Extracción y análisis de cortisol de Derechos Humanos y de mono de pelo

Resumen

El cortisol (CORT) se acumula en el eje del pelo cada vez mayor de los seres humanos y los primates no humanos. Se describen métodos para la extracción y el análisis de CORT cabello con alta precisión y sensibilidad. Medición de pelo CORT está particularmente bien adaptado para la evaluación de estrés crónico durante períodos de semanas a meses.

Resumen

La hormona del estrés cortisol (CORT) se incorpora lentamente en el eje del pelo que crece de los seres humanos, primates no humanos, y otros mamíferos. Hemos desarrollado y validado un método para la extracción y el análisis de CORT pelo de mono rhesus y posteriormente adaptado este método para su uso con el pelo del cuero cabelludo humano. En contraste con CORT "muestras puntuales" obtenidos a partir de plasma o saliva, pelo CORT proporciona una medida integrada de la actividad del sistema hipotálamo-pituitaria-adrenocortical (HPA), y por lo tanto el estrés fisiológico, durante el período de incorporación de la hormona. Dado que el cabello del cuero cabelludo humano crece a una tasa promedio de 1 cm / mes, los niveles de CORT obtenidos a partir de segmentos de cabello varias cm de longitud potencialmente pueden servir como un biomarcador de estrés experimentado durante varios meses.

En nuestro método, cada muestra de cabello se lava primero dos veces en isopropanol para eliminar cualquier Cort de la parte exterior del eje del pelo que se ha depositado por el sudor o el sebo. Después del secado, lala muestra se muele a un polvo fino para romper la matriz de proteína del cabello y aumentar el área de superficie para la extracción. CORT desde el interior del eje del pelo se extrajo en metanol, el metanol se evaporó, y el extracto se reconstituyó en tampón de ensayo. Extraídas Cort, junto con los estándares y controles de calidad, se analiza a continuación, por medio de un inmunoensayo enzimático disponible comercialmente sensible y específica (EIA) del kit. Lectura de la EIA se convierte a CORT pg por mg de peso de pelo en polvo. Este método se ha utilizado en nuestro laboratorio para analizar CORT cabello en los seres humanos, varias especies de monos macacos, monos tití, perros y osos polares. Muchos estudios, tanto de nuestro laboratorio y de otros grupos de investigación han demostrado la amplia aplicabilidad de CORT pelo para evaluar la exposición al estrés crónico en natural, así como la configuración de laboratorio.

Introducción

Medición de CORT en el plasma, la saliva, o de vez en cuando en la orina o las heces se ha utilizado como un índice de estrés fisiológico desde el descubrimiento de Selye de la función del eje HPA en el estrés ^1. Aunque numerosos trabajos se han publicado en relación actividad HPA a situaciones de estrés agudo, el campo se ha visto obstaculizado por la falta de un índice simple y fiable de estrés fisiológico crónica. Este problema surge porque el plasma y saliva tanto rendimiento estima "punto" de la actividad HPA que están sujetos a variación circadiana y puede ser confundida por las perturbaciones ambientales. Muestras urinarias y fecales producen medici....

Protocolo

1. Recogida y almacenamiento

1. Pelo humano
   1. Asegure toda la longitud del cabello a ser muestreada (hasta un lápiz de ancho de diámetro) con una banda de goma o clip. Cortar el pelo tan cerca del cuero cabelludo como sea posible (teniendo cuidado de no cortar la piel) con unas tijeras limpias. Nota: El área de muestreo estándar es el vértice posterior del cráneo.
   2. Algunos investigadores han informado de una disminución en los niveles de CORT cabello humanos con la distancia desde el cuero cabelludo ^6, que puede ser debido al lavado de la exposición repetida al agua y champú ⁷ (aunque ver Manenschijn et al. ^....

Resultados

La figura 1 muestra la copia impresa de un conjunto representativo de muestras de cabello humano (varón adulto y sujetos humanos femeninos) procesado utilizando el método 2 de molienda y extracción. Los programas informáticos se utilizó para generar la salida de datos y para adaptarse a una curva sigmoidal de 4 parámetros a los estándares Cort (Figura 2). Los CV entre pocillos de esta placa variaron desde 0,01 hasta 5,73%, con un promedio de CV intraensayo de 1.34%. El CV inter-ensayo d.......

Discusión

El procedimiento CORT cabello descrito anteriormente es fácil de realizar, es relativamente barata, hace uso de productos químicos fácilmente disponibles, reactivos y suministros, y se necesita un equipo que, con una excepción, es probable que esté presente en un laboratorio de análisis típico. La excepción es un aparato de trituración tal como un molino de bolas o mini-BeadBeater. Tomamos nota de que algunos grupos de investigación pelos en muestras de cabello en fragmentos pequeños de aproximadamente 1 mm de longitud .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Isopropanol de grado HPLC	Fisher	A451
Metanol de grado HPLC	Fisher	A452
Kits de ensayo de cortisol salival	Salimetrics	1-3002	Consulte el prospecto del kit del fabricante para obtener información sobre la sensibilidad y especificidad del ensayo
15 ml Tubos de centrífuga con tapón de rosca de polipropileno	Max Scientific	10-9151
1,5 ml Tubos de microcentrífuga Safe-Lock	Fisher	05-402-25
2,0 ml Tubos de microcentrífuga Safe-Lock	Fisher	05-402-7
2,0 ml XXTuff microviales reforzados	BioSpec	330TX	Uso con mini-beadbeater
Perlas de acero cromado de 3,2 mm	BioSpec	11079132c	Úselo con mini-beadbeater
Tarros de molienda de acero inoxidable de 10 ml	Retsch	02.462.0061	Uso con molino mezclador
Bolas de molienda de acero inoxidable de 12 mm	Retsch	05.368.0037	Uso con molino mezclador
Cartucho de carbón activado Savant Fisher		DTK120R	Uso con trampa química Savant
Rotador para tubos de centrífuga de 15 ml	Fisher	S02135
Rotador para tubos de microcentrífuga	Fisher	NC9854190
Centrífuga de sobremesa para tubos de microcentrífuga	Fisher	13-100-675
MM 200 molino mezclador	Retsch	20.746.0001
Mini-Beadbeater 16	BioSpec	607
Savant DNA Speedvac Fisher		DNA120-115
Savant trampa de vapor refrigerada	Fisher	RVT400-115
Trampa química Savant	Fisher	SCT120	Alternativa a la trampa de vapor refrigerada
Lector
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Pipeta
Balanza

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