Summary
Un ensayo qPCR fue desarrollado para la detección de Escherichia coli O157: H7 dirigidas a un marcador genético único, Z3276. El qPCR se combinó con monoazida propidio (PMA) de tratamiento para la detección de células vivas. Este protocolo se ha modificado y adaptado a un formato de placa de 96 pocillos para la manipulación fácil y consistente de numerosas muestras
Abstract
Un marco de lectura abierta única (ORF) Z3276 fue identificado como un marcador genético específico para E. coli O157: H7. Un ensayo qPCR fue desarrollado para la detección de E. coli O157: H7 apuntando ORF Z3276. Con este ensayo, podemos detectar un precio tan bajo como algunas copias del genoma de ADN de E. coli O157: H7. La sensibilidad y especificidad del ensayo fueron confirmados por pruebas de validación intensivas con un gran número de E. coli O157: H7 (n = 369) y cepas no-O157 (n = 112). Además, hemos combinado procedimiento monoazida de propidio (PMA) con el protocolo de qPCR recientemente desarrollado para la detección selectiva de las células vivas de las células muertas. La amplificación de ADN de las células muertas tratadas con PMA fue casi completamente inhibida en contraste, la amplificación casi independiente de ADN a partir de células vivas tratadas con PMA. Además, el protocolo se ha modificado y adaptado a un formato de placa de 96 pocillos para un manejo fácil y consistente de un gran número de muestras. TSe espera que su método para tener un impacto en microbiológico preciso y vigilancia epidemiológica de la seguridad alimentaria y fuente ambiental.
Introduction
La PCR es una técnica común para la detección de E. coli O157: H7 en las muestras de alimentos y ambientales. La identificación de marcadores biológicos específicos para E. coli O157: H7 es uno de los factores clave para la detección de éxito en los ensayos de PCR. Los biomarcadores usados comúnmente en ensayos de PCR para la detección de E. coli O157: H7 incluyen toxinas Shiga (STX 1 y stx 2) 1,2, 3,4 uidA, eaeA 5,6, rfbE 7, y fliC genes 8,9. Estos biomarcadores pueden proporcionar eficiencia variable para la identificación, sin embargo, la mayoría de los biomarcadores no se puede utilizar como un biomarcador único para la detección de E. coli O157: H7. Esta insuficiencia de poder de diferenciación de los genes diana pide biomarcador (s) más específico y más fuerte para la identificación de E. coli O157: H7 10.
Numerosas sondas para los genes o marcos de lectura abiertos (ORFs) hipotéticas en E. coliO157: H7 11 fueron diseñados para ensayo qPCR basado en las pistas de microarrays de genotipado de ADN de nuestro laboratorio y por la búsqueda dentro de la base de datos GenBank del National Center for Biotechnology Information. La secuencia de ORF Z3276, que es un gen fimbrial 11, se seleccionó para ensayo qPCR. Posteriormente, un ensayo de qPCR se desarrolla a través de numerosos ensayos sobre los parámetros de PCR tales como las concentraciones de cebadores y sondas, así como temperaturas de recocido y extensión (datos no presentados). Después de las pruebas de inclusividad de incentivos y en Exclusividad en cepas de referencia, tales como E. coli O157: H7, no O157 y Shigella en la qPCR, la ORF Z3276 fue identificado como un marcador genético específico y fuerte para la identificación de E. coli O157: H7. A continuación se desarrolla un nuevo método de qPCR utilizando este biomarcador único para la identificación de E. coli O157: H7.
Otro reto en la detección de E. coli O157: H7 en la contaminada foods y el medio ambiente es la determinación precisa de las células vivas de las muestras. La presencia prolongada de ADN de las células muertas y la incapacidad de diferenciar la viabilidad en el ensayo de PCR podría causar lecturas de falsos positivos, lo que resulta en una sobreestimación del número de células vivas en la detección. En consecuencia, esto limita el uso de la PCR en la detección precisa de patógenos transmitidos por los alimentos 12. Un nuevo enfoque para diferenciar el ADN de las células muertas se ha tomado mediante la combinación de tratamiento monoazida de propidio (PMA) con el procedimiento de la PCR en los últimos años 13-15. PMA es capaz de ir en el interior de las células muertas, y intercalarse en el ADN cuando se expone a la luz, pero no puede ir dentro de células vivas para reaccionar con el ADN de las células vivas. Por lo tanto, en las mezclas tratadas con PMA de células vivas y muertas, el ADN de las células muertas no puede ser amplificado en la PCR 13. Se combinaron los PMA tratamiento con el ensayo de qPCR de nuevo desarrollo para detectar selectivamente E. vivo coli O157: H7 células. Además, hemos hecho el PMA-qPCR unssay posible para la detección de alto rendimiento.
Protocol
1. Cepas bacterianas y preparación de plantillas de ADN
- Crecer cepas bacterianas de E. coli O157: H7, no-O157, y otras especies de patógenos, tales como Salmonella y Shigella, a 37 ° C durante la noche con agitación.
- Extracto de ADN a partir de cultivos bacterianos utilizando el kit apropiado (véase la tabla de materiales) y siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Medir la densidad óptica (DO 260) para determinar las concentraciones de ADN mediante el uso de un espectrofotómetro.
2. Primer y Sonda de diseño para el ensayo de qPCR
- E. coli O157: H7 son secuencias de GenBank número de acceso AE00517411. Cebadores y sondas de diseño utilizando el software apropiado para la imprimación y diseño de la sonda para PCR en tiempo real (véase la tabla de materiales para más detalles).
Las secuencias de cebadores y la sonda son las siguientes: Z3276-hacia adelante (F) 5'-TATTCCGCGATGCTTGTTTTT-3 '
Z3276-Reverse (R) 5'-ATTATCTCACCAGCAAACTGGCGG-3 '
Z3276-Probe, FAM-CCGCAATCTTTCC-MGBNFQ - Reconstituir el polvo de imprimación con agua, resultando en una concentración de 10 mM como una solución de trabajo de imprimación.
- Diluir las sondas a 10 mM como soluciones de trabajo de la sonda. Las sondas marcadas que varían en potencia con lotes. Por lo tanto, se valora cada lote de sondas marcadas antes de usar para un rendimiento óptimo qPCR.
3. Ajuste de las Condiciones de ensayo qPCR
- Preparar la mezcla de reacción, que consiste en 25,0 l de tiempo real mezcla maestra de PCR 2x, 200 nM de cebador directo, 200 nM de cebador inverso, y 100 nM de la sonda.
- Añadir 5 l de ADN de la muestra (100 pg) y un volumen apropiado de agua para alcanzar un volumen final de 50 l.
- Para el control sin plantilla, utilice 5 l de agua para reemplazar la muestra de ADN.
- Establecer las condiciones de qPCR de la siguiente manera: 95 ° C durante 10 min para la activación de TaqMan; seguido por 40 ciclos de 95 ° C durante 10 seg para la desnaturalización y 60 y# 176; C durante 1 min para reasociación / extensión.
4. qPCR prueba de sensibilidad
- Hacer una dilución de 10 veces en serie de una cultura de mediados de la fase exponencial (OD 600 = 0,5; aproximadamente 1,5 x 10 8 UFC / ml en placas).
- Añadir 100 ml de diluciones de células en una placa de 96 pocillos por triplicado.
- Centrifugar la placa a 2.500 xg durante 10 min.
- Añadir 50 ml de solución de extracción de ADN a cada pocillo.
- Resuspender los sedimentos celulares con una pipeta multicanal.
- Sellar la placa con una película, hervir la placa en un baño de agua durante 10 minutos y centrifugar a 2500 xg durante 2 min.
5. Preparación de mezclas de células vivas y muertas para PMA Tratamiento
- Crece 10 ml de E. coli O157: H7 a 37 ° C a mediados de la fase exponencial y dividir la cultura en dos alícuotas.
- Hervir una alícuota de células durante 10 min en un baño de agua para las células muertas y dejar la otra alícuota de células vivas.
- Verifique lare hay células vivas de la alícuota de muertos por calor de placas las células en placas de agar LB.
- Tome 2 ml de las células vivas y muertas por calor y ajustar la concentración de 8 x 10 6 UFC / ml con medio LB. Crear cuatro conjuntos de diluciones de células que van desde 8 x 10 0 a 8 x 10 6 UFC / ml.
- Utilice los dos primeros conjuntos de diluciones de células para las células vivas tratadas con PMA o sin tratar.
- Para la tercera y cuarta series de diluciones de células, añadir 8 x 10 6 células muertas para cada dilución de células (8 x 10 0-8 x 10 6) para hacer mezclas de células vivas y muertas.
- Tratar el tercer juego de la dilución con PMA y utilizar el cuarto juego de la dilución para el control.
6. El tratamiento de las células con PMA
- Disolver la PMA en sulfóxido de dimetilo (o agua) para hacer 10 mM de solución stock y se almacenaron a -20 ° C en la oscuridad.
- Alícuota de 400 l de las células vivas, células muertas, y mezcla de células vivas y muertas entres microtubos separadas.
- Añadir 2,0 ml de PMA 10 mM a cada alícuota de células a una concentración final de 50 mM.
- Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 5 minutos en la oscuridad, agitando suavemente unas cuantas veces, 3 segundos cada vez.
- Añadir 100 l de muestras en una placa de 96 pocillos.
- Sellar la placa con una película óptica y poner la placa en el hielo.
- Coloque la placa de 20 cm de un W fuente de luz halógena de 650 y exponer durante 2 minutos para la exposición de luz.
- Centrifugar la placa a 2500 xg durante 10 min, deseche con cuidado el sobrenadante y escurrir con cuidado la placa en un pedazo de papel absorbente.
- Resuspender los sedimentos celulares en 50 l de solución de extracción de ADN por pipeteando arriba y abajo veinte veces con un multi-canal Pipetman.
- Sellar la placa con una película, hervir durante 10 minutos en un baño de agua, y se centrifuga a 2500 × g durante 2 min. El sobrenadante de la placa es el ADN de las células tratadas con PMA y listo para la qPCR.
- Realice qPCR como descricama de arriba, usando 5 l de ADN.
Representative Results
La detección de E. coli O157: H7 por qPCR utilizando ORF Z3276
Uno de los factores clave de este ensayo es la sensibilidad y especificidad de la sonda Z3276 utilizado en la qPCR. Es capaz de detectar tan bajo como algunas copias del genoma de ADN de E. coli O157: H7 como se muestra en la Figura 1A. De las 120 cepas no-O157 examinados, incluyendo los seis principales cepas no-O157 STEC, O104: cepas H4, Salmonella, y las cepas de Shigella, sin reactividad cruzada se encontró, como se muestra en la Tabla 1.
La combinación del tratamiento con PMA con qPCR
Incubando E. coli O157: H7 células con PMA (50 mM) durante 5 minutos en la oscuridad y la exposición a la luz durante 2 min fueron seleccionados para las condiciones de tratamiento de EPM. Además, hemos modificado el procedimiento PMA tratamiento. En comparación con varios microtubos transparentes usados en la etapa de reticulación, una placa de 96 pocillos se encontró que era más eficiente aalcanzar el efecto de entrecruzamiento óptimo y más conveniente que el manejo de un gran número de tubos de muestra durante el proceso de exposición a la luz.
La amplificación de ADN a partir de células vivas y muertas tratadas con PMA en la qPCR
Los efectos de la inhibición mediada por PMA de la amplificación de ADN a partir de células muertas en este ensayo qPCR se muestran en la Figura 1 mediante el uso de ADN derivado a partir de dos en serie de 10 veces diluciones de células vivas o muertas. Los resultados muestran que las curvas generadas a partir de las células vivas tratadas con PMA (curva roja) y sin PMA (curva azul) parecen lineales y casi idénticas entre sí. Ligeras diferencias de valor CT se muestran entre las células vivas tratadas con PMA y sin PMA (Figura 1A), lo que sugiere que PMA tratamiento tuvo poco efecto en la amplificación de ADN de las células vivas en la qPCR. Sin embargo, un 15 - diferencia de valor de CT (32000 veces) se muestra entre las células muertas tratadas con PMA y sin PMA, de demostraciónnstrating que el tratamiento de PMA suprimió eficazmente la amplificación de ADN de las células muertas (Figura 1B).
La detección de células vivas a partir de mezclas de células vivas y muertas en qPCR
Dos conjuntos de diluciones de células vivas (8 x 10 0 - 8 x 10 6 UFC) se trataron con PMA o sin PMA para detectar células vivas a partir de mezclas de células vivas / muertas. Los resultados qPCR (Figura 2A) demostraron una antiparalelo tendencia progresiva de los valores de TC en relación con el número de células vivas tratadas (barras de color púrpura) a las muestras no tratadas (barras azules). Las células vivas tratadas produjo un CT valores algo más altos que los de las células vivas no tratados. Una tendencia similar progresiva inversa en valores de CT se observó con el número real de células vivas en las mezclas de células vivas / muertas tratadas con PMA (barras verdes), así como en la Figura 2B. Además, esta tendencia a la baja de los valores de TC fueobservado con el número de células vivas en las mezclas a pesar de la presencia de 106 células muertas. Estos resultados mostraron que los valores CT de las mezclas de células vivas / muertas representados el ADN de las células viven solas, mientras que la amplificación de ADN de las células muertas fue suprimida de manera eficiente por el tratamiento con PMA. Pero, los valores CT de mezclas de células vivas / muertas tratadas con PMA se fluctuaron y no lograron refleja el número de células vivas en las mezclas en la Figura 2B (barras amarillas).
Figura 1. Vivir y las células muertas tratadas con PMA o sin PMA en ensayo qPCR. (A) Una serie de 10 veces diluido-E. directo coli O157: H7 diluciones de células (8 x 10 0 - 8 x 10 6 UFC) se trataron con PMA o sin PMA.Los valores de CT representan los Valores promedio computarizadas de los triplicados en el ensayo qPCR. (B) Comparación amplificación ADN células vivas y células muertas tratadas con PMA sin PMA en ensayo qPCR comparación q. ARn refiere a la fluorescencia cambio de intensidad. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
Figura 2. La diferenciación de las células vivas de mezclas de células muertas / en vivo por PMA-qPCR Cuatro conjuntos de diluciones de 10 veces de cultivos de células (8 x 10 0 - 8 x 10 6 UFC). Se realizaron como se indica. (A) El primer conjunto de dilución celular fue tratado con PMA, mientras que la segunda dilución celular fue o no tratada antes de la extracción de ADN.(B) 8 x 10 6 células muertas se mezclaron con los tercero y cuarto conjuntos de diluciones de células para hacer dos conjuntos de mezclas de células vivas / muertas como se indica. Un conjunto de las mezclas de células fue tratada con PMA y el otro conjunto se trató sin PMA antes de la extracción de ADN. Cada barra representa los valores medios de CT de un experimento por triplicado ± SD.
| Organismo | El serotipo | N º de cepas probadas |
| E. coli | 2006 espinaca O157: H7 aislados | 186 |
| 2006 Taco Bell O157: H7 aislados | 58 | |
| 2006 Taco John O157: H7 aislados | 11 | |
| Colecciones de cepas DMB de otros O157: H7 | 112 | |
| O104: H4 | 3 | |
| O26 | 18 | |
| O103 | 13 | |
| O111 | 24 | |
| O121 | 2 | |
| O45 | 5 | |
| O145 | 9 | |
| O113 | 2 | |
| O91 | 1 | |
| O55 | 9 | |
| Otro | 19 | |
| Salmonela | Typhi | 1 |
| Newport | 2 | |
| Dysenteriae Shigella | 6 | 2 |
| Sonnei Shigella | Desconocido | 2 |
| Shigella flexneri | 4 | 1 |
| Boydii Shigella | 1 | 1 |
| Total | 481 | |
Tcapaz 1. Las cepas utilizadas para la validación en el ensayo de PCR en tiempo real para la identificación de E. coli O157: H7.
Discussion
Un objetivo primario del estudio implica el uso de un ORF Z3276, una única a E. coli O157: H7, como un biomarcador único para el ensayo de qPCR. En la actualidad, la mayoría de los ensayos de qPCR se dirigen a los genes de virulencia, como stx1, stx2 y eaeA 1,2,5,6 o genes fenotípicas comunes, como uidA 3,4, rfbE y genes fliC 8,9. De vez en cuando, una especie o cepa pueden no ser definitivamente identificados por el gen (s) de la virulencia, tales como stx 1 y STX 2 genes, como los genes están presentes en diferentes especies o cepas 16, así. Usando rfbE y fliC de genes objetivo, se necesitan los dos genes que se utilizará para la identificación completa 17. Uso de ORF Z3276 como un biomarcador, este ensayo qPCR ha demostrado ser ensayo sensible y específica (Tabla 1). Este ensayo ha sido sometido a la inclusión y la exclusividad pruebas estrictas, incluyendo O157: H7 (n = 367), más de 100 cepas no-O157 y otras especies de patógenos, como Salmonella y Shigella. Todos los O157: H7 Fueron detectadas positivamente, y sin reactividad cruzada se encontró a partir de las cepas no-O157 (Tabla 1), lo que indica que la ORF Z3276 es un biomarcador único y fuerte para la detección de E. coli O157: H7.
El otro objetivo del estudio es detectar de forma selectiva las células vivas de células muertas por tratamiento con PMA antes de la extracción de ADN. PMA puede penetrar en las células muertas con membrana comprometida y unirse al ADN, y por lo tanto inhibe la amplificación de ADN de las células muertas en la PCR 13. Hemos modificado el procedimiento PMA-tratamiento, y adaptado a un formato de placa de 96 pocillos para el procedimiento. La intensidad de la derecha de exposición a la luz es esencial para obtener el efecto óptimo de reticulación. Anteriormente, microtubos se han utilizado en este paso 13-15. Sin embargo, microtubos separadas son difíciles de manejar en la ex luzpaso exposición, y estos tubos no son absolutamente transparente para obtener el mejor gusto cruz. El uso de una placa de 96 pocillos, mejoramos la eficiencia del PMA-tratamiento. Estos cambios pueden afectar el ensayo de varias maneras: hacen que sea más fácil obtener un efecto de la reticulación completa y uniforme, especialmente con numerosas muestras, las muestras tratadas se pueden mover de una placa a otra para hacer posible que la detección de un gran número de las muestras, y que proporcionan este ensayo PMA-qPCR con potencial para la automatización de todo el proceso. La limitación de este ensayo PMA-qPCR es que el tratamiento de PMA aumenta el costo ensayo de PCR algo y reduce ligeramente la sensibilidad del ensayo de PCR.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos al Departamento de Seguridad Nacional de EE.UU. para proporcionar parte de la financiación.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AB 7900HT Fast Real-time PCR system | ABI | ||
| 2x Universal master mix | ABI | 4304437 | |
| PrepMan Ultra | ABI | 4318930 | |
| Primer Express | ABI | ||
| Probes | ABI | Top of Form | |
| PMA | Biodium | 40013 | |
| Puregen cell and tissue kit | Qiagene | ||
| DU530 spectrophotometer | Beckman | ||
| Spectrophotometer | NanoDrop Technology | ND-1000 | |
| 650 W Halogen light source | Britek | H8061S | |
| Otptical Adhesive film | ABI | 4311971 | |
| Optical 96-well reaction plate | ABI | 4316813 |
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