Summary
H7는 고유 한 유전자 마커, Z3276을 대상으로 :의 qPCR 분석은 대장균 O157 검출을 위해 개발되었다. qPCR에는 라이브 셀 검출을위한 프로피 디움 모노 아자 이드 (PMA) 처리와 결합했다. 이 프로토콜은 다수의 샘플을 간단하고 일관성있는 처리를위한 96 - 웰 플레이트 형식으로 수정하고 적용되었습니다
Abstract
독특한 오픈 리딩 프레임 (ORF) Z3276은 E.의 특정 유전자 마커로 확인되었다 대장균 O157 : H7. 의 qPCR 분석은 E.의 탐지를 위해 개발 된 대장균 O157 : ORF Z3276을 대상으로 H7. 이 분석을 통해, 우리는 E.의 DNA의 게놈의 몇 사본 최저를 감지 할 수 있습니다 대장균 O157 : H7. 분석의 민감도 및 특이도는 E. 다수 집중적 검증 시험에 의해 확인되었다 대장균 O157 : H7 균주 (N = 369) 및 비 O157 균주 (N = 112). 또한, 우리는 죽은 세포에서 살아있는 세포를 선택적으로 검출을위한 새로 개발 된 qPCR에 프로토콜 프로피 디움 모노 아자 이드 (PMA) 절차를 결합했다. PMA 처리 죽은 세포에서 DNA의 증폭은 거의 PMA 처리 살아있는 세포에서 DNA의 거의 영향을받지 증폭 대조적으로 억제되었다. 또한, 프로토콜은 샘플의 다수의 간단하고 일관성있는 처리를위한 96 - 웰 플레이트 형식으로 수정되고 적용되어왔다. 티그 방법은 정확한 미생물 식품 안전 및 환경 소스의 역학 모니터링에 영향을 미칠 것으로 예상된다.
Introduction
PCR은 E.의 검출을위한 공통의 기술입니다 대장균 O157 : 식품 및 환경 시료에서 H7. E. 특정 생체 식별 대장균 O157 : H7는 PCR 분석 실험에 성공 검출을위한 핵심 요소 중 하나입니다. 일반적 E.의 검출을 위해 PCR 분석법에 사용되는 생체 대장균 O157 : H7는 시가 독소 (STX 1 STX 2) 1, 2, 3, 4 uidA, eaeA 5,6, rfbE 7 및 플릭 유전자 8,9 있습니다. 이러한 바이오 마커는 식별을위한 가변 효율이 제공 할 수 있지만, 바이오 마커의 대부분은 E.의 검출을위한 고유 한 바이오 마커로 사용될 수 없다 대장균 O157 : H7. 표적 유전자의 차별화 전력이 부족함은 E.의 식별을위한보다 구체적인 강한 바이오 마커 (들)에 대한 호출 대장균 O157 : H7 10.
E. 유전자 또는 가상의 오픈 리딩 프레임 (ORF를)에 대한 다수의 프로브 대장균O157 : H7 (11)가 실험실에서 DNA의 유전자형 마이크로 어레이에서 생명 공학 정보를위한 국립 센터의 GenBank 데이터베이스에서 검색하여 단서에 따라 qPCR의 분석을 위해 설계되었습니다. fimbrial 유전자 11입니다 Z3276 ORF,,의 순서는 qPCR에 분석을 위해 선정되었다. 이어서,의 qPCR 분석은 이러한 프라이머 및 프로브의 농도뿐만 아니라, 어닐링 및 연장의 온도 (데이터는 미도시)와 같은 PCR 매개 변수에 대한 다수의 임상 시험을 통해 개발되었다. 같은 E. 등의 기준 균주에 대한 인센티브의 포괄 성 및 독점 시험 후 대장균 O157 : H7 qPCR에있는 비 O157과 시겔 라 긴장은 ORF Z3276은 E.의 식별을위한 구체적이고 강력한 유전 적 마커로 확인되었다 대장균 O157 : H7. 그 다음 우리는 E.의 식별이 독특한 바이오 마커를 사용하여 새의 qPCR 방법을 개발 대장균 O157 : H7.
E. 검출의 또 다른 도전 대장균 O157 : H7에 오염 fo를ODS와 환경 시료로부터 생균의 정확한 결정이다. 죽은 세포 및 PCR 분석에서 생존 능력을 구별 할 수없는에서 DNA의 확장 된 존재가 검출 살아있는 세포 수를 과대 평가의 결과, 위양성 판독의 원인이 될 수 있습니다. 따라서이 식 인성 병원균 (12)의 정확한 검출 PCR의 사용을 제한합니다. 죽은 세포의 DNA를 차별화하는 새로운 방법은 지난 몇 년 동안 13-15에서 PCR 절차와 프로피 디움 모노 아자 이드 (PMA) 처리를 조합하여 촬영되었다. PMA는 죽은 세포 안으로 들어가, 및 빛에 노출 될 때 DNA에 층간 삽입 할 수 있지만, 생균의 DNA와 반응 생균의 내부에 맞지 않을 수있다. 따라서, 라이브 및 사균의 PMA 처리 된 혼합물에서, 죽은 세포의 DNA는 PCR (13)에서 증폭 할 수 없다. 우리는 선택적으로 라이브 E.을 감지하는 새로 개발의 qPCR 분석과 PMA 치료를 결합 대장균 O157 : H7 세포. 또한, 우리는 PMA-의 qPCR을 만들었습니다높은 처리량 감지 할 수 ssay.
Protocol
1. 균주와 DNA 템플릿 준비
- E.의 균주를 성장 대장균 O157 : H7, 비 O157, 밤새 진탕과 같은 37 ° C에서 살모넬라와 쉬 겔라, 다른 병원성 종.
- 해당 키트 (재료의 표 참조)을 사용하여 제조 업체의 지침에 따라 세균성 문화에서 DNA를 추출합니다.
- 분광 광도계를 이용하여 DNA 농도를 결정하기 위하여 광학 밀도 (OD 260)를 측정한다.
2. 프라이머의 qPCR 분석을위한 조사 설계
- 대장균 O157 : H7 서열은 GenBank 등록 번호 AE00517411에서이다. 디자인 프라이머 및 (세부 사항에 대한 자료 표 참조) 실시간 PCR을위한 프라이머 및 프로브 디자인에 적합한 소프트웨어를 사용하여 프로브.
프라이머 및 프로브의 순서는 다음과 같다 : Z3276 포워드 (F) 5'-TATTCCGCGATGCTTGTTTTT-3 '
Z3276 - 후진 (R) 5'-ATTATCTCACCAGCAAACTGGCGG-3 '
Z3276 - 프로브, FAM-CCGCAATCTTTCC-MGBNFQ - 프라이머 작업 용액으로서 10 μM의 농도의 결과, 물과 프라이머 분말 재구성.
- 프로브 작업 솔루션과 같은 10 μM에 프로브를 희석. 레이블이 프로브는 배치와 힘에 따라 다릅니다. 따라서, 최적의 qPCR의 성능을 사용하기 전에 레이블이 프로브의 각 배치를 적정한다.
3. qPCR에 분석 조건을 설정
- 배 실시간 PCR 마스터 믹스의 25.0 μL, 앞으로 프라이머의 200 nm의 역 프라이머의 200 nm의 프로브 100 ㎚의 구성, 반응 혼합물을 준비합니다.
- 50 μL의 최종 볼륨에 도달하기 위해 5 샘플 DNA (100 PG) ㎕의 물과 적절한 볼륨을 추가합니다.
- 비 템플릿 기반 컨트롤을 위해 DNA 샘플을 대체하는 물 5 μl를 사용합니다.
- , 10 변성 초 60 & 95 ° C의 40주기 다음 95 ° C를의 TaqMan의 활성화에 10 분 동안 다음과 같이 qPCR에 조건을 설정# 176; C 어닐링 / 확장을위한 1 분.
4. qPCR에 감도 테스트
- (; 도금 약 1.5 × 108 CFU / ㎖ OD 600 = 0.5) 중간 지수 단계의 문화에서 직렬 10 배 희석을합니다.
- 세중 96 - 웰 플레이트에 세포 희석액 100 ㎖를 추가합니다.
- 10 분 동안 2,500 XG에서 접시를 원심 분리기.
- 물론 각각의 DNA 추출 용액 50 ㎖를 추가합니다.
- 멀티 채널 피펫을 Resuspend 세포 펠렛.
- 10 분 동안 물을 욕조에 판을 끓여 필름 플레이트를 밀봉하고, 2 분 동안 2,500 XG에 원심 분리기.
5. PMA 처리를 위해 살고 죽은 세포의 혼합물을 준비
- E. 10 ㎖를 성장 대장균 O157 : 중간 지수 단계로 37 ° C에서 H7과 두 분주로 문화를 나눕니다.
- 죽은 세포의 물을 욕조에 10 분 동안 세포 중 하나가 나누어지는 삶아 및 살아있는 세포에 대한 다른 나누어지는 둡니다.
- 확인다시 LB 아가 플레이트상의 세포를 도금에 의한 열 살해 분취로부터 생균 없다.
- 라이브 및 열 살해 세포의 2 mL를 취하여 8로 농도를 조절 × 106 CFU / LB 배지와 ML. 8 × 10 0 ~ 8 × 106 CFU / ㎖에 이르기까지 세포 희석 4 세트 만듭니다.
- PMA 또는 미처리로 처리 생균 대한 세포 희석액의 처음 두 세트를 사용한다.
- 라이브 및 죽은 세포 혼합물을 만들기 위해 - 세포 희석의 세 번째와 네 번째 세트에 각 셀의 희석 (8 × 10 6 8 × 10 0)에 8 × 10 6 죽은 세포를 추가합니다.
- PMA 희석의 세 번째 치료 및 관리에 대한 희석의 네 번째 세트를 사용합니다.
6. PMA와 세포 치료
- 10 mM의 원액과 어둠 속에서 -20 ° C에 저장할 수 있도록 디메틸 설폭 사이드 (또는 물)에 PMA를 녹인다.
- 살아있는 세포, 죽은 세포, 라이브와 죽은 세포의 혼합물의 나누어지는 400 μL세 개의 모세관.
- 50 μM의 최종 농도에 대한 각 셀 나누어지는 10 mM의 PMA의 2.0 ML을 추가합니다.
- 가볍게 몇 번, 3 초마다 흔들리는 어둠 속에서 5 분 동안 주위 온도에서 샘플을 품어.
- 96 - 웰 플레이트에 샘플 100 μl를 추가합니다.
- 광학 필름과 플레이트를 밀봉하고 얼음에 접시를 넣어.
- 20cm 650 W의 할로겐 광원에서 접시를 설정하고 빛의 노출을위한 2 분간 노출.
- 10 분 2,500 XG에서 접시를 원심 분리기 조심스럽게 뜨는을 취소하고 신중하게 흡수 종이에 접시를 배출.
- 로 pipetting에 의해 멀티 채널 Pipetman와 20 번 아래로 DNA 추출 용액 50 μL의를 Resuspend 세포 펠렛.
- 2 분 2,500 XG에 10 수욕 분, 원심 분리 끓여, 필름 플레이트를 밀봉. 접시에 뜨는 PMA 및 qPCR에 대한 준비로 처리 된 세포의 DNA입니다.
- descri로의 qPCR을 수행위의 침대, DNA의 5 μl를 사용하여.
Representative Results
E. 검출 대장균 O157 : ORF Z3276을 사용하여 qPCR에 의해 H7
이 분석의 중요한 요소 중 하나는 qPCR에 사용될 Z3276 프로브의 감도 및 특이성이다. 그것은 E.의 DNA의 게놈의 몇 사본 최저를 감지 할 수 있습니다 대장균 O157 : H7도 1a에 도시 된 바와 같이. 6 개 주요 비 O157 STEC 균주, O104 등의 조사 (120) 비 O157 균주의 표 1과 같이 H4 변종, 살모넬라, 시겔과 긴장, 더 교차 반응은 발견되지 않았다.
qPCR에 함께 PMA 처리의 조합
보육 E. 대장균 O157은 : 5 어둠 속에서 최소 2 분 동안 빛에 노출 PMA (50 ㎜)과 H7 세포는 PMA 처리 조건으로 선택했다. 또한, 우리는 PMA 처리 절차를 수정했습니다. 가교 공정에서 사용되는 다양한 투명한 모세관과 비교하여, 96 - 웰 플레이트에 더 효율적인 것으로 밝혀졌다최적의 가교 효과 및 노광 공정 동안 샘플 튜브의 다수 취급하는 것보다 편리 이른다.
qPCR에있는 PMA 처리 라이브와 죽은 세포에서 DNA의 증폭
이것의 qPCR 분석에 죽은 세포로부터의 DNA 증폭의 PMA-매개 억제의 효과는 두 개의 직렬 10 배량 라이브 또는 사균 희석 유래 DNA를 사용하여도 1에 나타내었다. 결과는 PMA (적색 곡선)와 및 PMA (파란색 곡선)없이 처리 살아있는 세포에서 생성 된 곡선이 선형과 서로 거의 동일한 것을 보았다. 약간의 CT 값의 차이는 PMA 처리가 qPCR에있는 살아있는 세포의 DNA의 증폭에 거의 영향을 미치지 것을 제안, PMA와 및 PMA (그림 1A)없이 처리 살아있는 세포 사이에 나타내었다. 그러나 15 - CT 값의 차이 (32,000 배)가 PMA를 처리 한 죽은 세포 사이 PMA, 데모없이 표시했다PMA 처리가 효율적으로 죽은 세포 (그림 1B)에서 DNA 증폭을 억제하는 것이 nstrating.
qPCR에에 살고 죽은 세포의 혼합물에서 살아있는 세포의 검출
라이브 셀 희석 (8 × 10 0 - 8의 X 10 6 CFU)의 두 가지가 라이브 / 죽은 세포 혼합물로부터 살아있는 세포를 감지하는 PMA 또는 PMA없이 처리 하였다. qPCR의 결과 (그림 2A)는 처리되지 않은 샘플 (파란색 막대)로 처리 살아있는 세포 (보라색 막대)의 숫자에 관련된으로 CT 값의 병렬 역 진보적 인 경향을 보여 주었다. 처리 된 생균은 미처리 생균보다 다소 높은 CT 값을 수득 하였다. CT 값에서 유사 역 누진 경향은도 2b에뿐만 PMA (녹색 막대)로 처리 라이브 / 죽은 세포 혼합물에서 생균의 실수로 관찰되었다. 또한, CT 값이 하향 추세였다106 사균의 존재에도 불구하고 이들의 혼합물에서 생균 수가 관찰. 이러한 결과는 죽은 세포로부터 DNA 증폭을 효율적 PMA 처리에 의해 억제되었다 반면 라이브 / 죽은 세포 혼합물의 CT 값이 단독 생균로부터 DNA를 나타내는 것으로 나타났다. 하지만, PMA로 처리 라이브 / 죽은 세포 혼합물의 CT 값은 변동 그림 2B (노란색 막대)의 혼합물에서 라이브 세포 수를 반영하는 데 실패했다.
그림 1. 살고 죽은 세포가 PMA 또는 qPCR의 분석에서 PMA없이 처리. (A)의 시리얼 라이브 E. 10 배 희석 대장균 O157 : H7 셀 희석 (8 × 10 0 - 8의 X 10 6 CFU)가 PMA 또는 PMA없이 처리 하였다.CT 값의 qPCR 분석에서 세벌의 평균 CT 값을 나타낸다. (B) Q 비교의 qPCR 분석에서 PMA와 함께 PMA없이 처리 된 생균과 사균의 DNA 증폭의 비교. ΔRn는 강도의 변화, 형광를 의미하는 것은. 더 큰 이미지를 볼하려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. . PMA-qPCR에 세포 배양의 10 배 희석 (8 × 10 0 - 8의 X 10 6 CFU)의 4 세트로 라이브 / 죽은 세포의 혼합물에서 살아있는 세포의 분화는 표시로 만들어졌다. 제 2 셀 희석 DNA 추출하기 전 또는 치료 동안 세포 희석액 (A) 첫 번째 세트는 PMA로 처리 하였다.(B) 8 × 106 사균 나타낸 바와 라이브 / 죽은 세포 혼합물의 두 세트를 만들기 위해 세포 희석액의 세 번째와 네 번째 세트로 혼합 하였다. 세포 혼합물의 한 세트는 PMA로 처리하고, 다른 세트는 DNA 추출 전에 PMA없이 처리 하였다. 각 막대는 SD ± 세중 실험의 평균 CT 값을 나타냅니다.
| 유기체 | 혈청 형 | 시험 균주 번호 |
| 대장균 | 2006 시금치 O157 : H7 발생 분리 | 186 |
| 2006 타코 벨 O157 : H7의 분리 | 58 | |
| 2006 타코 존 O157 : H7의 분리 | 11 | |
| 다른 O157에서 DMB 변형 컬렉션 : H7의 발생 | 112 | |
| O104 : H4 | 3 | |
| O26 | 18 | |
| O103 | 13 | |
| O111 | (24) | |
| O121 | 2 | |
| Ø45 | 5 | |
| O145 | 9 | |
| O113 | 2 | |
| O91 | 1 | |
| Ø55 | 9 | |
| 다른 | 19 | |
| 살모넬라 균 | 균 | 1 |
| 뉴 포트 | 2 | |
| 시겔 dysenteriae | 6 | 2 |
| 시겔 라 sonnei | 알 수없는 | 2 |
| 시겔 flexneri | 4 | 1 |
| 시겔 boydii | 1 | 1 |
| 합계 | 481 | |
티수 1. E.의 식별을위한 실시간 PCR 분석에서 유효성 검사에 사용되는 균주 대장균 O157 : H7.
Discussion
연구의 주요 목적은 E.에 ORF Z3276, 고유의 사용을 포함한다 대장균 O157 : H7, qPCR에 분석을위한 유일한 바이오 마커로. 현재, 대부분의 qPCR 분석은 stx1, stx2 및 eaeA 1,2,5,6 또는 uidA 3,4, rfbE 및 플릭 유전자 8,9와 같은 공유 표현형 유전자와 같은 독성 유전자를 대상으로하고 있습니다. 그 유전자가 다른 종 또는뿐만 아니라 변종 (16)의 존재로 때때로, 종이나 변형은 확실히 같은 STX로 천이됨을 STX 2 유전자로, 독성 유전자 (들)에 의해 식별 할 수 없습니다. 표적 유전자에 대한 rfbE 및 플릭을 사용하여, 두 유전자는 완전한 식별 (17)에 사용될 필요가있다. 바이오 마커로 ORF Z3276을 사용하여,이 qPCR의 분석은 민감하고 특정 분석 (표 1)로 입증되었습니다. H7 균주 (N = 3이 분석은 O157 등의 엄격한 포괄 성 및 독점 테스트를 받게되었습니다살모넬라와 쉬 겔라 등 67), 100 개 이상의 비 O157 균주 및 기타 병원성 종. 모든 O157 : H7 시험 균주를 긍정적으로 감지하고, 더 교차 반응은 비 O157 균주 (표 1)에서 찾을 수 없습니다, ORF Z3276은 E.의 검출을위한 독특하고 강력한 바이오 마커임을 표시 대장균 O157 : H7.
이 연구의 목적은 선택적으로 다른 DNA 추출 전에 PMA 처리에 의해 사균의 생균을 검출하는 것이다. PMA는 손상된 막과 죽은 세포로 침투하여 DNA에 결합하고, 따라서 PCR (13) 죽은 세포의 DNA 증폭을 억제 수 있습니다. 우리는 PMA 처리 절차를 수정 및 절차 96 - 웰 플레이트 형식으로 적응시켰다. 빛의 노출의 오른쪽 강도는 최적의 가교 효과를 얻을하는 것이 필수적이다. 이전 모세관이 단계 13 ~ 15에 사용되었습니다. 그러나 별도의 마이크로 튜브는 빛을 전에서 처리하기 어려운하여 노출 단계,이 튜브는 최고의 크로스대로를 얻을 절대적으로 투명하지 않습니다. 96 - 웰 플레이트를 사용하여, 우리는 PMA 처리의 효율성을 향상시켰다. 이러한 변화는 여러 방법으로 분석에 영향을 미칠 수 : 그들은 특히 수많은 샘플, 쉽게 철저하고 균일 한 가교 효과를 얻을 수 있도록, 처리 된 샘플은 가능한 있도록하는 또 다른 하나의 플레이트로부터 이동 될 수있다 다수의 검출 샘플로하고, 그들은 전체 프로세스에 대한 자동화 가능성이 PMA-qPCR의 분석을 제공합니다. 이 PMA-의 qPCR 분석의 한계는 PMA 처리 다소 PCR 분석 비용을 증가시키고 약간 PCR 분석법의 민감도를 감소한다는 것이다.
Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
우리는 자금의 일부를 제공하기 위해 국토 안보부의 미국학과 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AB 7900HT Fast Real-time PCR system | ABI | ||
| 2x Universal master mix | ABI | 4304437 | |
| PrepMan Ultra | ABI | 4318930 | |
| Primer Express | ABI | ||
| Probes | ABI | Top of Form | |
| PMA | Biodium | 40013 | |
| Puregen cell and tissue kit | Qiagene | ||
| DU530 spectrophotometer | Beckman | ||
| Spectrophotometer | NanoDrop Technology | ND-1000 | |
| 650 W Halogen light source | Britek | H8061S | |
| Otptical Adhesive film | ABI | 4311971 | |
| Optical 96-well reaction plate | ABI | 4316813 |
References
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