi-label (affinity depleted) antibodies. Select appropriate dye and antigen (animal used to raise primary antibody). |
| n-propyl gallate | Fisher | ICN10274750 | Other brands are suitable |
| DAPI, 4’,6’-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma | D 9542 | TOXIC. Wear gloves and dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure |
| Whatman #1 15 cm diameter filters | Fisher | 09805G | |
| Coverslip #1 1/2 rectangle 24 x 60 mm | VWR | 48393-252 | #1 1/2 thickness is optically best |
| Microscope slide folder | VWR | 48429-092 | Other brands are suitable |
References
- Harlow, E., Lane, D. Antibodies: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York City, New York. (1988).
- Mello, C., Fire, A.
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- Garriga, G., Desai, C., Horvitz, H. R. Cell interactions control the direction of outgrowth, branching and fasciculation of the HSN axons of Caenorhabditis elegans. Development. 117, 1071-1087 (1993).
- Miller, D. M., Shakes, D. C. Immunofluorescence microscopy. Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism. Epstein, H. F., Shakes, D. C. , Academic Press. San Diego, California. 365-394 (1995).
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- Harlow, E. Using Antibodies: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York City, New York. (1999).
- Ahringer, J. Reverse Genetics. WormBook. , WormBook. (2006).
