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Biology

निष्कर्षण और मानव और बंदर बालों से कोर्टिसोल का विश्लेषण

Published: January 24, 2014 doi: 10.3791/50882
Automatic Translation
1,2, 1,2, 2, 1
1Department of Psychology, University of Massachusetts, Amherst, 2Neuroscience and Behavior Program, University of Massachusetts, Amherst

Summary

कोर्टिसोल (CORT) मानव और nonhuman primates की बढ़ती बाल शाफ्ट में जम जाता है. हम उच्च परिशुद्धता और संवेदनशीलता के साथ बाल CORT निकालने और विश्लेषण करने के लिए विधियों का वर्णन. बाल CORT का मापन विशेष रूप से महीने के लिए सप्ताह की अवधि में पुराने तनाव का आकलन करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है.

Abstract

तनाव हार्मोन कोर्टिसोल (CORT) धीरे धीरे मनुष्यों, nonhuman primates, और अन्य स्तनधारियों की बढ़ती बाल शाफ्ट में शामिल किया है. हम विकसित और पुष्टि रीसस बंदर बालों से CORT निष्कर्षण और विश्लेषण के लिए एक विधि है और बाद में मानव खोपड़ी बालों के साथ प्रयोग के लिए इस विधि का रूपांतरित किया. प्लाज्मा या लार से प्राप्त CORT "बिंदु नमूने" के विपरीत, बाल CORT हार्मोन समावेश की अवधि के दौरान, एक hypothalamic-पीयूषिका adrenocortical (एचपीए) प्रणाली गतिविधि की एकीकृत उपाय, और इस प्रकार शारीरिक तनाव प्रदान करता है. मानव खोपड़ी बाल 1 सेमी / माह की औसत दर से बढ़ता है, बाल क्षेत्रों से प्राप्त CORT स्तरों लंबाई में कई सेमी संभावित महीने की एक संख्या से अधिक का अनुभव तनाव का एक biomarker के रूप में सेवा कर सकते हैं.

हमारे विधि में, एक बाल नमूना पहले पसीना या sebum से जमा किया गया है कि बाल शाफ्ट के बाहर से किसी भी CORT दूर करने के लिए isopropanol में दो बार धोया जाता है. सूखने के बाद,नमूना बाल प्रोटीन मैट्रिक्स को तोड़ने और निकासी के लिए सतह क्षेत्र को बढ़ाने के लिए एक ठीक पाउडर के लिए जमीन है. बाल शाफ्ट के इंटीरियर से CORT मेथनॉल में निकाला जाता है, मेथनॉल सुखाया जाता है, और निकालने परख बफर में पुनर्गठित किया जाता है. निकाले Cort, मानकों और गुणवत्ता नियंत्रण के साथ, तो एक संवेदनशील और विशिष्ट व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंजाइम प्रतिरक्षा (ईआईए) किट के माध्यम से विश्लेषण किया है. ईआईए से readout मिलीग्राम पाउडर हेयर वजन प्रति पीजी CORT में बदल जाती है. इस विधि से मानव में बाल CORT का विश्लेषण करने के लिए हमारी प्रयोगशाला में प्रयोग किया गया है, मकाक बंदरों, marmosets, कुत्तों, और ध्रुवीय भालू की कई प्रजातियों. हमारी प्रयोगशाला से और अन्य अनुसंधान समूहों से दोनों कई अध्ययनों से प्राकृतिक में पुराने तनाव जोखिम का आकलन करने के साथ ही प्रयोगशाला सेटिंग्स के लिए बाल CORT की व्यापक प्रयोज्यता दिखा दिया है.

Introduction

प्लाज्मा, लार, या कभी कभी मूत्र या मल में में CORT का मापन तनाव 1 में एचपीए धुरी की भूमिका की Selye की खोज के बाद से शारीरिक तनाव का एक सूचकांक के रूप में इस्तेमाल किया गया है. कई पत्र तीव्रता से तनावपूर्ण स्थितियों को एचपीए गतिविधि से संबंधित प्रकाशित किया गया है, क्षेत्र पुरानी शारीरिक तनाव का एक सरल और विश्वसनीय सूचकांक के अभाव के कारण बाधा उत्पन्न किया गया. यह समस्या पैदा होती है circadian परिवर्तन के अधीन हैं और पर्यावरण गड़बड़ी से चकित किया जा सकता है कि एचपीए गतिविधि के प्लाज्मा और लार उपज दोनों "बिंदु" का अनुमान है. मूत्र और मल के नमूने कुछ मामलों में एक पूरा दिन तक घंटे की एक संख्या है कि अवधि CORT और / या metabolite उत्सर्जन के माप उपज. हालांकि, इन तरीकों में से कोई भी एचपीए गतिविधि के लिए वास्तव में एक लंबे समय तक सूचकांक और इस एसवाई की जवाबदेही प्रदान करता है, इन matrices के किसी भी समय के साथ CORT स्तर की एक किसी न किसी कम्पोजिट सूचकांक प्रदान कर सकता का उपयोग कर कई नमूने का संग्रहजीर्ण तनाव के लिए स्टेम.

बालों में CORT मापने तनाव साहित्य में इस महत्वपूर्ण जरूरत को भरने के लिए शुरू हो गया है. कई प्रयोगशालाओं द्वारा प्रारंभिक अध्ययन मानव बालों में CORT की उपस्थिति का प्रदर्शन किया लेकिन बाल CORT स्तरों तनाव 2 के एक समारोह के रूप में बदल गया कि जांच नहीं की थी. हमारी प्रयोगशाला में विभिन्न सामाजिक और व्यवहार कारकों द्वारा 3 रीसस बंदर HPA अक्ष के नियमन में कई वर्षों के लिए दिलचस्पी किया गया है, हम रीसस बंदर बाल 4 की निकासी और विश्लेषण के लिए तरीकों की स्थापना और मान्य करने के लिए निकल पड़े. रक्त जनित CORT धीरे धीरे और लगातार बढ़ रही बाल में शामिल किया गया है जो इस तथ्य पर आधारित है, इस नई विधि के उद्देश्य महीने के लिए सप्ताह की अवधि में एचपीए गतिविधि का एक एकीकृत सूचकांक के रूप में बाल व्युत्पन्न CORT के स्तर का उपयोग करने के लिए था.

कई methodological चुनौतियों मौजूद प्रोटोकॉल विकसित करने में सामना करना पड़ा था. सबसे पहले, पिछले अध्ययनों कि थोड़ी मात्रा ओ दिखाया गया थाच पसीना और sebum में उत्सर्जित कर रहे हैं CORT परिसंचारी और इसलिए कोट बाल शाफ्ट 2 के बाहर कर सकता है. इस संभावित उलझाना को खत्म करने के लिए, हम बढ़ रही बाल शाफ्ट के भीतर मौजूद CORT पर एक न्यूनतम प्रभाव रहा, जबकि बाहरी CORT दूर करने के लिए प्रकट होता है कि एक हल्के धोने की प्रक्रिया विकसित की है. इस प्रकार, इस प्रक्रिया (isopropanol साथ यानी दो 3 मिनट washes) के अधीन बंदर बाल कुल बाल CORT सामग्री की लगभग 7-8% खो दिया है, और एक तिहाई धोने नमूना 4 से कम से कम 1% अधिक स्टेरॉयड हटा दिया. उसी प्रक्रिया (अप्रकाशित लालकृष्ण रोसेनबर्ग और जे मेयेर,) के नमूनों से 27% कुल CORT सामग्री की एक औसत हटा के बाद से, मानव बाल में अधिक बाहरी CORT ऐसा प्रतीत होता है. बंदर बालों की तरह, तथापि, एक अतिरिक्त धोने पहले दो washes की तुलना में काफी कम CORT (लगभग 7%) निहित. इसलिए, बंदर और मानव बाल दोनों से परिणाम एक प्रमुख इन्हीं को बनाए रखते हुए सबसे (यदि सभी नहीं) बाह्य CORT हटाया जा सकता है कि विवाद का समर्थनआंतरिक बाल मैट्रिक्स के भीतर CORT की tion. दूसरा, हमारे पायलट अध्ययनों से यह भी पता चला है कि संभवतः बाल शाफ्ट के जटिल प्रोटीन मैट्रिक्स खुला तोड़ने के साथ ही विलायक प्रवेश के लिए उपलब्ध सतह क्षेत्र को बढ़ाने के द्वारा, नमूना से काफी वृद्धि हुई CORT वसूली निकासी के लिए बाल पूर्व पीस. दो अलग पीस तरीकों, फायदे और नुकसान के साथ प्रत्येक विकसित किए गए. एक गेंद मिल का उपयोग करता है जो विधि 1,, बेहतरीन पाउडर उत्पादन का लाभ दिया है. हालांकि, एक गेंद मिल एक अपेक्षाकृत महंगे उपकरण मद और मानक पीस जार और गेंदों के साथ प्रयोग किया जाता है, तो यह एक समय में केवल दो नमूने पीस में सक्षम है. छोटे नमूने भी मानक पीस जार के साथ एक गेंद मिल का उपयोग कर प्रक्रिया को मुश्किल कर रहे हैं. एक beadbeater का उपयोग करता है जो विधि 2, अपने पीस क्षमता में कम प्रभावी है. नतीजतन, औसत CORT वसूली गेंद चक्की (अप्रकाशित डेटा) की तुलना में इस पद्धति का उपयोग करके लगभग 10% कम है. दूसरी ओर, एक beadbeaterकाफी कम खर्चीला एक गेंद मिल से है, 16-24 नमूने एक बार मॉडल के आधार पर जमीन की जा सकती है, और विधि छोटे नमूने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है. क्योंकि ऊपर उल्लेख अंतर वसूली की, यह एक विशेष अध्ययन के भीतर सभी नमूनों के लिए एक ही पीस विधि का उपयोग करने की सलाह दी जाती है.

बालों के नमूने संसाधित किया गया है एक बार, वे मूल रूप से लार CORT को मापने के लिए बनाया गया एक संवेदनशील और विशिष्ट व्यावसायिक ईआईए किट के माध्यम से विश्लेषण किया है निष्कर्षों में मेथनॉल और CORT साथ निकाले जाते हैं. निष्कर्षण और परख प्रक्रियाओं बंदर बाल के नमूने से अर्क के धारावाहिक dilutions बारीकी से प्रामाणिक CORT मानकों से प्राप्त रीडिंग paralleled कि ईआईए रीडिंग झुकेंगे कि प्रदर्शन में हिस्सा द्वारा मान्य किया गया. हम तो (प्लाज्मा और लार CORT के अलावा) बाल CORT नए आवास तिमाहियों 4,5 करने के लिए बंदरों का एक प्रशासकीय अनिवार्य स्थानांतरण की प्रमुख जीवन तनाव के प्रति संवेदनशील था कि पता चला है. presenटी कागज मानव और बंदर बाल के नमूने पर कार्रवाई करने के लिए और इस तरह के नमूनों से CORT निकालने के लिए और विश्लेषण करने के लिए हमारी प्रयोगशाला में नियमित रूप से इस्तेमाल के तरीकों का एक विस्तृत ब्यौरा उपलब्ध कराता है.

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Protocol

1. नमूना संग्रह और संग्रहण

  1. मानव बाल
    1. एक रबर बैंड या क्लिप के साथ (व्यास में एक पेंसिल चौड़ाई तक) जांचा जा बालों की पूरी लंबाई सुरक्षित. संभव के रूप में सिर के करीब कट बाल एक स्वच्छ कैंची के साथ (नहीं निक त्वचा देखभाल करने के लिए). नोट: मानक नमूना क्षेत्र खोपड़ी के पीछे शिखर है.
    2. कुछ जांचकर्ताओं हालांकि देखने Manenschijn एट अल. 8 (पानी और शैम्पू करने के लिए 7 बार प्रदर्शन से वार्शआउट के कारण हो सकता है जो खोपड़ी 6 से दूरी के साथ मानव बाल CORT के स्तर में गिरावट दर्ज की गई और इसके विपरीत परिणाम के लिए थॉमसन एट अल. 9 में है कोई कमानी गिरावट इस संभावित "वार्शआउट प्रभाव" के प्रभाव को कम करने के लिए) मनाया गया, जो हम 1 सेमी / माह 10 की औसत वृद्धि दर संभालने 3 सेमी (, कोई अधिक से अधिक लंबाई के साथ खोपड़ी को समीपस्थ बाल क्षेत्रों इकट्ठा करने की सलाह देते हैं एक 3 सेमी खंड सी होता हैलगभग पिछले 3 महीनों में जमा किया गया है कि ORT). इसे पूरा करने के लिए पहली कट से 3 सेमी को मापने और 3 सेमी नमूना उपज के लिए फिर से कटौती करने के लिए एक शासक का उपयोग करें. नोट: बालों की लंबाई को काट दिया गया है, यह अध्ययन पूर्व नमूना लेने के लिए समय अवधि में CORT बयान के एक पूर्वव्यापी कैलेंडर की स्थापना के लिए अलग 1 सेमी लंबा खंडों में नमूना कटौती शामिल है जब तक कि संरेखण में किस्में रखने के लिए जरूरी नहीं रह जाता 6.
    3. एल्यूमीनियम पन्नी, एक साफ कागज लिफाफा, या नमूना धोने के लिए इस्तेमाल किया प्रकार की एक 15 मिलीलीटर पेंच टोपी polypropylene अपकेंद्रित्र ट्यूब से बना एक थैली में बाल नमूना रखें. CORT बाल 2 में अत्यंत स्थिर है, यदि आवश्यक नमूने परिवेश के तापमान पर रातोंरात भेज दिया, -20 डिग्री सेल्सियस पर अनिश्चित काल के संग्रहीत किया जा सकता है.
    4. बाल संग्रह प्रक्रिया स्वयंसेवकों पर अभ्यास किया जाना चाहिए और अभ्यास के नमूने एक पूर्ण अध्ययन पर तैयार कर पहले तौला जाना चाहिए. नोट: SMA के रूप में बालों के नमूनेयह सबसे कम CORT मानक से नीचे ईआईए रीडिंग प्राप्त करने की संभावना को कम करने के लिए नमूने> 10 मिलीग्राम एकत्र करने के लिए वांछनीय है, हालांकि करूँगा 5-10 मिलीग्राम के रूप में, यहाँ वर्णित तरीकों का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है.
  2. बंदर बाल
    1. एक मानक पशु क्लिपर का उपयोग गर्दन के डब से बाल (100-250 मिलीग्राम) दाढ़ी. संभव के रूप में त्वचा के करीब दाढ़ी त्वचा नहीं निक के लिए सावधान किया जा रहा है और रक्त CORT स्तरों बालों में पाए जाने वाले की तुलना में बहुत अधिक हैं क्योंकि खून बह रहा हो. नोट: यह आम तौर पर बालों का एक अच्छा स्रोत है और आसानी से पूर्व resampling के लिए बाल regrowth के लिए मनाया जा सकता है क्योंकि गर्दन क्षेत्र दिनचर्या नमूना लेने के लिए चुना गया था.
    2. एल्यूमीनियम पन्नी या एक 15 मिलीलीटर पेंच टोपी polypropylene अपकेंद्रित्र ट्यूब से बना एक थैली में बाल नमूना रखें. बंदर बाल के नमूने संग्रहीत और मानव बाल के नमूने लिए ऊपर वर्णित के रूप में एक ही तरीके से भेज दिया जाना चाहिए.
    3. बंदर बाल, मानव खोपड़ी बालों के विपरीत, सेंट तो एक निश्चित अवधि तक की होती है और इस वजह11 से बढ़ ऑप्स, यह CORT बयान के लिए एक कैलेंडर के रूप में त्वचा से दूरी का उपयोग करने के लिए इस मामले में आम तौर पर संभव नहीं है. एक पशु अधिक (आवधिक नियमित स्वास्थ्य परीक्षा के दौरान, उदाहरण के लिए) एक बार से जांचा जा सकता है, हालांकि, यह एक आधारभूत समय बिंदु सेट करें और फिर इच्छित समय अवधि बीत जाने पर एक ही क्षेत्र reshave के लिए एक प्रारंभिक शेविंग प्रदर्शन करने के लिए वांछनीय है. दूसरे नमूने में CORT कि अंतराल पर 5 एचपीए गतिविधि के लिए नमूना है CORT सामग्री की एक सटीक रोपण परमिट जो दाढ़ी बनाने का reshave अंतराल के दौरान जमा किया गया था.

2. नमूना धोने और सुखाने

  1. धुलाई
    1. एक 15 मिलीलीटर पेंच टोपी polypropylene अपकेंद्रित्र ट्यूब में एक बाल नमूना रखें.
    2. एक रोटेटर का उपयोग कर 3 मिनट के लिए दोहराया उलटा द्वारा पीछा प्रत्येक ट्यूब उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) ग्रेड isopropanol के 5 मिलीलीटर जोड़ें.
    3. ग लेने, एक बेकार कंटेनर में isopropanol छाननानमूना के किसी भी खोने के लिए नहीं कर रहे हैं.
    4. दोहराएँ 2.1.2 और 2.1.3 एक बार और कदम.
  2. सुखाने
    1. पूरा isopropanol वाष्पीकरण सुनिश्चित करने के लिए कम से कम 2-3 दिन के लिए बाल सूखा.

3. नमूना पीस और CORT निकालना - बड़े नमूनों के लिए विधि 1

  1. नमूना पीस
    1. स्टेनलेस स्टील के एक एकल 12 मिमी स्टेनलेस स्टील पीस गेंद के साथ जार पीस एक 10 मिलीलीटर में सूखे बालों के 250 मिलीग्राम तक रखें.
    2. एक गेंद मिल का उपयोग कर 25 हर्ट्ज की रफ्तार से 6 मिनट के लिए नमूना पीस.
    3. एक विश्लेषणात्मक संतुलन पर पाउडर बाल के 50 मिलीग्राम तक वजन और फिर बाद CORT निकासी के लिए एक साफ 2.0 मिलीलीटर polypropylene microcentrifuge ट्यूब को हस्तांतरण.
  2. CORT निकासी
    1. पाउडर नमूना युक्त microcentrifuge ट्यूब HPLC ग्रेड मेथनॉल के 1.0 मिलीलीटर जोड़ें.
    2. ट्यूब टोपी और सह के साथ कमरे के तापमान पर 18-24 घंटे के लिए नमूना सेतेएक रोटेटर का उपयोग nstant उलटा.
    3. पीसा हुआ बाल गोली कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 14,000 rpm पर ट्यूबों अपकेंद्रित्र.
    4. पीसा हुआ बाल की गोली परेशान नहीं ख्याल रख रही है, एक साफ 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब पर तैरनेवाला के 0.6 मिलीलीटर स्थानांतरण.

4. नमूना पीस और CORT निकालना - छोटे नमूने के लिए विधि 2

  1. नमूना पीस
    1. मनका पिटाई के लिए प्रबलित एक preweighed 2 एमएल microcentrifuge ट्यूब में बाल के 60 मिलीग्राम तक रखें.
    2. नमूना वजन प्राप्त करने के लिए शीशी Reweigh.
    3. प्रत्येक शीशी को तीन 3.2 मिमी क्रोम इस्पात मोती जोड़ें और फिर एक मनका डिब्बा में कम से कम 2 मिनट के लिए नमूना पीस. दृश्य निरीक्षण नमूना अपर्याप्त चूर्णित है कि पता चलता है, तो 0.5 या 1 मिनट के लिए अतिरिक्त पीस प्रदर्शन करते हैं. नोट: CORT निकासी पीस के रूप में एक ही शीशी में किया जाता है, क्योंकि जमीन बाल का कोई हस्तांतरण इस मामले में की जरूरत है.
    4. CORT निकासी
      1. पाउडर नमूना युक्त microcentrifuge ट्यूब HPLC ग्रेड मेथनॉल के 1.5 मिलीलीटर जोड़ें.
      2. ट्यूब टोपी तथा एक रोटेटर का उपयोग निरंतर उलटा के साथ कमरे के तापमान पर 18-24 घंटे के लिए नमूना सेते हैं.
      3. पीसा हुआ बाल गोली कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 10,000 rpm पर ट्यूबों अपकेंद्रित्र. नोट: क्रोम इस्पात मोती विधि 1 की तुलना में कम centrifugation गति के लिए खातों, निष्कर्षण और centrifugation कदम दौरान बालों के साथ ट्यूब में रहते हैं.
      4. पीसा हुआ बाल की गोली परेशान नहीं ख्याल रख रही है, एक साफ 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब पर तैरनेवाला के 1.0 मिलीलीटर स्थानांतरण.

    5. सॉल्वेंट वाष्पीकरण और नमूना पुनर्गठन

    1. एक निर्वात बाष्पीकरण उपलब्ध नहीं है, तो एक निर्वात बाष्पीकरण या नाइट्रोजन गैस की एक धारा का उपयोग मेथनॉल नीचे सूखी. एक निर्वात बाष्पीकरण प्रयोग किया जाता है, तो मेथनॉल वाष्प भी तरह से फंस जा सकता हैएक ठंड जाल या एक सक्रिय लकड़ी का कोयला कारतूस के साथ सुसज्जित एक रसायन के जाल की.
    2. मेथनॉल के हटाने के बाद, ईआईए परख बफर (परख मंदक) का एक उचित मात्रा में CORT निकालने पुनर्गठित. अपेक्षाकृत उच्च CORT मूल्यों प्रत्याशित रहे हैं, तो 0.4 मिलीलीटर या अधिक की एक बफर मात्रा का उपयोग करें. अपेक्षाकृत कम मूल्यों प्रत्याशित रहे हैं, तो मात्रा संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए 0.2 मिलीलीटर या कम से कम किया जा सकता है. नोट: 0.2 मिलीलीटर नमूने के एक फिर से दौड़ना आवश्यक है मामले में कम से कम दो बार नमूना की डुप्लीकेट aliquots चलाने के लिए पर्याप्त मात्रा है.
    3. तुरंत पुनर्गठन नमूना परख या बाद में विश्लेषण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर यह फ्रीज या तो. नोट: पुनर्गठन नमूना जमे हुए है, तो यह नमूना मात्रा में एक परिवर्तन के बाद से ठंड की अवधि के दौरान उच्च बनाने की क्रिया से बचने के लिए महत्वपूर्ण है अंतिम गणना प्रदर्शन कर रहे हैं जब एक झूठी CORT मूल्य को बढ़ावा मिलेगा.

    6. CORT परख और डेटा रूपांतरण

    1. के लिए बाल अर्क परखCORT एक उच्च संवेदनशीलता एंजाइम प्रतिरक्षा (ईआईए) किट का उपयोग कर. नोट: परीक्षण के नमूने डुप्लिकेट प्रत्येक पुनर्गठन बाल निकालने की aliquots के बजाय लार के नमूने होगा सिवाय इसके कि किट डालने के रूप में निर्दिष्ट CORT ईआईए किट एक वाणिज्यिक लार का उपयोग करते हैं, तो निर्माता की सिफारिशों का पालन करें.
    2. हर परख में उपयोग के लिए एक गुणवत्ता नियंत्रण (क्यूसी) बाल निकालने की तैयारी.
      1. अतिरिक्त बाल के नमूने के एक नंबर ले लीजिए और या तो चरणों 4.1 और 4.2 या चरणों 3.1 और 3.2 के रूप में बड़ा नमूना प्रसंस्करण के लिए उन्हें पूल में के रूप में व्यक्तिगत रूप से उन्हें प्रक्रिया.
      2. विलायक लुप्त हो जाना और कदम 5.1 और 5.2 में के रूप में अर्क पुनर्गठित, तो कई व्यक्ति या जमा के नमूनों से पुनर्गठन अर्क पूल.
      3. व्यक्तिगत microcentrifuge ट्यूबों में जमा पुनर्गठन निकालने (जैसे 0.10 मिलीग्राम) की एक उचित मात्रा विभाज्य और बाद में उपयोग के लिए रोक.
      4. पिघलना और एक refe प्रदान करने के लिए प्रत्येक immunoassay microplate पर दो प्रतियों में से एक नायब विभाज्य चलानेप्रत्येक रन की गुणवत्ता की जाँच के लिए CORT मूल्य RENCE.
      5. भिन्नता (सीवी; नमूना मूल्यों का एक सेट का मतलब द्वारा विभाजित मानक विचलन के रूप में परिभाषित) की एक अंतर परख गुणांक एक अंतर - परख सीवी गणना की जा सकती है, जबकि एक ही समय में 10-12 ई.पू. कुओं का विश्लेषण करके गणना की जा सकती रन का एक समूह भर में क्यूसी मूल्यों का उपयोग कर. एक के microplate रीडर सॉफ्टवेयर एक बाल निकालने का प्रतिनिधित्व डुप्लिकेट कुओं के लिए एक CV गणना करता है, तो अंतर परख सीवी का निर्धारण करने के लिए एक वैकल्पिक विधि पूरी थाली भर में उन व्यक्तिगत CV मूल्यों का मतलब गणना करने के लिए है.
      6. किसी भी नमूने निकालने ईआईए में उच्चतम CORT मानक से एक को पढ़ने के लिए अधिक से अधिक पैदावार, तो निकालने का एक और विभाज्य परख बफर का एक उचित मात्रा के साथ पतला है और बाद में ईआईए पढ़ने कमजोर पड़ने कारक के लिए सही है. डुप्लिकेट कुओं के लिए CV> 10% है अगर नमूने भी नियमित reanalyzed रहे हैं.
      7. CORT ईआईए किट CORT VA मापने के लिए तैयार कर रहे हैं क्योंकिलूस ऐसे लार या प्लाज्मा के रूप में तरल नमूनों में, microplate रीडर सॉफ्टवेयर का उत्पादन पाउडर बाल की प्रति इकाई वजन CORT की राशि के लिए परिवर्तित किया जाना चाहिए. निम्न सूत्र मिलीग्राम बाल प्रति पीजी CORT को ग्राम / डीएल में परख उत्पादन धर्मान्तरित:
        (ए / बी) * (सी / डी) * ई * 10,000 = एफ
        जहां परख उत्पादन में से एक = ग्राम / डीएल, निष्कर्षण के अधीन बाल के बी = वजन (एमजी में), सी = वॉल्यूम. मेथनॉल (एमएल) में पीसा हुआ बाल के लिए जोड़ा, डी = वॉल्यूम. निकालने से बरामद किया और बाद में नीचे सूखे मेथनॉल (माले में), ई = वॉल्यूम. सूखे निकालने के पुनर्गठन के लिए इस्तेमाल किया परख बफर के (माले में), और स्नातकोत्तर / मिलीग्राम में बाल CORT एकाग्रता के एफ = अंतिम मूल्य.

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Representative Results

चित्रा 1 विधि 2 पीस और निकासी का उपयोग संसाधित मानव बाल के नमूने (वयस्क पुरुष और महिला मानव विषयों) के एक प्रतिनिधि के सेट से प्रिंटआउट से पता चलता है. कम्प्यूटर सॉफ्टवेयर डेटा निर्गम उत्पन्न करने के लिए और CORT मानकों करने के लिए एक 4 पैरामीटर sigmoidal वक्र (चित्रा 2) फिट करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. इस थाली से बीच में अच्छी तरह सीवी 0.01-5.73% से 1.34% की एक औसत के भीतर परख CV के साथ बताया गया. अंतर - परख सीवी 4.41% नौ हाल ही में मानव बाल assays से क्यूसी मूल्यों गया था का उपयोग निर्धारित की. (; एसडी मतलब ± = 36.0 ± 110 स्नातकोत्तर / मिलीग्राम मंझला = 10.2 पीजी / मिलीग्राम) इस प्लेट पर विश्लेषण 37 नमूने 3.1-650 पीजी / मिलीग्राम से बाल CORT मूल्यों की एक सीमा झुकेंगे.

विधि 1 nonhuman primates और अन्य बड़े जानवरों से बाल के नमूने पर कार्रवाई करने के लिए हमारी प्रयोगशाला में प्रयोग किया जाता है. (ज्यादातर महिलाओं से) वयस्क रीसस बंदर बाल का एक प्रतिनिधि परख 50.1-102 पीजी / मिलीग्राम से CORT मूल्यों की एक सीमा (मंझला = 75.0 झुकेंगे, एसडी ± मतलब= 75.8 ± 14.0 पीजी / मिलीग्राम). इस परख के लिए औसत अंतर परख सीवी 2.08% थी, और अंतर - परख सीवी 4.63% नौ हाल बंदर बाल assays से क्यूसी मूल्यों गया था का उपयोग निर्धारित की.

चित्रा 1 ए
चित्रा 1. एक प्रतिनिधि मानव बाल CORT परख के लिए सॉफ्टवेयर उत्पादन. इस प्रकार के रूप डुप्लिकेट कुओं हैं: S1-S6 - 0.012 ग्राम / डीएल (S6) से 3.0 ग्राम / डीएल (S1) को लेकर CORT मानकों; विरोधी CORT कि कमी अविशिष्ट बंधन (NSB) कुओं -; - बी 1 S7 0 CORT कुओं एंटीबॉडी (सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से सभी अन्य आयुध डिपो रीडिंग से औसत NSB ऑप्टिकल घनत्व [आयुध डिपो] मूल्य को घटा देती है), सी 1 और सी 2 - निर्माता द्वारा प्रदान उच्च और निम्न CORT Calibrators, T1 - नायब;
टी 2 T38 - परीक्षण के नमूने. सी 1 से T38 के लिए, सरणी के प्रत्येक कक्ष में ऊपरी मूल्य मापा आयुध डिपो valu है अच्छी तरह से संगत है, और इस जोड़ी के बाएं हाथ की सेल में कम मूल्य मतलब आयुध डिपो मूल्य से गणना की ग्राम / डीएल में CORT मूल्य है से ई. नमूने T9 और T31 उच्चतम CORT मानक से ऊपर रीडिंग झुकेंगे ध्यान दें. नतीजतन, दोनों नमूनों बाद परख मंदक में 4 गुना पतला और reanalyzed गया. reanalyzed मूल्यों के कमजोर पड़ने कारक के लिए सुधार के बाद इस्तेमाल किया गया. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2. वही मानव बाल परख के लिए प्रवेश CORT एकाग्रता बनाम आयुध डिपो मूल्यों के मानक वक्र. पैनल में दिखाया आर चुकता मूल्य मानकों करने के लिए वक्र के फिट की गणना की भलाई है./ 50882/50882fig2highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

ऊपर वर्णित बाल CORT प्रक्रिया, प्रदर्शन करने के लिए सरल है अपेक्षाकृत सस्ती है, आसानी से उपलब्ध रसायन, अभिकर्मकों, और आपूर्ति का उपयोग करता है, और एक अपवाद के साथ, एक ठेठ विश्लेषणात्मक प्रयोगशाला में उपस्थित होने की संभावना है कि, उपकरणों की आवश्यकता है. अपवाद एक ऐसी गेंद मिल या मिनी beadbeater के रूप में एक पीस तंत्र है. हम कुछ अनुसंधान समूहों छोटे टुकड़े लंबाई 12 में लगभग 1 मिमी में बाल के नमूने कीमा ध्यान दें कि, लेकिन हम पीस प्रदर्शन के बजाय यदि सभी संभव क़ीमा की सिफारिश हमारी टिप्पणियों पर आधारित है. साहित्य में भी प्रक्रिया भिन्नता के एक अन्य क्षेत्र पिछले CORT निकासी के लिए 13 बाल धोने के लिए, और यदि हां, तो क्या धोने शर्तों का उपयोग करना है या नहीं करना शामिल है. वाशिंग नहीं किया जाता है, तो एक मेथनॉल निकालने सप्ताह या बाल विकास के महीनों में धीरे धीरे शामिल CORT लेकिन हाल ही में भी जमा पर पसीने और / या sebum व्युत्पन्न CORT न केवल शामिल होंगे संभावना है कि जोखिमबाल की सतह. संभवतः मुख्य रूप से सतह संदूषण का प्रतिनिधित्व करने वाली बरकरार बाल का संक्षिप्त isopropanol धोने, और की व्यापक मेथनॉल निकासी द्वारा पहुँचा जा सकता है कि एक और अधिक मजबूती से बाध्य अंश से हटाने योग्य एक शिथिल बाध्य अंश: ध्रुवीय भालू के नमूने पर अध्ययन बालों में दो CORT अंशों के अस्तित्व का समर्थन पीसा हुआ बाल के नमूने 14. एक ही निष्कर्ष दोहराया isopropanol धोने (परिचय देखें) द्वारा बंदर और मानव बाल से निकाला CORT की ह्रासमान मात्रा से खींचा जा सकता है. वॉशिंग किया जाता है, तो दूसरी ओर,, तो विलायक के चुनाव और शर्तों को धोने के परिणामस्वरूप CORT मूल्यों पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकता है. बाल परीक्षण की सोसायटी बाल धोने की प्रक्रिया के दौरान 15 बाल मैट्रिक्स के इंटीरियर से सूजन और संभावित घुला हुआ पदार्थ क्षालन कम करने के लिए एक उपयुक्त विलायक के चयन के लिए दिशा निर्देशों को प्रकाशित किया है. इन सिफारिशों बाल में दवा परीक्षण करने के लिए आवेदन के लिए विकसित किए गए हैं, वे फिर से कर रहे हैंस्टेरॉयड के विश्लेषण के लिए Levant के रूप में अच्छी तरह से.

बालों में CORT मापने के बजाय प्लाज्मा या लार फायदे 2 के एक नंबर प्रदान करता है. सबसे महत्वपूर्ण बात, इस दृष्टिकोण के नमूने एकत्र कर रहे हैं, जब सुबह के समय तक या पूर्व संग्रह करने के लिए संक्षिप्त तनाव जोखिम से uninfluenced है कि महीने के लिए सप्ताह की अवधि में एकीकृत CORT के स्तर की एक biomarker प्रदान करता है. ऐसे रीसस बंदरों या भालू के रूप में कुछ जानवरों की प्रजातियों के नमूने सुरक्षा कारणों के लिए विषय की anesthetization की आवश्यकता हो सकती है, हालांकि बाल संग्रह, noninvasive है. एक और लाभ यह CORT वे समय की एक लंबी अवधि के लिए परिवेश के तापमान पर संग्रहित किया गया है, भले ही ऐतिहासिक या अभिलेखीय नमूनों के विश्लेषण परमिट जो अन्य नमूना, matrices के साथ तुलना में बालों में बहुत ही स्थिर है. अंत में, खोपड़ी से क्रमिक अधिक दूरी पर कटौती मानव बाल क्षेत्रों में CORT स्तरों कभी कभी समय के साथ HPA गतिविधि का एक पूर्वव्यापी कैलेंडर बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया है. ऐसे मामलों में यह विशिष्ट हैदोहराया बाल धोने से उत्पादित पहले उल्लेख "वार्शआउट" प्रभाव के बारे में पता करने के लिए ly महत्वपूर्ण. कुछ अध्ययनों से यह प्रभाव 8,9 को दोहराने में नाकाम रहे हैं, यह उन अध्ययनों में नमूने पूर्व मेथनॉल निकासी को धोया नहीं गया कि ध्यान देने योग्य है. यह महत्वपूर्ण पद्धति अंतर बाल CORT स्तरों खोपड़ी से दूरी के साथ गिरावट क्यों नहीं किया समझाने में सहायता कर सकते हैं.

बाल CORT दृष्टिकोण से कुछ सीमाएं भी उल्लेख किया जाना चाहिए. सबसे पहले, इस दृष्टिकोण एचपीए गतिविधि के circadian rhythmicity में परिवर्तन (कुछ उदास रोगियों में देखा जाता है) या जागृति CORT प्रतिक्रिया का पता नहीं लगा सकते हैं. बाल CORT स्तर भी हार्मोन समावेश की अवधि के दौरान हुई कि अपेक्षाकृत संक्षिप्त तनाव के प्रभाव का पता नहीं लगा सकता है. इसलिए, इस दृष्टिकोण नहीं इस तरह के मापन के लिए एक स्थानापन्न के रूप में, लार और / या प्लाज्मा CORT की माप के रूप में पूरक के बारे में सोचा जाना चाहिए. दूसरा, जबकि बाल CORT का उपयोग करेगासंभावना मनोसामाजिक और पर्यावरण तनाव में रुचि शोधकर्ताओं के लिए विशेष महत्व का हो, यह एचपीए गतिविधि शारीरिक व्यायाम, चयापचय असामान्यताएं, और संक्रामक रोग सहित स्थितियों की एक किस्म के तहत हो सकता है ऊपर उठाया है कि मन में रखने के लिए महत्वपूर्ण है. डेटा मनुष्य और बाल CORT खून 2 से मुख्य रूप से प्राप्त होती है कि परिकल्पना का समर्थन बंदरों दोनों से मौजूद है, जबकि तीसरा, इस परिकल्पना अभी तक साबित नहीं किया गया है. दरअसल, आईटीओ और सहकर्मियों 16 अंग संस्कृति में बनाए रखा microdissected मानव बालों के रोम में एक कार्यात्मक एचपीए की तरह सिस्टम के अस्तित्व का प्रदर्शन किया है. बालों के रोम बाल शाफ्ट में मापा CORT में योगदान के लिए जो डिग्री इस समय अनजान बनी हुई है.

HPA अक्ष गतिविधि की एक नई biomarker के रूप में अपनी स्थापना के बाद से बस कुछ ही वर्षों में, बाल CORT कई प्रजातियों भर में आवेदनों की एक विस्तृत विविधता में इस्तेमाल किया गया है. इन आवेदनों में से कई कई प्रमुख टी के भीतर गिरलंबी अवधि के एचपीए गतिविधि पुराने तनाव, ऐसे कुशिंग रोग के रूप में endocrine विकारों, या इस तरह के सदमे के बाद तनाव विकार 2,17-19 रूप neuropsychiatric विकारों से संबंधित है कैसे निर्धारित करने के उद्देश्य से hemes. अन्य अध्ययनों से व्यवहार स्वभाव, सामान्य विकास, ऐसे मनुष्यों में बचपन के अनुभवों या बंदरों में विभिन्न पालन की स्थिति, जंगली जानवरों की पर्यावरण संरक्षण के रूप में विकास संबंधी कारकों के प्रभाव, और पूर्वव्यापी जांच के संबंध में HPA अक्ष समारोह की जांच करने के लिए बाल CORT का इस्तेमाल किया है ऐतिहासिक या अभिलेखीय नमूनों की. बाल CORT के लिए सम्मान के साथ डेट करने के लिए अध्ययन प्रजाति मनुष्य, nonhuman primates (मकाक, vervet बंदरों, और बबून्स) की कई प्रजातियों, कुत्तों, बिल्लियों, पशु, घोड़े, और भालू की कई प्रजातियों में शामिल हैं. यह पुराने तनाव को शारीरिक प्रतिक्रिया की जांच करने के लिए या अन्य प्रयोगात्मक सवालों का पता करने के लिए कि क्या, लंबी अवधि के एचपीए गतिविधि का आकलन करने के लिए बाल CORT का उपयोग पूर्व के लिए जारी रहेगा संभावना है किपैर फैलाने और प्रजातियों में से एक भी अधिक श्रृंखला के लिए लागू किया जाएगा.

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Disclosures

लेखकों घोषित करने के लिए ब्याज की कोई संघर्ष है.

Acknowledgments

हम इस अध्ययन में विश्लेषण मानव बाल के नमूने उपलब्ध कराने के लिए Kymberlee ओ 'ब्रायन, सेलिया मूर, और एडवर्ड Tronick (मनोविज्ञान विभाग, मैसाचुसेट्स, बोस्टन विश्वविद्यालय) धन्यवाद, और स्टीफन फिनिश और अमांडा DETTMER (तुलनात्मक ethology, NICHD की प्रयोगशाला) के लिए रीसस बंदर बाल के नमूने उपलब्ध कराने. प्रारंभिक विकास और इस विधि का उपयोग जारी रखना आदमी के लिए एनआईएच RR11122 द्वारा समर्थित किया गया है

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HPLC-grade isopropanol Fisher A451
HPLC-grade methanol Fisher A452
Salivary cortisol assay kits Salimetrics 1-3002 See manufacturer's kit insert for information on assay sensitivity and specificity
15 ml Polypropylene screw-cap centrifuge tubes Max Scientific 10-9151
1.5 ml Safe-Lock microcentrifuge tubes Fisher 05-402-25
2.0 ml Safe-Lock microcentrifuge tubes Fisher 05-402-7
2.0 ml XXTuff reinforced microvials BioSpec 330TX Use with mini-beadbeater
3.2 mm chrome-steel beads BioSpec 11079132c Use with mini-beadbeater
10 ml stainless steel grinding jars Retsch 02.462.0061 Use with mixer mill
12 mm stainless steel grinding balls Retsch 05.368.0037 Use with mixer mill
Savant activated carbon cartridge Fisher DTK120R Use with Savant chemical trap
Rotator for 15 ml centrifuge tubes Fisher S02135
Rotator for microcentrifuge tubes Fisher NC9854190
Benchtop centrifuge for microcentrifuge tubes Fisher 13-100-675
MM 200 mixer mill Retsch 20.746.0001
Mini-Beadbeater 16  BioSpec 607
Savant DNA Speedvac Fisher DNA120-115
Savant refrigerated vapor trap Fisher RVT400-115
Savant chemical trap Fisher SCT120 Alternative to refrigerated vapor trap
Microplate reader
Microplate washer
Microplate mixer
Multichannel pipettor
Analytical balance

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References

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बुनियादी प्रोटोकॉल अंक 83 कोर्टिसोल hypothalamic-पीयूषिका adrenocortical अक्ष बाल तनाव मनुष्यों बंदरों
निष्कर्षण और मानव और बंदर बालों से कोर्टिसोल का विश्लेषण
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Meyer, J., Novak, M., Hamel, A.,… More

Meyer, J., Novak, M., Hamel, A., Rosenberg, K. Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair. J. Vis. Exp. (83), e50882, doi:10.3791/50882 (2014).

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