Formación de biomembrana Microarrays con un método basado en la Asamblea Rasero

Summary

Bicapas lipídicas soportadas y partículas de membrana naturales son sistemas convenientes que pueden aproximarse a las propiedades de las membranas celulares y ser incorporadas en una gran variedad de estrategias de análisis. Aquí se demuestra un método para preparar compuestos de microarrays de soportados de lípidos de la bicapa recubiertos de SiO ₂ perlas, vesículas de fosfolípidos o partículas de membrana naturales.

Abstract

Membranas de bicapa lipídica forman las membranas plasmáticas de las células y definen los límites de orgánulos subcelulares. En la naturaleza, estas membranas son mezclas heterogéneas de muchos tipos de lípidos, contienen proteínas unidas a membrana y están decoradas con hidratos de carbono. En algunos experimentos, es deseable desacoplar las propiedades biofísicas o bioquímicas de la bicapa lipídica de las de la membrana natural. Tales casos requieren el uso de sistemas modelo tales como vesículas gigantes, liposomas o bicapas lipídicas soportadas (SLBS). Las matrices de SLBS son particularmente atractivos para aplicaciones de detección y imitando las interacciones célula-célula. Aquí se describe un nuevo método para la formación de matrices de SLB. Submicron de diámetro SiO ₂ perlas se recubrieron primero con bicapas de lípidos para formar SLBS esféricas (SSLBs). Las perlas se depositan en una matriz de pocillos de micro-fabricada submicrónica de diámetro. La técnica de preparación utiliza un "escobilla de goma" para limpiar la superficie del sustrato, mientras que Leaving detrás SSLBs que se han asentado en los micropocillos. Este método no requiere ninguna modificación química del sustrato de micropocillos, ni ningún ligandos de dirección particulares sobre el SSLB. Los micropocillos están ocupados por perlas individuales debido a que el diámetro del pozo está sintonizado para ser justo más grande que el diámetro de la perla. Por lo general, más del 75% de los pozos están ocupadas, mientras que el resto permanece vacía. En búfer arrays SSLB muestran estabilidad a largo plazo de más de una semana. Múltiples tipos de SSLBs se pueden colocar en una sola matriz por deposición de serie, y las matrices se pueden utilizar para la detección, lo que se demuestra mediante la caracterización de la interacción de la toxina del cólera con el gangliósido GM1. También ponen de manifiesto que las vesículas de fosfolípidos sin los soportes de cuentas y biomembranas de fuentes celulares pueden ser dispuestos con el mismo método y los lípidos de membrana específicos de células se pueden identificar.

Introduction

Membranas de bicapa lipídica son estructuras esenciales en la naturaleza. Membranas plasmáticas celulares y membranas de orgánulos están compuestas de bicapas de lípidos que incorporan una serie de moléculas que son necesarias para la vida. Muchos de los procesos que mantienen la vida ocurren en la superficie de las células o están mediadas por moléculas asociadas con membranas bicapa lipídica. De hecho, muchos productos farmacéuticos procesos diana o moléculas se encuentran sobre o en las membranas de ^1,2. Por lo tanto, es necesario investigar analíticamente procesos, tales como reacciones químicas o acontecimientos de unión no covalentes que se producen en las superficies de membrana. Debido a que las membranas naturales pueden ser difíciles de aislar y / o de la interfaz con sensores, muchos investigadores emplean membranas modelo simplificado para llevar a cabo estudios analíticos. Un número de sistemas de membrana modelo se describen en la literatura, que van desde las vesículas gigantes que pueden ser decenas a cientos de micrómetros de diámetro a liposomas con dimensiones nanométricas ^3,4. Alterntivamente, bicapas lipídicas planas depositados sobre soportes sólidos, es decir, soportadas bicapas de lípidos (SLBS), se pueden formar en un número de diferentes superficies y han sido ampliamente utilizados en aplicaciones biofísicas, bioquímicas, y de análisis ^5. Acoplamiento SLBS con materiales eléctricos u ópticos permite la investigación de la bioquímica y biofísica de la membrana a través de la utilización de diferentes técnicas analíticas. La microscopía de fluorescencia ^6, la electroquímica ^{7, 8} espectroscopia óptica, microscopía de sonda ^9, resonancia de plasmón superficial ^10, y espectrometría de masas ¹¹ han sido empleados para estudiar la estructura y propiedades de SLBS.

Matrices SLB ofrecen versatilidad adicional en el diseño de sensores para ensayos multiplex ^12,13. Otras aplicaciones utilizan arrays SLB para imitar la unión que se forma entre las células inmunes ^14. Métodos de preparación de matrices SLB han variado de microfluidic se acerca ¹⁵ de las que emplean las barreras físicas entre parches SLB adyacentes. ¹⁶ Otros grupos han utilizado métodos de impresión ^{17, 18} patrones fotoquímica y diversos enfoques nanoingeniería ¹⁹ para crear matrices SLB.

En este artículo y el video adjunto se demuestra un método para formar matrices SLB depositando recubiertos-SLB SiO ₂ cuentas en conjuntos ordenados de micropocillos ^20. Nos referimos a los recubiertos de SLB SiO ₂ cuentas como bicapas lipídicas soportadas esféricas (SSLBs). Esta técnica es una extensión del trabajo anterior que crea matrices de vesículas de fosfolípidos y biomembranas derivados de fuentes naturales ^21, de donde también muestran ejemplos de resultados. Otros métodos para formar clusters de partículas de biomembrana o vesículas se han basado en los patrones de ligandos de direccionamiento específicos en las superficies que se asocian con ligandos complementarios contenidos en la superficie de la vesícula. Ejemplos incluyen biotina-asociación avidina ^22,23 y esquemas de hibridación de ADN ^24. Nuestro enfoque sólo requiere una matriz de micropocillos sin restos necesarias de orientación o de reconocimiento. El tamaño de SSLBs se define por el diámetro de los soportes de SiO ₂ de talón, que tienen baja polidispersidad. Al ajustar el diámetro de micropocillos a sólo mayor que el diámetro SSLB, sólo un único SSLB se asienta en cada micropocillo. Un poli (dimetilsiloxano) (PDMS) de rasqueta retira entonces de la superficie de todos los SSLBs que no están inmovilizados en micropocillos. Los micropocillos y matrices SSLB resultantes tienen alta densidad (~ 10 ⁵ SSLBs / mm ²⁾ con 3 micras separación de centro a centro y periodicidad hexagonal. Al depositar en serie SSLBs con diferentes composiciones de lípidos, es posible crear matrices de múltiples componentes con SSLBs posicionado al azar. Para demostrar la capacidad de detección de matrices SSLB, hemos utilizado la interacción de la toxina del cólera (CTx) con un gangliósido (GM1) incorporado en los SSLBs. Conpartículas de membrana naturales, hemos sido capaces de detectar los lípidos específicos de células en matrices de múltiples componentes que contienen material de la membrana a partir de dos tipos de células diferentes.

Protocol

1. Microfabricación de micropocillos matriz de sustrato

1. Comience con una oblea de silicio de 4 pulgadas con 100 nm de óxido térmico crecido.
2. Girar SPR-955 0,7 fotorresistente sobre la oblea a 4.000 rpm durante 30 seg.
3. Hornear en un placa caliente a 115 ° C durante 90 seg.
4. La exposicion fotoprotector.
   1. Utilice una máscara que creará 1 m agujeros dispuestos en una matriz hexagonal, con un período de 3 micras, donde la matriz cubre un área de 2 mm x 2 mm.
   2. La exposicion de obleas en un paso a paso i-line utilizando un tamaño de paso de 6 mm y una exposición de 200 mJ / cm ^2.
5. Hornear en un placa caliente a 115 ° C durante 90 seg.
6. Desarrollar el uso de un desarrollador de centrifugado para depositar 2 charcos de CD-26 sobre la oblea para un tiempo de desarrollo total de 90 seg.
7. Enjuague bien con agua ultrapura DI y seque con N _2.
8. Grabe el óxido en un grabador con iones reactivos durante 6 minutos con 50 sccm de Ar, 25 sccm de CF ₄ y 50 sccm de CHF ₃ floala a una presión de 75 mTorr.
9. Silicio grabado en un ICP-zanja profunda grabador con iones reactivos durante 2 min con 63 sccm de C ₄ F _8, 27 sccm de SF _6, 40 sccm de Ar, y 10 sccm de O ₂ que fluye a una presión de 14 mTorr.
10. Enjuague en acetona, metanol, e isopropanol para eliminar resistir.
11. Colocar en un baño de H ₂ SO ₄ H ₂ O ₂ 01:01 durante 10 minutos para limpiar la superficie.
12. Enjuague bien con agua ultrapura DI y seque con N _2.
13. Deposita 1.080 Å de Al ₂ O ₃ mediante deposición de capa atómica a 250 ° C.

2. Preparación de poli (dimetilsiloxano) escobilla de goma

1. Si es posible, trabajar en una sala limpia. Trabajar de otro modo en el medio ambiente más limpio posible.
2. Obtener un plato de plástico Petri (u otro recipiente desechable limpio) con ≥ lados de 13 mm.
3. En ese plato, verter 5 g de agente de curado PDMS, seguido por 50 g de PDMS basagente de correo (o cualquier cosa con una relación 1:10 que en su mayoría va a llenar el plato de Petri). Mezclar bien con una pipeta de plástico desechable o varilla.
4. Eliminar las burbujas mediante la colocación de los PDMS mixtos en una cámara con una línea de vacío, aplicando vacío hasta que las burbujas salen de la mezcla (aproximadamente 30 min).
5. Si no está ya en la placa de Petri, vierta PDMS en placa de Petri, evitando la creación de burbujas de aire.
6. Curar durante la noche en una placa caliente a> 50 ° C (más alto de calor durante menos tiempo también trabaja).
7. Con la nueva hoja de afeitar / limpio, corte cuidadosamente una pieza rectangular de aproximadamente 2,5 x 2,5 cm, dejando la superficie superior lo más limpio posible. Pelar con unas pinzas limpias. Se quita uno de los bordes (hasta 1,5 cm) presionando hacia abajo en la hoja de afeitar en un solo movimiento, para que el borde superior tan nítidas como sea posible (esto será el borde utilizado en el proceso de la escobilla de goma).
8. Limpiar con acetona, metanol, alcohol isopropílico y agua desionizada ultrapura, y después seque al aire con gas nitrógeno limpio. Almacene en un plato de Petri limpia.

3. Preparación de vesículas

1. Recoger las soluciones madre de lípidos fosfatidilcolina de 25 mg / ml de huevo (PC) y 1 mg / ml de 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N - (lisamina rodamina B sulfonil) sal de amonio (Rho-DPPE) en cloroformo y una solución de 0,5 mg / ml de stock de monosialogangliósido GM1 en cloroformo / metanol (2:1 v / v).
2. En un vial de vidrio pequeño hacer una mezcla que resulta en 97% en moles de PC, 2% en moles GM1 y 1% en moles de Rho-DPPE mediante la adición de 18,9 l de 25 mg / ml de PC, 39,6 l de 0,5 mg / ml GM1 y 7,9 l de 1 mg / ml de Rho-DPPE utilizando jeringas de vidrio.
3. Nota:. El material suplementario para Nair et al ²⁵ contiene una excelente hoja de cálculo Excel personalizable para calcular las cantidades de lípidos necesarios para crear las vesículas de cualquier composición deseada.
4. Colocar el vial en un desecador de vacío y eliminar el disolvente, dejando el vial al vacío durante 6 h.
5. Hacer una solución acuosa de 0,1M NaCl. Añadir 0,5 ml de la solución de NaCl 0,1 M al vial que contiene la película de lípido seca.
6. Dejar que la mezcla acuosa de lípidos para descansar durante la noche.
7. Mezcla, agitar brevemente para crear una suspensión de vesículas, a continuación, se somete a ultrasonidos durante 20 minutos en un sonicador de baño a temperatura ambiente.
8. Extruir la suspensión de vesículas a través de una membrana de policarbonato con 100 nm de tamaño de poro. Pase la suspensión de vesículas a través del filtro de 17x.
9. Guarde las vesículas extruidos en un vial de vidrio a 4 ° C.

4. Formación de rótula compatibles bicapas lipídicas

1. Recoge 700 nm de diámetro _de SiO2 cuentas. Las perlas se suministran en agua destilada con una concentración de reserva de 1,4 x 10 ¹¹ cuentas / ml.
2. En un tubo Eppendorf de 1,5 ml preparar una suspensión de perlas de 1 ml con una concentración de 1,5 x 10 ¹⁰ perlas / ml mediante la adición de 107 l de solución de bolas de stock a 893 l de 0,1 M de NaCl.
3. Agite la suspensión para asegurar que es así mijo.
4. Centrifugar la suspensión a 1.700 xg durante 20 min y después se descartó el sobrenadante. Resuspender las perlas en 1 ml de 0,1 M de NaCl. Repita este paso dos veces más para lavar bien las cuentas.
5. Para formar los SSLBs, en un tubo Eppendorf de 1,5 ml añadir 25 l de la suspensión de perlas de SiO ₂ a 200 l de 1 mg / ml de suspensión de vesículas. Vortex la mezcla y dejar reposar durante 1 hora a temperatura ambiente. En esta etapa la concentración SSLB debe ser 1,7 x 10 ⁹ SSLBs / ml.
6. Se centrifuga a 1700 × g durante 20 min para sedimentar las SSLBs. El sedimento debería aparecer de color rosa debido a la ruptura de las vesículas con la Rho-DPPE sobre las perlas.
7. Desechar el sobrenadante y resuspender en 225 l de tampón fosfato salino (PBS), pH = 7,4. Repita los pasos 4.6 a 4.7 dos veces más para eliminar las vesículas intactas de la suspensión SSLB.

5. Asamblea de SSLB matriz

1. Oblea Cleave de arrays de micropocillos que resulta en piezas rectangulares con 4-6 microwell arrays por pieza.
2. Vortex mezclar la suspensión SSLB, a continuación, colocar 10 l de SSLB suspensión en cada matriz de micropocillos. Lest resto durante 1 hora para permitir SSLBs se depositen en la superficie.
3. Lave suavemente el chip de gama micropocillos con PBS a partir de una botella de lavado, a continuación, sumergirse en un baño de PBS preparado en un plato llano.
4. Mientras sumergida, coloque suavemente la escobilla de goma PDMS ras en el chip de matriz de micropocillos y deslice suavemente por la superficie de 5x para eliminar SSLBs que no están inmovilizados en los pocillos.
5. Agarre el chip de gama micropocillos con pinzas y suavemente agite en el baño de PBS para eliminar cualquier exceso SSLBs.
6. Quite rápidamente el chip del baño de la escobilla de goma y colocar en un baño de PBS fresco hasta su uso posterior. Asegúrese de que la superficie superior del chip se mantiene húmedo para preservar los SSLBs.

Nota: El método de montaje descrito anteriormente se puede utilizar para crear matrices de partículas de membrana naturales, como las partículas de mielina aisladas de cerebro de ratón, o phovesículas spholipid sin los SiO ₂ soportes de talón. Este trabajo se describe en detalle en Wittenberg et al. ²¹ y resultados representativos se muestran abajo.

6. Toxina del Cólera Ensayo de unión

1. Preparar una solución de 2 mg / ml de albúmina de suero bovino (BSA) en PBS.
2. Preparar una solución con la concentración deseada de Alexa 488-conjugado toxina del cólera subunidad B en PBS con 2 mg / ml de BSA.
3. Retire el chip de gama SSLB del baño de PBS y absorber la mayor parte de la solución de PBS usando un laboratorio de limpiar. Deja suficiente PBS en el chip para mantener la matriz SSLB hidratado.
4. Para evitar la unión no específica, añadir 200 l de 2 mg / ml de solución de BSA al chip de matriz SSLB. Deje reposar durante 1 hora en una caja húmeda.
5. Con una micropipeta, retirar 200 l de solución de la parte superior del chip de matriz SSLB.
6. Añadir 200 l de solución de la toxina del cólera en el chip de gama SSLB y dejar reposar durante 1 hora en una caja húmeda.
7. Lave suavemente el chip de gama SSLB con PBS a partir de una botella de lavado para eliminar cualquier toxina del cólera desatado.
8. Wick el exceso de PBS usando un laboratorio de limpiar. Antes de obtener imágenes de chip cubierta con una hoja de 24 mm x 40 mm cubierta.
9. Arrays de imagen con un microscopio vertical utilizando conjuntos de filtros adecuados para los fluoróforos de interés.
10. Analizar la intensidad de fluorescencia de SSLBs individuales de un conjunto con la función de análisis de partículas automatizado de software ImageJ.
11. Compilar intensidades medias de fluorescencia de SSLBs individuales en los histogramas que resumen las intensidades de SSLBs se encuentran en una matriz determinada.

Results

Cuando SiO ₂ perlas se mezclan con una solución de vesículas compuestas de fosfolípidos, lípidos fluorescentes y otros lípidos, tales como gangliósidos, las vesículas se rompen en las superficies de las perlas de SiO ₂ para formar SSLBs, como se muestra esquemáticamente en la Figura 1a. Después de lavar las SSLBs, una gota de solución SSLB se coloca en una matriz de micropocillos, y las perlas se dejó sedimentar a la superficie. (Figura 1b1) Esto también se puede h...

Discussion

En este trabajo se muestra que monodispersas de SiO ₂ perlas recubiertas con bicapas lipídicas soportadas pueden ser dispuestos en matrices de micropocillos sin la necesidad de ligandos en las bicapas lipídicas o la superficie del sustrato, y las matrices se pueden utilizar para la caracterización de interacciones lípido-toxina. La constante de disociación hemos calculado para CTx/GM1 vinculante se compara favorablemente, dada la gran disparidad de los valores en la literatura, con un informe anterior por Win...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Obleas de silicona de 4 pulgadas	University Wafer	425
Shipley MEGAPOSIT SPR955-CM 0.7 fotorresistente	MicroChem	SPR955-CM
Shipley MICROPOSIT CD-26 revelador MicroChem		CD-26
i-line stepper		Canon	2500 i3 Grabador
Vision 320 Grabado de iones reactivos	Advanced Vacuum	Vision 320 RIE
Grabador iónico reactivo de zanja profunda	Plasma Therm	SLR-770
Sistema de deposición de capas atómicas	Cambridge NanoTech	Savannah
Dow Corning Sylgard 184 poly(dimethylsiloxane)	kit Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Fosfatidilcolina de huevo	Avanti Lípidos Polares	840051C
1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(lissamina rodamina B sulfonilo) sal de amonio	Avanti Lípidos polares	810158C
Monosialogangliósido GM1	Avanti Lípidos Polares	860065P
Perlas de sílice	Bangs Laboratories	SS03N/4666	El empaque en el contenedor de cuentas indica que las cuentas tienen 900 nm de diámetro. Sin embargo, después de la dispersión de luz y la microscopía electrónica, determinamos que las perlas tienen aproximadamente 700 nm de diámetro.
Subunidad B de la toxina del cólera, Alexa 488-conjugado	Sondas moleculares	C-34775
Anticuerpo anti-oligodentrocitos IgM O4, NorthernLights 557 conjugado	R& D Systems	NL1326R
FM1-43	Sondas moleculares	T-3136
Centrífuga Eppendorf MiniSpin	Fisher Scientific	05-401-09