Formación de biomembrana Microarrays con un método basado en la Asamblea Rasero

Resumen

Bicapas lipídicas soportadas y partículas de membrana naturales son sistemas convenientes que pueden aproximarse a las propiedades de las membranas celulares y ser incorporadas en una gran variedad de estrategias de análisis. Aquí se demuestra un método para preparar compuestos de microarrays de soportados de lípidos de la bicapa recubiertos de SiO ₂ perlas, vesículas de fosfolípidos o partículas de membrana naturales.

Resumen

Membranas de bicapa lipídica forman las membranas plasmáticas de las células y definen los límites de orgánulos subcelulares. En la naturaleza, estas membranas son mezclas heterogéneas de muchos tipos de lípidos, contienen proteínas unidas a membrana y están decoradas con hidratos de carbono. En algunos experimentos, es deseable desacoplar las propiedades biofísicas o bioquímicas de la bicapa lipídica de las de la membrana natural. Tales casos requieren el uso de sistemas modelo tales como vesículas gigantes, liposomas o bicapas lipídicas soportadas (SLBS). Las matrices de SLBS son particularmente atractivos para aplicaciones de detección y imitando las interacciones célula-célula. Aquí se describe un nuevo método para la formación de matrices de SLB. Submicron de diámetro SiO ₂ perlas se recubrieron primero con bicapas de lípidos para formar SLBS esféricas (SSLBs). Las perlas se depositan en una matriz de pocillos de micro-fabricada submicrónica de diámetro. La técnica de preparación utiliza un "escobilla de goma" para limpiar la superficie del sustrato, mientras que Leaving detrás SSLBs que se han asentado en los micropocillos. Este método no requiere ninguna modificación química del sustrato de micropocillos, ni ningún ligandos de dirección particulares sobre el SSLB. Los micropocillos están ocupados por perlas individuales debido a que el diámetro del pozo está sintonizado para ser justo más grande que el diámetro de la perla. Por lo general, más del 75% de los pozos están ocupadas, mientras que el resto permanece vacía. En búfer arrays SSLB muestran estabilidad a largo plazo de más de una semana. Múltiples tipos de SSLBs se pueden colocar en una sola matriz por deposición de serie, y las matrices se pueden utilizar para la detección, lo que se demuestra mediante la caracterización de la interacción de la toxina del cólera con el gangliósido GM1. También ponen de manifiesto que las vesículas de fosfolípidos sin los soportes de cuentas y biomembranas de fuentes celulares pueden ser dispuestos con el mismo método y los lípidos de membrana específicos de células se pueden identificar.

Introducción

Membranas de bicapa lipídica son estructuras esenciales en la naturaleza. Membranas plasmáticas celulares y membranas de orgánulos están compuestas de bicapas de lípidos que incorporan una serie de moléculas que son necesarias para la vida. Muchos de los procesos que mantienen la vida ocurren en la superficie de las células o están mediadas por moléculas asociadas con membranas bicapa lipídica. De hecho, muchos productos farmacéuticos procesos diana o moléculas se encuentran sobre o en las membranas de ^1,2. Por lo tanto, es necesario investigar analíticamente procesos, tales como reacciones químicas o acontecimientos de unión no covalentes que se producen ....

Protocolo

1. Microfabricación de micropocillos matriz de sustrato

1. Comience con una oblea de silicio de 4 pulgadas con 100 nm de óxido térmico crecido.
2. Girar SPR-955 0,7 fotorresistente sobre la oblea a 4.000 rpm durante 30 seg.
3. Hornear en un placa caliente a 115 ° C durante 90 seg.
4. La exposicion fotoprotector.
   1. Utilice una máscara que creará 1 m agujeros dispuestos en una matriz hexagonal, con un período de 3 micras, donde la matriz cubre un área de 2 mm x 2 mm.
   2. La exposicion de obleas en un paso a paso i-line utilizando un tamaño de paso de 6 mm y una exposición de 200 mJ / cm ^2.
5. Hornear....

Resultados

Cuando SiO ₂ perlas se mezclan con una solución de vesículas compuestas de fosfolípidos, lípidos fluorescentes y otros lípidos, tales como gangliósidos, las vesículas se rompen en las superficies de las perlas de SiO ₂ para formar SSLBs, como se muestra esquemáticamente en la Figura 1a. Después de lavar las SSLBs, una gota de solución SSLB se coloca en una matriz de micropocillos, y las perlas se dejó sedimentar a la superficie. (Figura 1b1) Esto también se puede h.......

Discusión

En este trabajo se muestra que monodispersas de SiO ₂ perlas recubiertas con bicapas lipídicas soportadas pueden ser dispuestos en matrices de micropocillos sin la necesidad de ligandos en las bicapas lipídicas o la superficie del sustrato, y las matrices se pueden utilizar para la caracterización de interacciones lípido-toxina. La constante de disociación hemos calculado para CTx/GM1 vinculante se compara favorablemente, dada la gran disparidad de los valores en la literatura, con un informe anterior por Win.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Obleas de silicona de 4 pulgadas	University Wafer	425
Shipley MEGAPOSIT SPR955-CM 0.7 fotorresistente	MicroChem	SPR955-CM
Shipley MICROPOSIT CD-26 revelador MicroChem		CD-26
i-line stepper		Canon	2500 i3 Grabador
Vision 320 Grabado de iones reactivos	Advanced Vacuum	Vision 320 RIE
Grabador iónico reactivo de zanja profunda	Plasma Therm	SLR-770
Sistema de deposición de capas atómicas	Cambridge NanoTech	Savannah
Dow Corning Sylgard 184 poly(dimethylsiloxane)	kit Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Fosfatidilcolina de huevo	Avanti Lípidos Polares	840051C
1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(lissamina rodamina B sulfonilo) sal de amonio	Avanti Lípidos polares	810158C
Monosialogangliósido GM1	Avanti Lípidos Polares	860065P
Perlas de sílice	Bangs Laboratories	SS03N/4666	El empaque en el contenedor de cuentas indica que las cuentas tienen 900 nm de diámetro. Sin embargo, después de la dispersión de luz y la microscopía electrónica, determinamos que las perlas tienen aproximadamente 700 nm de diámetro.
Subunidad B de la toxina del cólera, Alexa 488-conjugado	Sondas moleculares	C-34775
Anticuerpo anti-oligodentrocitos IgM O4, NorthernLights 557 conjugado	R& D Systems	NL1326R
FM1-43	Sondas moleculares	T-3136
Centrífuga Eppendorf MiniSpin	Fisher Scientific	05-401-09

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