Udvinding og analyse af Cortisol fra menneske og Monkey Hair

Summary

Cortisol (CORT) akkumuleres i voksende hår akslen af ​​mennesker og ikke-menneskelige primater. Vi beskriver fremgangsmåder til ekstraktion og analyse af hår CORT med høj præcision og følsomhed. Måling af hår CORT er særligt velegnet til vurdering af kronisk stress over perioder på uger til måneder.

Abstract

Stresshormonet cortisol (CORT) langsomt indarbejdet i voksende hår akslen af ​​mennesker, ikke-humane primater, og andre pattedyr. Vi udviklet og valideret en metode til CORT ekstraktion og analyser fra rhesusabe hår og derefter tilpasset denne metode til brug med human hovedbund hår. I modsætning til CORT "punktprøver" opnået fra plasma eller spyt, hår CORT giver en integreret måling af hypothalamus-hypofyse-binyrebark-system (HPA)-aktivitet, og dermed fysiologisk stress, i løbet af hormonet inkorporering. Da humant hovedbund hår vokser med en gennemsnitlig hastighed på 1 cm / måned, CORT niveauer opnået fra hår segmenter flere cm i længden potentielt kan tjene som en biomarkør for stress opleves over flere måneder.

I vores fremgangsmåde hver hårprøve først vasket to gange i isopropanol for at fjerne enhver CORT fra kanten af ​​håret, der er blevet deponeret fra sved eller sebum. Efter tørringPrøven formales til et fint pulver til at bryde op hårets proteinmatrix og øge overfladearealet til ekstraktion. CORT fra det indre af håret ekstraheres med methanol, methanolen afdampes, og ekstrakten rekonstitueres i assaypuffer. Ekstraheret CORT sammen med standarder og kvalitetskontrol, analyseres derefter ved hjælp af en følsom og specifik kommercielt tilgængeligt enzymimmunoassay (EIA) kit. Udlæsning fra VVM omdannes til pg CORT per mg pulveriseret hår vægt. Denne metode er blevet anvendt i vores laboratorium til analyse hår CORT i mennesker, flere arter af makakaber, silkeaber, hunde og isbjørne. Mange undersøgelser både fra vores laboratorium og fra andre forskergrupper har vist den brede anvendelighed af hår CORT til vurdering af kronisk stress eksponering i naturlige såvel som laboratorie-indstillinger.

Introduction

Måling af CORT i plasma, spyt eller lejlighedsvis i urin eller afføring er blevet brugt som et indeks for fysiologisk stress siden Selye opdagelse af den rolle, HPA akse i stress ^1. Selvom mange papirer er blevet offentliggjort vedrørende HPA aktivitet akut stressende situationer, har inden været hæmmet af manglen på en enkel og pålidelig indeks af kronisk fysiologisk stress. Dette problem opstår, fordi plasma og spyt både yield "Point" estimater af HPA aktivitet, der er genstand for døgnrytmen variation og kan forstyrret af miljømæssige forstyrrelser. Urinveje og fækale prøver gav målinger af CORT og / eller metabolitudskillelse der spænder et antal timer op til en hel dag i nogle tilfælde. Indsamling af flere prøver ved hjælp af nogen af ​​disse matricer kan give et groft sammensat indeks for CORT niveauer over tid, men ingen af ​​disse tilgange giver en virkelig langsigtet indeks HPA aktivitet og reaktionsevne denne SYstamceller til kroniske stressfaktorer.

Måling CORT i håret er begyndt at udfylde dette vigtige behov i stress litteratur. Indledende undersøgelser af flere laboratorier viste tilstedeværelsen af CORT i menneskehår, men ikke undersøge, om hår CORT niveauer ændres som en funktion af stress ^2. Som vores laboratorium har været interesseret i mange år i reguleringen af rhesusaben HPA aksen ved forskellige sociale og adfærdsmæssige faktorer ^3, vi satte sig for at etablere og validere metoder til ekstraktion og analyse af rhesusabe hår ^4. Baseret på den forudsætning, at CORT blodbårne langsomt og kontinuerligt er indarbejdet i voksende hår, med henblik på denne nye metode var at anvende niveauer af hår afledt CORT som en integreret indeks for HPA aktivitet i perioder på uger til måneder.

Række metodologiske udfordringer opstod i udviklingen af ​​den nuværende protokol. For det første havde de tidligere undersøgelser vist, at små mængder of cirkulerende CORT udskilles i sved og talg, og derfor kunne belægge ydersiden af hårstrået ^2. For at fjerne denne potentielle forvirre, har vi udviklet en mild vask procedure, der synes at fjerne ekstern CORT samtidig have en minimal effekt på CORT til stede inden for det voksende hårstrået. Således abe hår underkastes denne fremgangsmåde (dvs. to 3-minutters vaske med isopropanol) mistede ca 7-8% af den samlede hår CORT indhold, og en tredje vask fjernes mindre end 1% mere steroid fra prøven ^4. Der synes at være mere ekstern CORT i menneskehår, da den samme procedure fjernet i gennemsnit 27% samlede CORT indhold fra prøverne (K. Rosenberg og J. Meyer, upublicerede). Ligesom abe hår imidlertid en yderligere vask indeholdt meget mindre CORT (ca. 7%) end de første to vaske. Derfor resultaterne fra både abe og menneskehår understøtte den påstand, at de fleste (hvis ikke alle) ekstern CORT kan fjernes, samtidig med at en stor brøkdelning af CORT i det indre hår matrix. For det andet, vores pilotundersøgelser viste også, at formaling håret inden ekstraktionen væsentligt forøget CORT opsving fra prøven, formentlig ved at bryde åbne den komplekse proteinholdige matrix af håret samt øge det areal til rådighed for opløsningsmiddel penetration. To forskellige slibe metoder blev udviklet, hver med fordele og ulemper. Metode 1, som anvender en kuglemølle har den fordel, at producere de fineste pulver. Men en kuglemølle er et relativt dyrt udstyr element, og hvis de anvendes med standard formaling krukker og kugler, er det i stand til at slibe kun to prøver ad gangen. Små prøver er også vanskelige at bearbejde ved hjælp af en kuglemølle med standard slibning krukker. Metode 2, som anvender en beadbeater, er mindre effektiv i dens slibning evne. Som et resultat, gennemsnitlig CORT recovery er cirka 10% lavere ved hjælp af denne metode i forhold til kuglemølle (upublicerede data). På den anden side, en beadbeaterer betydeligt billigere end en kuglemølle, kan 16-24 prøver slibes på en gang afhængigt af modellen, og metoden er velegnet til små prøver. På grund af ovennævnte forskellen genvinding, er det tilrådeligt at bruge den samme slibning metode for alle prøver i en særlig undersøgelse.

Når hårprøver er blevet behandlet, er de ekstraheres med methanol og CORT i ekstrakterne analyseres ved hjælp af en følsom og specifik kommerciel EIA-kit oprindeligt designet til at måle spyt CORT. Udtræk og assayprocedurer blev valideret i en del ved at påvise, serielle fortyndinger af uddrag fra abe hårprøver gav VVM aflæsninger, der nøje sidestykke måleresultaterne fra autentiske CORT standarder. Vi derefter viste, at hår CORT (foruden plasma og spyt CORT) var følsomme over for den store liv stressor af en administrativt mandat flytning af aberne til nye boliger kvartaler ^4,5. Den præsentationt papir giver en detaljeret redegørelse for de metoder, der anvendes rutinemæssigt i vores laboratorium til at behandle menneskelige og abe hårprøver og at uddrage og analysere CORT fra sådanne prøver.

Protocol

1.. Prøvetagning og opbevaring Menneskehår Fastgør hele længden af ​​håret der skal udtages prøver (op til en blyant-bredde i diameter) med en elastik eller klip. Klip håret så tæt på hovedbunden som muligt (pas på ikke at nick huden) med en ren saks. Bemærk: Den standard prøveudtagning område er den bageste toppunkt af kraniet. Nogle forskere har rapporteret et fald i menneskehår CORT niveauer med afstanden fra hovedbunden 6, som kan skyldes udvaskning ved gen…

Representative Results

Figur 1 viser udskrift fra et repræsentativt sæt af menneskelige hårprøver (voksen mandlige og kvindelige forsøgspersoner) behandles ved hjælp af metode 2 slibning og udvinding. Computer software blev anvendt til at generere data output og passer til en 4-parameter sigmoidal kurve til Cort standarder (figur 2). De mellem-og cv'er fra denne plade varierede fra 0,01 til 5,73% med en gennemsnitlig intra-assay CV på 1,34%. Den inter-assay CV bestemt ved QC værdier fra ni seneste…

Discussion

Håret CORT ovenfor beskrevne procedure er enkel at udføre, er relativt billigt, gør brug af let tilgængelige kemikalier, reagenser og forsyninger og kræver udstyr, der, med en undtagelse, er tilbøjelige til at være til stede i en typisk analytisk laboratorium. Undtagelsen er en slibning apparat, såsom en kuglemølle eller mini-beadbeater. Vi bemærker, at nogle forskergrupper hakkekød hårprøver i små fragmenter omkring 1 mm i længde ^12, men baseret på vores observationer, vi anbefaler at udføre…

Materials

HPLC-grade isopropanol	Fisher	A451
HPLC-grade methanol	Fisher	A452
Salivary cortisol assay kits	Salimetrics	1-3002	See manufacturer's kit insert for information on assay sensitivity and specificity
15-ml polypropylene screw-cap centrifuge tubes	Max Scientific	10-9151
1.5-ml Safe-Lock microcentrifuge tubes	Fisher	05-402-25
2.0-ml Safe-Lock microcentrifuge tubes	Fisher	05-402-7
2.0-ml XXTuff reinforced microvials	BioSpec	330TX	Use with mini-beadbeater
3.2-mm chrome-steel beads	BioSpec	11079132c	Use with mini-beadbeater
10-ml stainless steel grinding jars	Retsch	02.462.0061	Use with mixer mill
12-mm stainless steel grinding balls	Retsch	05.368.0037	Use with mixer mill
Savant activated carbon cartridge	Fisher	DTK120R	Use with Savant chemical trap
Name of Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Rotator for 15-ml centrifuge tubes	Fisher	S02135
Rotator for microcentrifuge tubes	Fisher	NC9854190
Benchtop centrifuge for microcentrifuge tubes	Fisher	13-100-675
MM 200 mixer mill	Retsch	20.746.0001
Mini-Beadbeater 16	BioSpec	607
Savant DNA Speedvac	Fisher	DNA120-115
Savant refrigerated vapor trap	Fisher	RVT400-115
Savant chemical trap	Fisher	SCT120	Alternative to refrigerated vapor trap
Microplate reader
Microplate washer
Microplate mixer
Multichannel pipetter
Analytical balance